重组逆转录病毒整合酶与模拟病毒DNA末端的DNA寡核苷酸可形成一种具有酶活性的复合物，称为整合体（intasome）。整合体可用于生化、结构和动力学研究。本方案详细介绍了如何组装和纯化原型泡沫病毒整合体。
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本文内容
摘要
摘要
逆转录病毒生命周期的一个决定性特征和必要步骤是将病毒基因组整合到宿主基因组中。所有逆转录病毒均编码一种整合酶（IN），该酶催化病毒DNA与宿主DNA之间的共价连接，此过程称为链转移。整合过程可以被模拟 体外 使用重组逆转录病毒整合酶（IN）和模拟病毒基因组末端的DNA寡核苷酸。为了更真实地重现整合反应的发生过程 体内通过在低盐浓度缓冲液中透析，由重组IN蛋白和合成寡核苷酸组装成整合复合物。该整合复合物称为整合体（intasome），可通过尺寸排阻色谱法进行纯化。对于原型泡沫病毒（PFV），其整合体由四个IN蛋白亚基和两条DNA寡核苷酸链组成，可轻松与单体IN蛋白及游离寡核苷酸DNA分离。可在多种实验条件下检测PFV整合体的整合效率，以深入理解逆转录病毒整合的动力学与作用机制。
引言
所有逆转录病毒生命周期中必不可少的一步是将病毒基因组整合到宿主基因组中1病毒酶整合酶（IN）催化病毒DNA基因组两端与宿主DNA的共价连接。在细胞感染过程中，IN是介导整合的前整合复合物的一部分。重组IN与模拟病毒DNA末端的双链DNA寡核苷酸结合后，也可将DNA整合到靶DNA中。 体外2一种常见的整合检测方法 体外 利用超螺旋质粒作为靶DNA。两个病毒DNA寡聚体（vDNA）同时整合到质粒中，产生线性产物，该过程称为协同整合。图2A）。整合实验 体外 也可能产生仅有一个vDNA共价连接到靶质粒上的产物，形成松弛环状结构。这种单侧位点整合产物似乎是实验检测中的一种假象。 体外.
重组IN与vDNA可介导整合 体外，但当单体IN会遮蔽相关可视化时，它们并不是研究整合复合物动态或结构的理想试剂。纯化的整合复合物，或 "整合体（intasomes）是进行动态单分子分析或结构研究所需的复合物。PFV整合酶（IN）与病毒DNA（vDNA）可通过透析法从相对高盐浓度缓冲液逐步转移至低盐浓度缓冲液中进行组装。3,4透析过程中....
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方案
1. vDNA的退火
- 在最终体积为1.5 mL的体系中混合1× TEN缓冲液（10× TEN储备液：100 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 M NaCl，10 mM EDTA）、10 µM Oligo 1（5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3'，100 µM储备液）和10 µM Oligo 2（5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3'，100 µM储备液）。将混合物分装至六十个0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中，每管25 µL。
注意：根据具体应用，可在Oligo 2的5'端修饰荧光染料或标签，或在Oligo 1的5'端第13个碱基处引入内部氨基-T修饰。修饰后的寡核苷酸应在退火前通过高效液相色谱（HPLC）纯化。我们发现，在Oligo 2的5'端标记Cy3或Cy5荧光染料会使整合体组装效率降低10倍，而内部荧光标记则不会影响组装效率。 - 使用热循环仪进行退火，程序如下：94.0 ˚C保持3分钟，1个循环；随后进行99个循环，每个循环包括94.0 ˚C保持1分钟、93.6 ˚C保持1分钟，每个循环的两个温度均递减0.8 ˚C（最后一个循环为14.8 ˚C保持1分钟，14.4 ˚C保持1分钟），最后在4.0 ˚C保存。
- 合并全部六十个PCR管中的退火反应产物。取500 µL样品分别加入两个0.5 mL、截留分子量为3 kDa的超滤离心浓缩装置....
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结果
PFV整合体由重组的IN蛋白和vDNA组装而成。组装完成后，通过SEC对整合体进行纯化（图1）。使用超螺旋DNA作为靶标，并通过琼脂糖凝胶电泳检测各组分的整合活性（图2）。该凝胶使用荧光扫描仪成像，检测EtBr（若使用了荧光标记的vDNA，则同时检测荧光基团）。利用图像分析软件，可通过条带的像素体积计算整合效率（图3）。将整合效率最高的组分迅速冷冻，以备后续使用。冷冻的组分可保持整合活性（图4），从而实现组装后整合体的长期保存。任何标记分子及其在vDNA中的位置均可能影响整合体的组装效率（图5）。
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讨论
逆转录病毒整合酶（IN）与病毒基因组DNA形成多聚体复合物，以执行整合功能并延续病毒生命周期。每个整合体（intasome）中的IN单体数量可能是四聚体、八聚体，或更高阶的多聚体11,12,13,14。PFV整合体是由重组IN蛋白与模拟病毒基因组DNA末端的双链DNA寡核苷酸组成的四聚体复合物3。 这类整合体已被用于结构与动力学研究3,5,13,14。
PFV整合体的组装是在从相对高盐浓度缓冲液透析至低盐浓度缓.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 AI099854 和 AI126742，授予 KEY。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNA 寡核苷酸 | IDT | N/A | 定制 DNA 寡核苷酸 |
| Tris 超纯级 | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器 | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa 截留分子量 |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS 丙烷，>=99.0%（滴定法） | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| 甘油 | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| 凝胶加样枪头，1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| 剃刀刀片；单刃；100 支/包；每包 100 片 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 带 PES 膜的无菌一次性滤器，> 250 mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| 透析管夹 | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa，10 mm 透析管 | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| 高分辨率标准琼脂糖 | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| 溴化乙锭 | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| 橙色 G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb，500 泳道 | Denville Scientific | CB4225-4 |
参考文献
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, ....
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