使用实验方案 果蝇 作为实验室毒性测试的无脊椎动物模型系统

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于使果蝇属（Drosophila）物种暴露于污染物中，旨在研究暴露对不同发育阶段及多代个体多种表型输出的影响。

摘要

涌现特性及外部因素（尤其是种群水平和生态系统水平的相互作用）在调节生态学重要终点方面发挥着重要作用，尽管这些因素在毒理学研究中很少被考虑。D. melanogaster 正逐渐成为研究毒物对行为、神经及遗传影响的毒理学模型，仅举几例而言。更重要的是，Drosophila 属的物种可被用作一个模型系统，以整合涌现特性，并在 毒理学研究中回答具有生态相关性的问题。本文旨在提供一种实验方案，用于将Drosophila 属物种暴露于污染物中，作为研究多种表型输出和生态相关问题的模型系统。更具体地说，该方案可用于：1）关联多个生物学组织层次，理解毒物对个体和种群适合度的影响；2）检测不同发育阶段暴露下毒物的影响；3）检验污染物的跨代及进化效应；4）同时检测多种污染物和应激因子。

引言

每年，化学工业都会推出约1000种新化学品^1,2；然而，其中仅有极小部分在投放市场前经过了环境影响测试^2,3。尽管大规模环境灾难并不常见，但人类和野生动物对多种污染物的亚致死性及慢性暴露却十分普遍^4,5。生态毒理学与环境毒理学长期以来的研究重点是测试致死性、单一化学品暴露、急性暴露以及暴露后的生理效应，以此作为衡量污染物对生物体存活影响的手段^6,7,8,9,10。尽管目前动物实验正逐步转向更符合伦理且非侵入性的方法，但现有方法仍存在局限性，因为发育过程、涌现特性以及外部因素（如种群水平和生态系统水平的相互作用）在调控生态相关终点效应中发挥着重要作用⁸。因此，亟需发展能够在不牺牲野生动物和/或脊椎动物的前提下，整合更全面研究视角的方法。

无脊椎动物模型系统，例如 Drosophila melanogaster，为实现更整体化的毒性测试方法提供了一种有吸引力的替代方案。D. melanogaster 大约一个世纪前最初被开发用于与人类相关的遗传学研究的无脊椎动物模型系统¹¹。如今，D. melanogaster 被广泛用作脊椎动物模型的替代系统，主要原因包括：1）D. melanogaster 与人类之间基因和通路的高度保守性；2）相较于脊椎动物模型更短的世代周期；3）维持成本低廉；4）易于获得大样本量；以及 5）存在大量可用于测试的表型和生态相关终点指标^{11,12,13,14,15,16,17}。

目前，多个实验室^{11,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25} 正在使用 D. melanogaster 作为脊椎动物模型的替代方案进行毒性测试，以研究污染对人类的影响。本地的野生 Drosophila 物种也可用作野生动物（以及人类）的毒性模型，以在多个生物学组织层次上回答与生态学、行为学和进化相关的科学问题。利用 Drosophila 属内的物种作为模型，可实现多种可测量的终点指标^{11,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25}。此外，使用 Drosophila 模型，毒理学家可以：1）在多个生物学组织层次上伦理地关联效应；2）整合新兴因素和发育过程的作用；3）研究具有生态学意义的终点指标（而不仅限于医学相关终点）；4）同时测试多种应激源；5）评估应激源的长期多代（例如 进化和跨代）影响。因此，将 Drosophila 作为模型系统，能够支持多种研究策略，而不仅限于在实验室中利用近交系 D. melanogaster 进行机制性研究。

本文介绍了饲养和收集的方法 果蝇 以回答各种毒理学问题。更具体地说，我们描述了以下方法：1）饲养 果蝇 在含有一种或多种污染物的培养基中；2）收集 果蝇 在发育过程中例如 游走期三龄幼虫、蛹壳、新羽化成虫和成熟成虫）；以及3）饲养 果蝇 在污染的培养基中测试长期暴露于有毒物质的跨代和多代传递效应及其进化意义。采用本方案，先前的研究者^{18,19,20,21,22,23,24,25} 已报道发育期铅（Pb）暴露对生理、遗传和行为产生不同的影响²⁺暴露。该方案使毒理学家能够采用更为整体化的毒理学方法，这对于理解在污染日益加剧的环境中污染物如何成为人类和野生生物健康风险因素至关重要。

方案

以下实验方案用于在毒素可通过口服摄入的情况下，将Drosophila属物种饲养于受污染的培养基上；使用Drosophila模型还可实现其他形式的暴露^11,15,16,26。本方案中所述方法此前已被Hirsch et al.¹⁹ 以及Peterson et al.^23,24,25 报道过。

1. 建立库存种群 黑腹果蝇 在研究实验室中

1. 设置一个环境可控的培养箱（或小型房间）用于饲养 Drosophila 种群，根据测试物种的偏好设定恒定的温度、光暗周期和湿度。
   注意：首选的环境条件将因所选研究物种的原生生态而异。例如，D. melanogaster 原产于撒哈拉以南非洲²⁷，通常在 25 °C、12:12 光暗周期和约 60% 湿度条件下维持培养^{16,18,19,20,21,22,23,24,25,28,29,30}。另一方面，D. montana 的分布范围遍及加拿大大部分地区和美国中西部，属于较寒冷区域；因此，D. montana 通常在 19–20 °C 下维持培养，有时采用 24 小时连续光照以模拟其交配季节的环境条件³¹。有关不同 Drosophila 物种地理分布的更详细描述，请参见 Drosophila Speciation Patterns 网站³²。
2. 从保种中心（见材料表）、其他研究实验室（经申请）或野外采集获得所需的 Drosophila 物种和/或近交系，以获取野生型、遗传多样性丰富的种群。
   注意：以下步骤说明了在研究实验室中采集和维持野生型、遗传多样性丰富的 Drosophila 种群的方法。这些方法经 Markow 和 O'Grady³³ 以及 Werner 和 Jaenike³⁴ 的方法修改而来，旨在一次性采集尽可能多样的物种，而非仅使用单一诱饵针对特定物种进行采集。
   1. 将半打成熟的香蕉放入冰箱冷冻过夜，使用前取出解冻。
   2. 准备多个 1–2 L 的塑料瓶，在瓶身前侧切出 U 形切口，使果蝇可进入瓶内取食但无法逃逸。用瓶盖盖紧塑料瓶，防止果蝇从瓶口逃出。
   3. 将解冻后的香蕉放入瓶底，使瓶底覆盖约一英寸厚的香蕉。在瓶内放入一片成熟的番茄。将酵母浆液（啤酒酿造过程中的残留酵母）加入瓶底的香蕉中，使香蕉充分浸泡在酵母浆液中。
   4. 在瓶内竖直插入木棒，为果蝇提供远离酵母浆液和香蕉的清洁行走基质。
      图 1 展示了上述方法的最终装置。
   5. 将诱捕瓶悬挂于树上过夜，每隔 24 小时检查一次。用口吸管将果蝇从瓶中吸出，并将每只雌蝇单独放入含有培养基的小瓶中，以建立同雌系（iso-female lines）。
      注意：也可建立多雌系（multi-female lines），但前提是能够明确区分各物种的雌蝇。此外，Drosophila 属内的不同物种占据不同的生态位，其饮食需求也因生态位而异（Werner 和 Jaenike³⁴）；有关饮食建议和培养基配方，请参见 Werner 和 Jaenike³⁴。
   6. 在解剖显微镜下观察 F₁ 代成虫，以鉴定所采集的 Drosophila 物种（参见 Markow 和 O'Grady³³ 以及 Werner 和 Jaenike³⁴ 获取不同物种的鉴定帮助）。

图1：用于采集野生种群的诱捕器及诱饵的图示 果蝇 在该领域中。 （A） 在科罗拉多州某本地野外地点设置的果蝇诱捕器。 （B） 该野外地点设置的捕蝇器的近距离视图。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 在环境可控的培养箱或房间中维持单雌系或多雌系，保持恒定的温度、光暗周期和湿度。具体操作为：将果蝇饲养在适宜的培养基中的小瓶或瓶子内，让怀卵雌蝇在培养基中产卵。定期观察小瓶中是否有幼虫和蛹出现。
   注意：Drosophila 属内的不同物种占据不同的生态位，其营养需求及对非生物环境因子的偏好也因生态位而异^33,34。有关环境偏好和饮食建议（以及果蝇饲养的进一步指导），可参考 Elgin 和 Miller²⁸、Shaffer et al.²⁹、Stocker 和 Gallant³⁰、Markow 和 O'Grady³³ 以及 Werner 和 Jaenike³⁴。若使用野外捕获的物种，可在培养箱中模拟当地环境条件，直至物种被鉴定。
4. 定期将果蝇品系转移到新鲜培养基中，并丢弃旧的小瓶，以维持健康的品系并避免螨虫感染。
   注意：转移频率取决于物种的生活周期。例如，Drosophila melanogaster 应每 2 周转移一次至新鲜培养基。有关实验室中维持品系的更多资讯，请参见 Rand et al.¹⁶、Elgin 和 Miller²⁸、Shaffer et al.²⁹、Stocker 和 Gallant³⁰、Greenspan³⁵ 以及 Science Education Database³⁶。

2. 在污染培养基中培育 Drosophila

注意：如果首次在实验室中测试果蝇（Drosophila）或使用新的污染物，应首先确定致死剂量（方法见 Castaneda et al.³⁷ 和 Massie et al.³⁸）以及半数致死量（LD50）（方法见 Castaneda et al.³⁷ 和 Akins et al.³⁹）。然后，进行剂量-反应曲线实验，以确定与预期表型输出相关的生物学有效浓度；方法详见 Hirsch et al.¹⁹ 和 Zhou et al.⁴⁰。

1. 根据污染物的化学性质，配制所需浓度的污染培养基储备液。
   注意：例如，配制醋酸铅（PbAc）储备液：通过将污染物加入蒸馏水（dH₂O）中来配制醋酸铅（PbAc）储备液₂0）直至使用污染水配制的培养基达到目标浓度。例如，可通过将 PbAc 加入 dH₂O 中制备 1,000 µM PbAc 的储备液。₂0，直至达到 1,000 µM PbAc。此外，将储备液（例如 将1,000 µM PbAc溶液稀释至所需浓度（如500 µM PbAc），并将这些溶液同样作为储备液保存。
2. 按照制造商指南配制培养基，作为对照培养基。另按制造商指南配制额外培养基，但在其中添加已制备的污染物溶液以用于dH₂0.
   注意：例如，若使用即用型 果蝇 培养基，取约一茶匙即溶培养基加入塑料小瓶中，再加入约5–5.5 mL去离子水₂0 加入培养基中。撒上几粒活性干酵母以制备对照培养基。制备实验培养基时，向储备液（如 500 µM PbAc）中补充 dH₂O₂0.
3. 将具有生殖能力的成熟雄性和雌性个体从种群中转移到对照组和实验组培养基中。
   注意：羽化后至生殖成熟的时间在不同种类之间存在差异 果蝇 物种⁴¹.
   1. 用惯用手轻轻敲击装有储备果蝇的小瓶，确保果蝇自动移至小瓶底部。另一只手在继续轻敲的同时取下瓶盖，将装有对照或污染培养基的新小瓶口对口置于果蝇小瓶上方。双手固定两支小瓶并迅速翻转，同时轻轻敲击，使果蝇自动转移至装有对照或污染培养基的新小瓶中。在持续轻敲果蝇小瓶的同时，盖上瓶盖。
   2. 重复此步骤，使用更多小瓶，并确保每瓶中的果蝇数量保持一致。
      注意：转移的成虫总数 通过 单次转移或麻醉的数量需根据所用瓶体的大小来确定，以避免过度拥挤。
   3. 在标准环境条件下孵育成虫（即 将成虫放入培养箱中，使其在培养基中交配并产卵24–96小时。
   4. 24–96 小时后，将成虫弃入尸体收集瓶（装有矿物油并配有紧密贴合漏斗的烧瓶）中，留下受精卵（后续将作为实验对象）继续成熟以备检测。将小瓶置于培养箱中，使卵发育。
   5. 通过观察培养基中是否有幼虫爬出，监测试管中是否存在游走期幼虫。

3. 收集不同发育阶段的实验样本

注意：可在任何发育阶段采集实验对象，将其放入盲编码的15 mL锥形管中，并检测污染物的累积情况。检测污染物累积的方法取决于所研究的特定污染物。例如，醋酸铅（PbAc）的累积可通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行检测⁴²。此外，也可在任何发育阶段采集实验对象，以检测污染物引起的多种表型效应。图2展示了Drosophila的生命周期⁴³。图3展示了暴露实验方案以及用于采集的不同发育阶段。

图2：生命周期的概念概述 D. melanogaster （最常用的 黑腹果蝇 模型系统） 发育阶段 果蝇 生活周期包括：1）卵，2）一龄幼虫，3）二龄幼虫，4）三龄幼虫，5）游走期三龄幼虫，6）白眼蛹，7）红眼蛹，8）新羽化成虫，以及 9）成熟成虫。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：在亲代（F₀）及后续世代（F₁ 及以后）中通过口服方式使Drosophila暴露于污染培养基的方法的概念示意图。 (A) 暴露世代在发育期间进行口服暴露的方法。(B) 检测污染物向后代（F₁ 至目标世代）传递的方法。该图已根据 Peterson et al.²⁴ 修改。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 收集游走期三龄幼虫
   1. 当培养箱灯光开启时，开始观察试管，因为幼虫将在灯光开启后1小时内从培养基中爬出，并沿试管壁向上移动。在此1小时内，使用木棒或镊子小心地将游走期三龄幼虫从试管壁上移除。
      注意：可用于收集的幼虫数量取决于“2.3.4”步骤中产下的卵数。
   2. 为去除幼虫中多余的培养基，将幼虫放入盛有去离子水的小烧杯中₂O. 加入去离子水₂将幼虫从烧杯中取出，置于精细擦拭纸上。使用精细擦拭纸轻轻吸去多余的去离子水。₂来自幼虫的O
   3. 在环境可控的培养箱中维持实验种群。
2. 收集新羽化的成虫
   1. 通过观察小瓶边缘蛹体的颜色变化，监测小瓶中果蝇的羽化情况。
      注意：蛹在发育过程中会逐渐变暗。发育时间，尤其是羽化前期，取决于所测试的物种。
   2. 当首批成虫开始羽化时，将其倾倒并丢弃至含有矿物油的尸体容器中。
   3. 次日早晨培养箱灯光开启时，倾倒并丢弃前一晚或当日早晨灯光开启前可能已羽化的未知年龄（或未知处女状态）的成虫。
   4. 约4小时后，使用CO₂对羽化出的成虫进行麻醉₂ 枪注入小瓶中。将成虫置于 CO₂ 在解剖显微镜下观察并分盘。通过检查雄性前肢上的性梳和雌性腹部的产卵器来区分成虫性别。
      注意： D. melanogaster 必须在羽化后6小时内收集，以避免交配，但其他物种的发育时间可能较长（因此无需在此时间段内收集）。
   5. 将成虫在 CO₂ 下分离₂ 使用木棒将成虫按性别分组，并用木棒轻轻转移至与其既往培养条件相匹配的培养基中。
3. 收集羽化后的成熟成虫
   1. 在环境控制的培养箱中，让成虫留在与卵期至羽化前暴露条件相匹配的培养基上，直至达到羽化后所需年龄。
   2. 在测试前24小时，将成虫单独转移至对照培养基中，以使成虫清除体表残留的污染培养基。

4. 培养实验对象以检测多代或跨代暴露的影响。

1. 为了培育亲代（即 P₀ 或 F₀ 代），按照“2.1”至“2.3”以及“3.1”至“3.3”的步骤，将来自保种群体的成虫转移到对照组和实验组培养基中。
2. 当成虫达到生殖成熟时（参见 Pitnick et al.⁴¹），按照 2.3.1 中所述方法，将一管雄虫单独转移至装有对照或实验培养基的新管中；再将一管雌虫单独转移至已含有雄虫的新管中。让成虫在培养基中交配并产卵 24–96 小时。随后将成虫倾倒并丢弃至含有矿物油的尸体收集容器中，继续孵育培养管以使子代发育。
3. 根据所需代数，重复步骤 4.1 至 4.2。

结果

通过口服暴露 果蝇 在整个发育过程中暴露于污染物，可通过暴露实验来检验各种毒理学问题 果蝇 在不同生物学组织水平上的结果。本节展示了使用本方案在先前已发表论文中获得的代表性结果^23,24特别是，该方案此前已被用于评估铅（Pb）在暴露当代表型个体及其子一代后代中的积累、消除和隔离情况。²³；并研究积累效应在配偶选择中的意义²⁴.

表1 和 图4 展示了使用本方案测定Pb在F₀ 和 F₁ 两代中积累与消除情况的代表性结果。

讨论

黑腹果蝇 由于基因和通路在物种间具有高度保守性，该模型已被确立为研究多种生物过程的有力工具 D. melanogaster 和人类^13,14出于与医学科学研究中作为强大模型相同的理由 果蝇 已成为研究人为污染对多种毒理学终点影响的合适模型系统。多家实验室已成功采用 D. melanogaster 作为研究多种化合物（包括重金属）的模型系统^{11,16,18-25,37,38,39,<...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Carolina Biological Instant Drosophila 培养基配方 4-24	Carolina Biological	173204
果蝇小管，窄型（聚苯乙烯），聚苯乙烯，超大量装，每单位 1000 个	Genesee Scientific	32-116SB	用于存放果蝇
窄型塑料小管用 Flugs 密封盖，适用于小管和瓶子	Genesee Scientific	49-102	用于存放果蝇
纸板托盘，仅托盘，窄型	Genesee Scientific	32-124	用于整理果蝇群体
纸板托盘，仅分隔板，窄型	Genesee Scientific	32-126	用于整理果蝇群体
Thermo Scientific Nalgene 方形广口高密度聚乙烯瓶（带盖）	Fischer Scientific	03-312D	适用于污染物的储存
Thermo Scientific Nalgene 彩色编码低密度聚乙烯洗瓶	Fischer Scientific	03-409-17C	适用于污染物的储存
Eppendorf Repeater M4 手持式手动移液器分配器	Fischer Scientific	14-287-150	用于制备培养基
Combitips Advanced 移液器吸头 - 标准型，Eppendorf 品质吸头	Fischer Scientific	13-683-708	用于制备培养基
Flypad，标准尺寸（8.1 × 11.6 cm）	Genesee Scientific	59-114	用于麻醉果蝇
Flystuff 脚踏阀	Genesee Scientific	59-121	用于麻醉果蝇
绿色软管（每单位连续一英尺）	Genesee Scientific	59-124G	用于麻醉果蝇
矿物油，轻质，白色，高纯度级，500 mL 高密度聚乙烯瓶装	VWR	97064-130	用于制作果蝇处理容器（morgue）
玻璃锥形瓶套装 - 三种规格 - 50、150 和 250 mL，Karter Scientific 214U2	Walmart	不适用	用于制作果蝇处理容器（morgue）
BGSET5 玻璃烧杯套装，共 5 个	Walmart
近交系或野生型 Drosophila 品系	印第安纳大学 Drosophila 资源中心		https://bdsc.indiana.edu
野生型 Drosophila 种群	加州大学圣地亚哥分校 Drosophila 资源中心		https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php