用原位曝光法测定淡水珍珠贻贝 Bioindication 的流环境适宜性

Summary

原位bioindications 能够确定环境对濒危贻贝种类的适宜性。我们描述了两种方法基于青少年暴露的淡水珍珠贻贝在网箱贫营养泥炭河生境。这两种方法都是在开放水和交错水环境的变型中实现的。

Abstract

对淡水贻贝生境适宜性的认识是保护濒危物种群体的重要一步。我们描述了一个协议,在贫营养泥炭河流域内进行现场青少年暴露试验, 为期一个月和三月的时间。两种方法 (在两种修改中) 都是为了评估青少年的生长和生存率。方法和修改在价值为地方 bioindication 不同, 并且每个有它的好处并且制约。沙笼法适用于一大组个体, 但只有部分个体被测量, 结果被大量评估。在网格笼法中, 分别对个体进行了单独的保存和测量, 但计算出了低个体数。公开的水接触改性比较容易应用;它显示了青少年的生长潜力, 也可以有效的水毒性试验。在床内暴露的修改需要很高的工作量, 但更接近自然的青少年环境的条件, 它是更好地报告的实际适宜性的地方。另一方面, 由于其高交错的环境变异性, 此修改需要更多的复制。

Introduction

实验生物体的现场暴露和随后对其病情的评估是获取环境质量信息和 (特别是) 物种适宜性的一种可能方法。在动物体内, 这种 bioindication 主要适用于能够生活在有限的有界空间中的小无脊椎动物。双壳贝类的年轻阶段 (双壳类) 是一个这样适当的有机体小组¹。

家庭 Unionidae 的双壳贝类是水生生态系统的一个非常重要的组成部分²。然而, 这些物种往往严重濒危, 特别是在溪流和河流。其中一些被描绘成 "伞种", 其保护与整个溪流群落生境的养护密切相关, 需要采取综合办法³。这些动物的生命周期与许多环境成分有关, 从水化学^4,5到鱼类种群的变化, 作为贻贝幼虫宿主⁶。因为贻贝幼鱼通常代表贻贝生命周期的关键阶段, 所以在这个阶段适合它们发展的地点对于一个地区成功的物种种群发展至关重要。

淡水珍珠贻贝 (FWPM,母母;Unionida, 双壳类) 是一种濒危的双壳贝类, 发生在贫营养泥炭欧洲溪流中。他们的人数在20世纪的整个发生地区急剧下降。在大多数中欧人口中, 目前物种繁殖的下降似乎主要是由于青少年在生命的头几年中生存率极低至零。它假设, 少年 FWPMs 居住在浅交错区⁷年, 其中条件和他们的可变性仍然没有被描述的很好。此外, 直到他们的第二年的生活, 幼仔只有一个维度约1毫米, 所以他们很难找到在大量的泥沙下自然条件⁸。因此, 对圈养幼仔进行实验是研究其生态学的必要条件。

在捷克⁹淡水珍珠贻贝行动计划中, 每年有数以千计的青少年从半自然育种计划中崛起。然而, 有一个问题是, 哪些地方和生境适合这些青少年成功的人口支持, 或最终物种重新引进。在原位bioindications 现在找到答案的方法。

尽管在早先的一些著作中观察到幼贻贝在生物指标¹⁰的适宜性, 但最近的一些研究证实, 在暴露笼中, 幼贻贝的存活率不一致。青少年暴露方法在水质检测中的适用性^11、12、13。此外, 还证明了在解释这些特定研究的结果时需要考虑的几个因素, 例如¹⁴的股票来源和幼虫条件¹⁵的持续影响。

问题在于如何在测试现场安装实验性青少年, 以及如何最有效地评估其状况。首次严格应用的现场曝光方法与青少年 FWPMs 发表了 Buddensiek¹⁶。青少年 FWPM 个体被保存在板笼中, 暴露在溪流的自由流动的水中, 在几个星期的暴露后, 它们的生存和生长被量化。该方法最初是作为一种半人工育种方法开发的, 但同时也强调了其对生境需求和水质评价的适用性。虽然 FWPM 少年的存活率自然非常低, 在一个月/年的规模, 只有很小数量的动物将生存, 生存率可以是一个良好的标志的环境影响的¹⁶周的规模。经过多年的研究, 进一步发展了暴露方法, 以保持实验性的幼贻贝在溪流中栖息, 并评估其生长和成活率;这些包括沙盒¹⁷, 贻贝筒仓基于一个上升的原则¹⁸, 和各种其他接触笼 (由牙龈和同事总结)¹¹。由于青少年自然发生在浅交错区⁷, 实验装置在流底的应用是非常可取的。

在本文中, 我们描述了使用两个曝光装置的 FWPMs: i) 修改 Buddensiek 板笼 ("网笼") 也使 bioindication 测试 hyporheal 条件;和 ii) Hruška 沙盒 ("沙笼")。该议定书描述了这两种方法在开阔水域和交错条件下的应用 (即四种暴露的变体)。这些方法在捷克淡水珍珠贻贝⁹号行动计划中的应用已有15年的时间逐步修改和扩大, 并经过了一系列实验验证。

Protocol

1. 网笼

注: 见图 1。

1. 准备材料
   1. 为实验部分准备材料: 1-2 L 每网笼水, 网笼 (1 主要塑料体, 2 塑料盖, 2 张特殊技术筛子与340µm 毛孔, 4 个螺栓和4坚果每笼), 钳子, 扳手, 巴斯德吸管, 过滤器, 数码相机, 三目照相解剖变焦立体显微镜, 校准网格 (显微镜设备), 5 培养皿50毫米直径, 烧杯, 2 塑料碟 (~ 25 厘米 x 15 厘米 x 3-5 厘米), 和一个塑料盒。
   2. 要执行 hyporheal 安装, 请准备一个橡胶软管和一个100µm 孔网, 和一个喷瓶。有关设备的构造, 请参阅辅助文件 1: S. 1。网笼施工。
2. 组装网笼的底部和中央部分。装配容纳个人的笼子部分。首先插入一个塑料盖子, 然后一张塑料筛子, 最后主体在上面。使用四螺栓来保护它。
3. 制备生物材料
   1. 将网笼放入含河水的塑料盘中。确保会议厅已满一半。采取 FWPM 少年 (参见补充文件 1: S. 6。生物材料) 出热绝缘盒, 并把它们在培养皿。
      注: 确保突然温度变化不超过摄氏2摄氏度。
   2. 使用喷瓶和过滤器, 筛过的青少年, 以清除碎石。
4. 设置显微镜和照相机。对仪器进行校准 (见补充 File1: S. 5.显微镜和 phototechnics)。在显微镜下放置一个含有少许水的培养皿。
5. 把幼仔放进笼子里 (实验室工作)
   1. 使用巴斯德吸管从培养皿中除去一个人, 并小心地将其放在显微镜下的培养皿中。
   2. 检查个人的健身通过看目镜 (~ 40 x 放大)。
      注意: "好" 的健身意味着个体移动, 从一侧到另一侧旋转, 将脚从壳中推出.用巴斯德吸管除去死或低的健身者, 并将它们放在单独的培养皿中 (FWPM 打开贝壳, 不动, 脚不拔出, 碎片壳, 少年谁不控制地漂浮在水中, 一个可见的分解壳, 部分脱钙)。
   3. 拍两张 FWPM 的照片, 用恒定的放大倍数 80 x 来显示良好的身体素质。请参阅补充文件 1: S. 5。显微镜和 phototechnics。保存照片。
      注意: 为了很好的测量它的长度, 必须将幼鱼纵向铺设 (侧面视图)。主要的目标是采取一个高品质的图片的最大壳长度足够好, 使图片分析后。
   4. 拍摄完照片后, 将幼兽插入笼子中适当的房间。记录图片和房间的数量。
   5. 对网笼中所有使用的腔室重复此步骤。
      注: 见补充文件 1: S. 1。网笼施工。
   6. 一旦所有使用的房间都有珍珠贻贝, 把塑料筛子放在笼子上, 然后轻轻地把塑料盖上, 并确保所有部件连同坚果。
   7. 在安装到交错区域的情况下, 通过其中一个管腔并将其固定在该位置, 然后采取防堵塞网格并将其绑定到底部 (参见辅助文件 1: S. 1。网笼施工)。
6. 商店少年
   1. 用河水把笼子放进塑料盒里, 使幼兽完全浸入, 并保存在 thermobox 中。安装前, 让幼仔适应原位河水温度在安装场所 (逐渐冷却, 最大5°c 24 小时)。
7. 安装网格笼
   1. 准备现场材料, 包括与幼鱼, 钢钉, 螺栓和金属螺母, 扳手, 场温度 dataloggers (见材料表和补充文件 1: S. 4.2 的网笼。水测量), 一个字符串, 一个相机, 现场协议, 锤子, 和铁锹。
   2. 将 FWPM 幼鱼运到现场 thermobox (隔热箱), 保持稳定的水温与变化 < 2 °c。将 thermobox 与网笼放进河中, 让幼仔适应当地环境条件 (pH 值、电导率等)。
   3. 安装网格笼。
      1. 从字段 thermobox 中移除网格笼。为它提供两个钢钉和固定的领域数据存储器。将笼子锚定在研究区 FWPMs 典型的条件下 (例如, 在主水流的边缘, 而不是直接水流, 而不是在直水中, 而不是在阳光直射下)。
         1. 对于开阔的水, 使用一对钢钉, 固定笼到河底;把它放在它的侧面和水平与河底, 下游在一个角度的45°到河流流, 向中心的河流。较低水平的边缘应约 10-15 厘米以上的河流底部表面。保持在一个地方的每个笼子之间的最低距离2米 (见补充文件 1: S. 4。网箱保养)。
         2. 对于交错区, 在垂直于水流的竖直景观位置, 将网箱挖入河底, 使笼的上水平边缘平行于河底表面, 而分室位于交错应测试的深度。在实验过程中, 取出底部表面的橡胶软管的上端, 以进行水取样的可能性 (见补充文件 1: S. 4.2。水的测量)。
            注: 建议在网箱上进行定期检查和维护 (参见补充文件 1: S. 4。网箱保养)。
8. 在暴露后卸载笼子并运送幼仔。为此, 把笼子从水中拉出, 清除它们的细泥沙以及漂过的物质, 把它们放进 thermobox 水中的田野里。立即将笼子运送到实验室, 开始死亡率和增长率评估。
   注: 见补充文件 1: S. 3。曝光时间。在笼子和实验室环境之间的温度差超过5摄氏度的情况下, 首先必须让温度相等。
9. 通过检查每个青少年的生活/健康状况 (见步骤1.5.2 和 1.5.3), 并在一个培养皿中使用2张图像, 每只活的少年用一个恒定的放大倍数 80 x 来评估。记录的健身和数字的图片和房间。
10. 完成实验 (所有方法通用)
    1. 在图像分析软件中进行测量。在输入图像 (步骤 1.5.3) 和输出图像 (步骤 1.9) 中, 使用图像分析软件来确定每个被评估的青少年的身体大小。使用两张照片中记录的最大总壳长度作为输入和输出中的体大小值。
    2. 将测量值插入表处理器中, 并计算每个幸存少年的增长增量 (%)。
    3. 利用存活个体数与网笼中所有实验个体的比值, 估计每个网笼的存活率 (%)。
       注: 实验结束后, 将幸存者送回育种计划
       (请参阅补充文件 1: S. 6。生物材料)。

2. 砂笼

注: 见图 2。

1. 准备材料
   1. 为实验的实验室部分准备材料: 2 培养皿 (直径 ~ 8.5 厘米), 巴斯德吸管, 过滤器, 25 L 河水, 塑料盒, 筛子 (网格大小1和2毫米), 一个大塑料盒 (25 L), 一个沙笼 (参见补充文件1: S. 2。沙笼建设), 数码相机, 三目照相解剖变焦立体显微镜, 校准网格 (显微镜设备), 排序河沙从研究区 (见步骤 2.1.3), 和协议。见材料表和补充文件 1: S. 2。沙笼建筑。
   2. 准备隔离过程的材料: 圆形容器 (每笼1加 1)、2培养皿 (直径 ~ 14 厘米)、巴斯德吸管、放大镜和河水 1 L。
   3. 筛河砂通过一个2毫米的筛子, 然后通过一个1毫米的筛子得到一个粒度的 1-2 毫米. 干燥的沙子, 并保存在干燥的形式, 直到需要。
2. 采取少年 (参见补充文件 1: S. 6。生物材料) 出的 thermobox, 并把他们在培养皿。使用喷瓶和过滤器, 筛过的青少年, 以清除碎石。
3. 设置显微镜和照相机 (参见辅助文件 1: S. 5.显微镜和 phototechnics)。
4. 把幼仔放进笼子里 (实验室工作)
   1. 把沙笼放在塑料盒里。分散被排序的沙子 (参见步 2.1.3) 1/3 高度的沙笼。把水倒入盒子里。确保沙子表面在水位以下10毫米。将沙笼插入 25 L 箱水中, 并将其暴露在与少年 FWPMs 相同的温度下 (见补充文件 1: S. 6.2。生物材料的贮存) 12 小时, 避免任何暴露在阳光下的沙子。
   2. 将培养皿与准备好的 FWPM 幼仔一起服用。
   3. 检查个人的健身通过查看目镜 (见步骤 1.5.2)。
   4. 按如下方式执行照片文档。拍一张所有发现的人的照片 (见步骤 1.5.3), 选择10最大的个体。或者, 用低放大倍数 (~ 40 x) 对所有青少年拍照, 进行批量评估, 选择10个最大的个体。保存所有的照片, 并记录他们的数字。
   5. 使用喷瓶, 将 FWPM 的幼兽移入准备好的沙笼中。
5. 商店少年
   1. 把笼子放进有河水的大塑料箱里, 使笼子完全浸入并保存在 thermobox 中。在安装前, 让幼仔适应原位河水温 (逐渐冷却, 最大5°c 24 小时)。
6. 安装沙笼
   1. 准备现场安装材料: 砂笼, a ~ 25 L 场 thermobox, 扁石 (最小重量1公斤), 网 (网格尺寸 10 x 10 毫米), 喷瓶, 场温度 dataloggers (见材料表和补充文件 1:S. 4.2. 水的测量), 一锹, 和现场协议。
   2. 将笼子与幼仔运到现场 thermobox, 保持水温稳定 (2 摄氏度变化)。将田间 thermobox 与沙笼放在田间的河道中, 让 FWPM 少年适应当地环境条件 (pH 值、电导率等)。
   3. 将沙笼安装到生境中, 条件典型为 FWPMs (例如, 在主水流的边缘, 在蜿蜒的水流中, 而不是直接的水流, 而不是在直接的阳光下)。
      1. 对于开阔的水域, 用网将沙笼固定在平坦的石头上, 并将其放在河底。确保笼的较大一侧与流形成一个45°角。
      2. 对于 Hyporheal, 将笼层与水的水流垂直地挖入河底, 使笼盖与河底表面保持水平。
         注: 建议在网箱上进行定期检查和维护 (参见补充文件 1: S. 4。1. 现场检查)。
7. 在暴露后卸载笼子和运送幼仔
   注: 见补充文件 1: S. 3。曝光时间。
   1. 把笼子从水里拉出来, 把它们弄干净, 把它们放进田野里, thermobox 水。
   2. 将笼子运送到实验室, 开始死亡率和增长率评估。
      注: 在笼子和实验室环境之间的温度差超过5摄氏度的情况下, 必须让温度均衡。
8. 从沙子中分离 FWPM 幼仔
   1. 准备一个圆形容器, 水深为50毫米 (分别为每个笼) 和一个额外的圆形容器。把沙子从笼子里转移到圆形容器里。用旋转的运动把打火机的微粒洗净到一个额外的容器里。
   2. 逐步从这个容器中取样, 用巴斯德吸管和放大镜搜索幼仔。使用巴斯德吸管将幼仔放入培养皿中。重复此步骤, 直到找到最后一个少年, 然后在第一个阴性发现之后再10x。每洗一步后, 用沙子将清水添加到原容器中。
      注意: 特别是在第一次洗完后, 适当检查其内容, 并清洁它的压载物, 如细泥沙和其他冲积层。
9. 评估实验
   1. 检查每个青少年的健康状况 (见步骤2.4.3 和 1.5.2) 并计算幸存者人数。
   2. 单独拍一张照片 (见步骤 2.4.4), 虽然这意味着每个个体都没有明确的身份。或者, 拍散照片, 从最终结果中选择10个最好的个体的子集。
      注意: 两种可能性都具有类似的报告值。可能性1有一个更高的工作量的限制, 而且最高的相片放大率的好处并且因而也更高的准确性。
10. 完成实验
    1. 在图像分析软件中执行测量。完成在网格笼中完成的实验 (参见步骤 1.10), 有以下例外: 不评估每个青少年的生长速率 (%), 但在沙笼实验中评估整个群体。
       注: 实验结束后, 幸存者应返回育种计划
       (请参阅补充文件6.1。生物材料的硒经文)。

Results

采用四种 bioindication 方法 (开放水沙笼、床内砂笼、露天网箱、内网网箱), 研究了上伏尔塔瓦河河流域 FWPMs 的环境条件适宜性 (捷克波希米亚森林共和国)。这条河代表一 FWPM 残余地方在中欧之内¹⁹。在这里, 我们提出了一组特别选定的结果, 说明了四方法的最重要的方面。进一步的细节被描述在一个全面的研究Černá等。¹³。

研究了河流环境的两个层次:

(一) 纵向河流剖面由主要流场 (地点 A E) 和不同污染阶段的支流 (站点 R 和 V) 表示。现场通过沙笼和在自由流动的水中安装的网笼进行测试。此外, 在 B、C 和 D 地区的床内沙笼中, 还对砾石交错区进行了试验。

Discussion

曝光时间:

即使是一个月的裸露的网笼显示了明显的增长, 反映了现场之间的差异 (图 3), 所以它们是非常有用的快速和容易检测的现场描述。然而, 结果的相关性取决于条件的短期状态, 可以振荡。特别是, 短期降雨事件可以起到作用。相比之下, 不可预知的偶发污染可能并不总是被记录下来。在现场 V (图 4A), 水化学分析检测到一波强铵增加¹³。这可能对三月暴露的沙笼中的死亡率负责, 但不影响30天裸露的网笼。

温度波动也会影响短期暴露结果。在网笼暴露期间的一个月平均气温不同于年份 (表 1)。随着气温升高 (克鲁斯卡尔 < 0.001) 的增长, 生长速率也随之变化. 另一方面, 在三月的沙笼暴露期间, 同一地点的平均水温在两年内非常相似 (表 1), 增长率没有显著差异 (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>生物材料维护和护理
淡水珍珠蚌幼鱼	任何	NA	来自 FWPM 育种计划
塑料盒	任何	NA
保温箱	MERCI	212,070,600,030	有很多可能性。这只是一个例子。
现场保温箱 （ca25 l）	任何	NA	冷箱（保温箱），通常用于食品运输
河水	任何	NA
培养皿	任何	NA
塑料 带球囊的巴斯德移液器（滴管）	任何	NA	孔径 1 mm
氧化氢	任何	NA
塑料容器 （ca 50 l）河水	任何	NA
塑料滤茶	厨房	常用	NA
<强>网笼结构
主塑料体	任何	NA
塑料过滤器 覆盖	任何	NA
特殊技术筛 340 &;m	丝绸 &Progress	UHELON 20 T
特殊技术筛 100 µm	丝绸 &Progress	UHELON 67 M
橡胶软管（直径 5.5 mm）	任何	NA
钢螺栓、	任何	NA
钢螺母	、任何	NA
扳手	、任何	NA
钢钉	、任何	NA
钳子、	任何	NA
烧杯	任何
塑料盘（约 25x15x3-5 厘米）	任何	NA
喷瓶	，任何	NA
现场协议	任何	NA
文具	任何	NA
塑料容器	任何	NA
绳	任何	NA
锤	子，任何	NA
<强>沙质网箱的构造和使用
筛 1 毫米	任意	NA
筛 2 毫米	任意	NA
特殊技术筛 340 &微型;m	丝绸 &Progress	UHELON 20 T
塑料盒，带紧盖	任何	NA
热熔胶	任何	NA
塑料盒（约 250 x 150 x 100 厘米）
大塑料盒（约 25 升）	任何	NA
平石	，任何	NA
网	，任何	NA
河沙	任何	NA
圆形容器	任何	NA
放大镜	Carson	Carson CP 60	有很多可能性。这只是一个例子
笼安装和维护
场温度数据记录器	ONSET	UA-001-64
http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 铲	任何	NA
牙刷	任何	NA
strong>实验评估
三目解剖变焦立体显微镜	Bresser 光学	ICD 10x-160x	有很多可能性。这只是一个例子。
数码相机/电子目镜	Bresser 光学器件	MikroCamLab 5M	有很多可能性。这只是一个例子。
校准带	Am Scope	SKU： MR100	有很多可能性。这只是一个例子。
带有两个可移动导光器的外部电源	Arsenal	K1309010150021	有很多可能性。这只是一个例子。
Image software	ImageJ 软件		有很多可能性。这只是一个例子。
表格处理器	MS excel		有很多可能性。这只是一个例子。