原位 生物指示法可用于确定濒危 mussel 物种生存环境的适宜性。我们描述了两种基于将淡水珍珠 mussel 幼体暴露于贫营养河流生境中笼养条件下的方法。这两种方法均针对开放水体和潜流层水环境的不同变体进行实施。
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摘要
摘要
了解淡水 mussel 栖息地适宜性是保护这一濒危物种类群的重要步骤。我们描述了一种用于开展 原位 在贫营养河流流域内进行为期一个月和三个月的幼体暴露试验。本文介绍了两种方法（均包含两种改良形式），用于评估幼体的生长情况与存活率。这些方法及其改良形式在局部生物指示价值方面各不相同，各自具有优势与局限性。沙笼法可处理大量个体，但仅对其中部分个体进行测量，结果以整体方式进行评估；网笼法则对个体分别饲养并单独测量，但评估的个体数量较少。敞水暴露改良法操作相对简便，能够反映各采样点的幼体生长潜力，亦可用于水质毒性测试。而原位河床内暴露改良法工作量较大，但更接近幼体自然生存环境，能更准确地反映采样地点的实际适宜性；然而，由于其高变异性的小生境特征，该方法需要更多的重复实验。
引言
实验生物的暴露 原位 随后对其状况进行评估，是获取环境质量（尤其是物种栖息地适宜性）信息的一种可行方法。在动物中，这种生物指示作用主要适用于能够在有限空间内生存的小型无脊椎动物。双壳类（Bivalvia）的幼体阶段便是其中一类合适的生物类群1.
蚌科（Unionidae）双壳类是水生生态系统中极为重要的组成部分2。然而，这些物种常常处于极危状态，尤其是在溪流和河流中。其中一些物种被定义为“伞护种”，其保护与整个溪流生物群落的保护密切相关，需要采取综合性的保护策略3。这些动物的生命周期与多种环境因素相关，从水体化学性质4,5到作为蚌类幼虫宿主的鱼类种群变化6。由于蚌类幼体阶段常被视为其生命周期中的关键时期，因此该阶段发育场所的适宜性对于特定区域内物种种群的成功建立至关重要。
淡水珍珠蚌（FWPM， Margaritifera margaritifera 蚌科，双壳纲）是一种出现在欧洲贫营养溪流中的极危双壳类动物。其数量在20世纪已急剧下降th 一个世纪以来，在其分布区域内，大多数中欧种群的物种繁殖力下降，这主要是由于幼体在生命最初几年的存活率极低甚至为零所致。据推测，幼年期的FWPMs在浅层地下渗流带可存活多年。7，其生存条件及变异性迄今尚未得到充分描述。此外，这些幼体在出生后的前两年内体长仅约1毫米，因此在自然条件下，从大量沉积物中极难发现它们8因此，对圈养幼体开展实验对于研究其生态学特性十分必要。
根据捷克淡水珍珠蚌保护行动计划9，每年都有数千只幼体来自半自然繁殖项目。然而，这些幼体应被用于哪些地点和生境以有效支持种群，或最终实现物种重引入，仍是一个待解决的问题。In situ 生物指示提供了一种寻找答案的方法。
尽管早期一些研究发现幼体贻贝在暴露笼中的存活率不稳定，从而对幼体贻贝作为生物指示物种的适用性提出质疑10，但近年来多项研究已证实幼体暴露法可用于水质检测11,12,13。此外，已有研究指出，在解读此类研究结果时需考虑若干因素，例如种源14以及幼体阶段环境条件的持续影响15。
如何在测试地点安置实验用幼体，以及如何最有效地评估其状态，成为一个需要解决的问题。Buddensiek 首次严格应用了对幼年淡水珍珠蚌类（FWPMs）进行原位（in situ）暴露的方法16。该方法将幼年 FWPM 个体置于片状笼中，暴露于溪流的流动水体中，并在数周暴露后量化其存活率和生长情况。该方法最初被开发为一种半人工繁殖技术，但作者也强调了其在评估栖息地需求和水质方面的适用性。尽管 FWPM 幼体在数月乃至数年的尺度上自然存活率极低，仅有极少数个体能够存活，但在数周的时间尺度上，其存活率仍可作为环境影响的良好指标16。经过多年的科研发展，暴露方法不断改进，可用于在溪流生境中安置实验用幼蚌，并评估其生长与存活率；这些方法包括沙箱法17、基于上涌原理的蚌类储存筒（mussel silos）18，以及多种其他类型的暴露笼（Gum 及同事对此进行了总结）11。由于幼体在自然条件下通常存在于浅层河床潜流带（hyporheic zone）7，因此将实验装置布设于溪流底部具有重要意义。
在本文中，我们描述了两种用于FWPMs的暴露装置：i）改良的Buddensiek板式笼具（"网状笼具"）还可用于进行地下水生境中的生物指示测试；以及 ii）Hruška 沙箱"沙质笼子"）。该方案描述了这两种方法在开放水域和潜流带条件下的应用（即，描述了四种暴露变体）。这些方法在捷克淡水珍珠蚌行动计划的15年多应用过程中逐步得到改进和扩展9 并通过一系列实验验证。
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方案
1. 网格笼
注意：参见图1。
- 准备材料
- 准备实验室内部分所需的材料：每个网笼约 1 - 2 L 河水，网笼（1 个主体塑料结构、2 个塑料盖、2 张孔径为 340 µm 的专用技术筛网、每个网笼配 4 个螺栓和 4 个螺母）、钳子、扳手、巴斯德移液管、滤网、数码相机、三目变倍解剖立体显微镜、校准网格（显微镜设备）、5 个直径为 50 mm 的培养皿、烧杯、2 个塑料皿（约 25 cm × 15 cm × 3 - 5 cm）、以及一个塑料箱。
- 为了进行地下水层安装，准备一根橡胶软管、一个孔径为100 µm的筛网以及一个喷雾瓶。有关装置的构建方法，参见 补充文件1：S.1. 网格笼具的构建.
- 组装网笼的底部和中心部分。组装用于容纳个体的笼体部分：先插入一个塑料盖，然后放入一张塑料筛网，最后盖上主体部分。使用四个螺栓固定。
- 准备生物材料
- 将网笼放入盛有河水的塑料培养皿中，确保腔室半满。取出淡水贻贝幼体（参见 补充文件 1：S.6. 生物材料从保温箱中取出并放入培养皿中。
注意：确保温度的突然变化不超过约 2 °C。 - 使用喷瓶和滤网筛洗幼体，以清除碎屑。
- 将网笼放入盛有河水的塑料培养皿中，确保腔室半满。取出淡水贻贝幼体（参见 补充文件 1：S.6. 生物材料从保温箱中取出并放入培养皿中。
- 设置显微镜和相机。对仪器进行校准（参见 补充文件1：S. 5. 显微镜与摄影技术将一个含有少量水的培养皿置于显微镜下。
- 将幼体放入笼中（实验室内操作）
- 使用巴斯德移液管从培养皿中取出一个个体，并小心地将其置于显微镜下的培养皿中。
- 通过目镜观察（约40倍放大）检查个体的健康状况。
注：“良好”适应性表明个体能够移动、左右翻转、将足部推出壳外， 等。 用巴斯德移液管移除死亡或活力低下的个体，并将其放入单独的培养皿中（包括外壳已张开、无活动、足部无法伸出、外壳破碎、在水中不受控制地漂浮、外壳出现明显分解或部分脱钙的幼体）。 - 使用约80倍的恒定放大倍数，拍摄两张表现出良好适应性的FWPM个体照片。参见 补充文件 1： S.5. 显微镜与摄影技术保存照片。
注意：为了准确测量其长度，应将幼体沿纵轴方向平放（侧视图）。主要目标是拍摄一张高质量的照片，以获得最大的壳长，照片质量需足以支持后续的图像分析。 - 拍摄完照片后，立即将幼体放入笼子的相应隔间中。记录照片编号和隔间编号。
- 对网笼中使用的所有小室中的每个个体重复此步骤。
注意：参见 补充文件1：S.1. 网格笼具的构建. - 将所有使用过的培养室放入珠蚌后，将塑料筛网置于培养笼上，然后轻轻盖上塑料盖，并用螺母将所有部件固定在一起。
- 在将设备安装至河床下渗流带的情况下，将软管的一端穿过其中一个腔室并固定在此位置，然后取防堵塞网，将其绑在软管底端（参见 补充文件1：S.1. 网格笼具的构建).
- 储存幼体
- 将笼子放入装有河水的塑料盒中，使幼体完全浸没，并置于保温箱内。在安装前，让幼体适应 原位 安装位置的河水温度（逐渐冷却，24小时内最大降温5 °C）。
- 安装网笼
- 准备野外材料，包括装有幼虫的网笼、钢钉、螺栓和金属螺母、扳手、野外温度数据记录仪（参见 材料表 和 补充文件 1：S.4.2. 水分测量一根绳子、一台相机、野外操作规程、一把锤子和一把铁锹。
- 将FWPM幼体放入野外保温箱（隔热箱）中运输至现场，保持水温稳定，温差控制在允许范围内 < 约 2 °C。将装有网笼的保温箱放入采样点的河流中，使幼体适应当地的环境条件（pH、电导率， 等等。).
- 安装网笼。
- 从野外保温箱中取出网格笼，配备两个钢钉并固定野外数据记录仪。将笼子锚定在研究区域中符合FWPMs典型生存条件的生境中（例如，位于主流水流边缘，不在直接水流中，不在静水中，也不在直射阳光下。
- 在开阔水域中，使用一对钢制尖钉将笼子固定在河床底部；将其侧放并与河床底部齐平，朝向河流中心，与水流方向呈45°向下倾斜。笼子的下部水平边缘应距河床表面约10–15 cm。在同一地点，各笼子之间应保持至少2 m的最小间距（参见 补充文件1：S.4. 笼具维护).
- 对于河床交错带，将笼子以垂直于水流的方向垂直插入河床底部，使笼子的上部水平边缘与河床表面平行，且腔室位于需要检测的河床交错带深度。在实验过程中，为便于取水样，需将橡胶软管的上端从底部表面伸出（参见 补充文件 1：S.4.2. 水分测量).
注意：建议定期对笼具进行检查和维护（参见 补充文件 1：S.4. 笼具维护).
- 从野外保温箱中取出网格笼，配备两个钢钉并固定野外数据记录仪。将笼子锚定在研究区域中符合FWPMs典型生存条件的生境中（例如，位于主流水流边缘，不在直接水流中，不在静水中，也不在直射阳光下。
- 卸下培养笼并将幼体在暴露后运回。具体操作为：将培养笼从水中拉出，清除细小沉积物和漂浮杂物，放入装有河水的野外保温箱中。立即将培养笼运送至实验室，并开始进行死亡率和生长率的评估。
注意：参见 补充文件 1：S.3. 暴露持续时间若笼子与实验室环境之间的温差超过 5 °C，需先使温度达到平衡。 - 通过检查每只幼体的存活/健康状况（参见步骤1.5.2和1.5.3），并在培养皿中以约80倍的恒定放大倍数对每只存活的幼体拍摄两张图像，以此评估实验。记录健康状况以及图片编号和培养室编号。
- 完成实验（适用于所有方法）
- 在图像分析软件中进行测量。使用图像分析软件分别对输入图像（步骤1.5.3）和输出图像（步骤1.9）中每个被评估的幼体进行体长测定。以两张照片中记录的最大总壳长作为输入和输出的体长数值。
- 将测得的数值输入表格处理软件，计算每只存活幼体的生长增量（%）。
- 使用网笼中存活个体数与网笼中所有实验个体数的比值，估算每个网笼的存活率（%）。
注意：实验结束后，将存活个体重新放回繁育项目
（参见 补充文件 1：S.6. 生物材料).
2. 沙质笼
注意：参见图2。
- 准备材料
- 准备实验室内部分所需的材料：2 个培养皿（直径约 8.5 cm）、巴斯德移液管、滤网、25 L 河水、一个塑料盒、筛子（孔径 1 mm 和 2 mm）、一个大塑料箱（25 L）、沙笼（见 补充文件1：S.2. 沙质围栏的构建），数码相机、三目解剖变倍体视显微镜、校准网格（显微镜设备）、来自研究区域的分选河沙（见步骤2.1.3）以及实验方案。参见 材料表 和 补充文件 1：S. 2. 沙质围栏的构建.
- 准备分离过程所需材料：圆形容器（每笼1个，另加1个备用）、2个培养皿（直径约14 cm）、1支巴斯德吸管、放大镜和1 L河水。
- 将河沙通过2-mm筛网过筛，再通过1-mm筛网过筛，以获得粒径为1–2 mm的沙粒。将筛后沙粒烘干，并以干燥状态保存备用。
- 取幼体（参见 补充文件 1：S.6. 生物材料从保温箱中取出样本，放入培养皿中。使用喷瓶和筛网筛选幼体，以清除碎屑。
- 设置显微镜和相机（参见 补充文件1：S.5. 显微镜与摄影技术).
- 将幼体放入笼中（实验室内操作）
- 将沙质培养笼放入塑料箱中。将分选好的沙子（见步骤2.1.3）均匀铺入沙质培养笼内，高度约为培养笼高度的三分之一。向塑料箱中加水，确保沙子表面低于水位约10 mm。将沙质培养笼置于盛有25 L河水的水箱中，并使其处于与幼年淡水真珠蚌（FWPMs）相同的温度条件下（见 补充文件 1：S.6.2 生物材料的保存）过夜12小时。避免砂子接触任何阳光。
- 取含有已制备的FWPM幼虫的培养皿。
- 通过目镜观察个体健康状况（见步骤1.5.2）。
- 按如下步骤进行摄影记录：拍摄所发现的所有个体的合影（参见步骤1.5.3），并从中选出10个最大的个体。或者，将所有幼体一起拍摄低倍率（约40倍）照片，用于整体评估，并从中选出10个最大的个体。保存所有照片并记录其编号。
- 使用喷壶将淡水珍珠蚌幼体转移至准备好的沙质网箱中。
- 储存幼体
- 将笼子放入装有河水的大塑料盒中，确保笼子完全浸没，然后将其置于保温箱内。让幼体适应 原位 河水温度（逐步降温，最高5 °C，持续24小时）在安装前进行。
- 安装沙质笼子
- 准备现场安装所需材料：沙袋、一个约25升的野外保温箱、一块扁平石块（最小重量1公斤）、一张网（网眼尺寸10 x 10毫米）、一个喷水瓶、野外温度数据记录仪（参见 材料表 和 补充文件 1：S.4.2. 水分测量）、铲子和野外操作规程。
- 将装有幼体的笼子放入现场保温箱中运输，保持水温稳定（温差约2 °C）。将装有沙质笼子的现场保温箱置于野外采样点的河流中，使淡水珍珠蚌（FWPM）幼体适应当地环境条件（pH、电导率， 等。).
- 将沙质笼子安装到符合FWPMs典型生存条件的生境中（例如在主水流边缘的弯曲处，不在直接水流中，不在静水中，也不在直射阳光下。
- 对于开阔水域，使用网将沙质笼固定在扁平石块上，并放置于河床底部。确保笼子的较大侧面与水流方向成45°角。
- 对于潜流带实验，将笼子垂直于水流方向埋入河床底部，使笼盖与河床表面齐平。
注意：建议定期对笼具进行检查和维护（参见 补充文件 1：S.4.1. 站点检查).
- 暴露后拆卸笼具并转移幼体
注意：参见 补充文件1：S.3. 暴露持续时间.- 将笼子从水中拉出，清除漂浮物，并放入装有河水的野外保温箱中。
- 将笼子运送到实验室，开始进行死亡率和生长速率的评估。
注意：当笼子与实验室环境之间的温差超过 5 °C 时，必须让温度达到平衡。
- 将 FWPM 幼虫从沙子中分离出来
- 准备一个圆形容器，注入水深50 mm的水（每个笼子单独准备一个容器），另准备一个额外的圆形容器。将笼中的沙子转移至圆形容器中，通过旋转搅动的方式将较轻的颗粒冲洗到额外的容器中。
- 逐步从该容器中取样，使用巴斯德吸管和放大镜逐级寻找幼体。用巴斯德吸管将找到的幼体转移至培养皿中。重复此步骤，直至找到最后一个幼体，并在首次未发现幼体后继续重复10次。每次冲洗步骤后，向装有沙子的原始容器中添加干净的河水。
注意：尤其是在第一次冲洗后，应仔细检查内容物，并清除细小的沉积物和其他碎屑等杂质。
- 评估实验
- 检查每只幼体的健康状况（参见步骤 2.4.3 和 1.5.2），并统计存活个体数量。
- 分别拍摄每株个体的照片（参见步骤2.4.4），尽管这意味着每个个体没有明确的身份标识。或者，拍摄整体照片，并从最终结果中选取生长状况最好的10株个体的子集进行分析。
注意：两种方案的报告价值相似。方案1的局限性在于工作量较高，但其优势在于可实现最高的照片放大倍数，从而具有更高的准确性。
- 完成实验
- 在图像分析软件中进行测量。除以下例外情况外，其余实验步骤均与网笼实验相同（参见步骤1.10）：在沙质笼实验中，不单独评估每个幼体的生长率（%），而是将整个群体作为一个整体进行评估。
注意：实验结束后，应将存活个体重新放归繁育项目
（参见 补充文件 S.6.1. Se生物材料的采集).
- 在图像分析软件中进行测量。除以下例外情况外，其余实验步骤均与网笼实验相同（参见步骤1.10）：在沙质笼实验中，不单独评估每个幼体的生长率（%），而是将整个群体作为一个整体进行评估。
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结果
四种生物指示方法（敞水区沙质笼、河床内沙质笼、敞水区网笼和河床内网笼）被用于评估捷克共和国波希米亚森林地区伏尔塔瓦河上游流域适合淡水珍珠蚌（FWPMs）生存的环境条件。该河流代表了中欧地区淡水珍珠蚌现存栖息地之一。19. 本文展示了一组特别筛选的结果，用以说明这四种方法的最重要方面。更多细节详见一项综合性研究 Černá 等人13.
在两个层面上对河流环境进行了研究：
（I）纵向河流剖面由主流的不同采样点（A - E 站点）以及处于不同污染程度的支流（R 和 V 站点）表示。这些采样点均通过置于自由流动水体中的沙质笼和网笼进行检测。此外，在 B、C 和 D 采样点，还通过设置在河床内部的沙质笼对砾石河床下渗流带进行了检测...
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讨论
曝光时间：
即使仅暴露一个月的网笼也显示出明显的生长差异，反映出不同地点之间的区别（图3），因此它们非常适用于快速简便地检测地点特征。然而，结果的可靠性取决于短期内环境条件的变化，这些条件可能存在波动。特别是短暂的降雨事件可能产生影响。相比之下，不可预测的偶发性污染可能无法总是被记录下来。在地点V（图4A）的水质化学分析中检测到一次短暂的强铵离子浓度升高13，这可能是导致暴露三个月的沙质笼中生物死亡的原因，但并未影响暴露30天的网笼。
温度波动也可能影响短期暴露实验的结果。网笼暴露期间的月平均温度在不同年份之间存在差异（表1）。在温度较高的情况下，生长速率也较高，表现出相应变化趋势（Kruskal-Wallis 检验 p < 0.001）。另一方面，在两年间，相同地点沙质笼暴露期间的平均水温非常接近（
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Michal Bílý 和 Ondřej P. Simon 获得了捷克生命科学大学的资助 [捷克生命科学大学环境科学学院内部研究资助机构（42110 1312 3175 (20164236))]。Karel Douda 获得了捷克科学基金会（13-05872S）的支持。关于珍珠蚌的生物指示作用及其当前分布的数据，是在捷克共和国自然保护区管理局实施的捷克淡水珍珠蚌保护行动计划期间收集的，该计划由捷克共和国政府资助，相关信息可访问
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物材料的维持与护理 | |||
| 淡水珍珠蚌幼体 | 任意 | NA | 来自淡水珍珠蚌繁育项目 |
| 塑料盒 | 任意 | NA | |
| 保温箱 | MERCI | 212,070,600,030 | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
| 野外用保温箱（约25 L） | 任意 | NA | 常用于食品运输的冷藏箱（隔热箱） |
| 河水 | 任意 | NA | |
| 培养皿 | 任意 | NA | |
| 带橡胶球泡的塑料巴斯德吸管（滴管） | 任意 | NA | 孔径1 mm |
| 过氧化氢 | 任意 | NA | |
| 用于盛放河水的塑料容器（约50 L） | 任意 | NA | |
| 塑料茶滤网 | 任意 | NA | 厨房常用 |
| 网笼的构建 | |||
| 主塑料壳体 | 任意 | NA | |
| 塑料盖 | 任意 | NA | |
| 特殊工业筛网 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| 特殊工业筛网 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| 橡胶软管（直径5.5 mm） | 任意 | NA | |
| 钢制螺栓 | 任意 | NA | |
| 钢制螺母 | 任意 | NA | |
| 扳手 | 任意 | NA | |
| 钢制尖桩 | 任意 | NA | |
| 钳子 | 任意 | NA | |
| 烧杯 | 任意 | NA | |
| 塑料培养皿（约25×15×3–5 cm） | 任意 | NA | |
| 喷瓶 | 任意 | NA | |
| 野外记录表格 | 任意 | NA | |
| 办公用品 | 任意 | NA | |
| 塑料容器 | 任意 | NA | |
| 绳子 | 任意 | NA | |
| 锤子 | 任意 | NA | |
| 沙笼的构建与使用 | |||
| 筛网 1 mm | 任意 | NA | |
| 筛网 2 mm | 任意 | NA | |
| 特殊工业筛网 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| 带紧密盖子的塑料盒 | 任意 | NA | |
| 热熔胶 | 任意 | NA | |
| 塑料盒（约250 × 150 × 100 cm） | |||
| 大塑料箱（约25 L） | 任意 | NA | |
| 扁平石块 | 任意 | NA | |
| 网 | 任意 | NA | |
| 河沙 | 任意 | NA | |
| 圆形容器 | 任意 | NA | |
| 放大镜 | Carson | Carson CP 60 | 有多种可选型号，此仅为一个示例 |
| 笼具的安装与维护 | |||
| 野外温度数据记录仪 | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| 铲子 | 任意 | NA | |
| 牙刷 | 任意 | NA | |
| 实验评估 | |||
| 三目变倍体视解剖显微镜 | Bresser optic | ICD 10x-160x | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
| 数码相机/电子目镜 | Bresser optic | MikroCamLab 5M | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
| 校准网格 | Am Scope | SKU: MR100 | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
| 带两条可移动导光管的外部光源 | Arsenal | K1309010150021 | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
| 图像分析软件 | ImageJ software | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 | |
| 表格处理软件 | MS excel | 有多种可选型号，此仅为一个示例。 |
参考文献
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