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方法文章

原型泡沫病毒整合体的组装与纯化

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DOI：

10.3791/57453

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2018年3月19日

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

本文内容

摘要

重组逆转录病毒整合酶与模拟病毒DNA末端的DNA寡核苷酸可形成一种具有酶活性的复合物，称为整合体（intasome）。整合体可用于生化、结构和动力学研究。本方案详细介绍了如何组装和纯化原型泡沫病毒整合体。

摘要

逆转录病毒生命周期的一个决定性特征和必要步骤是将病毒基因组整合到宿主基因组中。所有逆转录病毒均编码一种整合酶（IN），该酶催化病毒DNA与宿主DNA之间的共价连接，此过程称为链转移。整合过程可以被模拟 体外 使用重组逆转录病毒整合酶（IN）和模拟病毒基因组末端的DNA寡核苷酸。为了更真实地重现整合反应的发生过程 体内通过在低盐浓度缓冲液中透析，由重组IN蛋白和合成寡核苷酸组装成整合复合物。该整合复合物称为整合体（intasome），可通过尺寸排阻色谱法进行纯化。对于原型泡沫病毒（PFV），其整合体由四个IN蛋白亚基和两条DNA寡核苷酸链组成，可轻松与单体IN蛋白及游离寡核苷酸DNA分离。可在多种实验条件下检测PFV整合体的整合效率，以深入理解逆转录病毒整合的动力学与作用机制。

引言

所有逆转录病毒生命周期中必不可少的一步是将病毒基因组整合到宿主基因组中1病毒酶整合酶（IN）催化病毒DNA基因组两端与宿主DNA的共价连接。在细胞感染过程中，IN是介导整合的前整合复合物的一部分。重组IN与模拟病毒DNA末端的双链DNA寡核苷酸结合后，也可将DNA整合到靶DNA中。 体外2一种常见的整合检测方法 体外 利用超螺旋质粒作为靶DNA。两个病毒DNA寡聚体（vDNA）同时整合到质粒中，产生线性产物，该过程称为协同整合。图2A）。整合实验 体外 也可能产生仅有一个vDNA共价连接到靶质粒上的产物，形成松弛环状结构。这种单侧位点整合产物似乎是实验检测中的一种假象。 体外.

重组IN与vDNA可介导整合 体外，但当单体IN会遮蔽相关可视化时，它们并不是研究整合复合物动态或结构的理想试剂。纯化的整合复合物，或 "整合体（intasomes）是进行动态单分子分析或结构研究所需的复合物。PFV整合酶（IN）与病毒DNA（vDNA）可通过透析法从相对高盐浓度缓冲液逐步转移至低盐浓度缓冲液中进行组装。3,4透析过程中会形成沉淀物。将该沉淀物从透析液中取出，并提高盐浓度。较高的盐浓度可使含有PFV整合体（intasomes）的沉淀物重新溶解。随后通过尺寸排阻色谱法（SEC）纯化整合体。已有研究表明，重组原型泡沫病毒（prototype foamy virus, PFV）整合酶（IN）在浓度高达225 µM的溶液中以单体形式存在。5SEC 分离可有效将 PFV 整合体（225.5 kDa，包含一个 PFV IN 四聚体和两条病毒 DNA）与单体 PFV IN（44.4 kDa）及游离病毒 DNA（24.0 kDa）分离开。PFV 整合体可冷冻保存，在 -80 ˚C 下至少可维持六个月的整合活性。

重组的PFV整合体也可进行修饰，以包含IN氨基酸替换或截短突变，或使用荧光染料或生物素标记的vDNA4,6。纯化的PFV整合体可在体外有效地将病毒DNA整合到超螺旋质粒靶DNA中。in vitro条件下，利用整合体进行的大规模生化整合实验可用于检测IN突变、IN抑制剂或其他化学添加剂的影响。生物素标记的整合体可用于探测其与核酸或蛋白质的亲和性。PFV整合体在常温下具有功能活性，因此可利用磁镊单分子显微技术测量两个vDNA末端连接之间的时间间隔，或通过全内反射荧光显微技术观察整合体在靶DNA上的搜索过程6。此外，PFV整合体是首个被解析出结构的整合体，对逆转录病毒整合领域产生了重大影响3。

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方案

1. vDNA的退火

  1. 在最终体积为1.5 mL的体系中混合1× TEN缓冲液（10× TEN储备液：100 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 M NaCl，10 mM EDTA）、10 µM Oligo 1（5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3'，100 µM储备液）和10 µM Oligo 2（5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3'，100 µM储备液）。将混合物分装至六十个0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中，每管25 µL。
    注意：根据具体应用，可在Oligo 2的5'端修饰荧光染料或标签，或在Oligo 1的5'端第13个碱基处引入内部氨基-T修饰。修饰后的寡核苷酸应在退火前通过高效液相色谱（HPLC）纯化。我们发现，在Oligo 2的5'端标记Cy3或Cy5荧光染料会使整合体组装效率降低10倍，而内部荧光标记则不会影响组装效率。
  2. 使用热循环仪进行退火，程序如下：94.0 ˚C保持3分钟，1个循环；随后进行99个循环，每个循环包括94.0 ˚C保持1分钟、93.6 ˚C保持1分钟，每个循环的两个温度均递减0.8 ˚C（最后一个循环为14.8 ˚C保持1分钟，14.4 ˚C保持1分钟），最后在4.0 ˚C保存。
  3. 合并全部六十个PCR管中的退火反应产物。取500 µL样品分别加入两个0.5 mL、截留分子量为3 kDa的超滤离心浓缩装置中。在微量离心机中以14,000 × g离心10分钟（室温），浓缩退火后的vDNA。
    注意：每个浓缩装置中的截留液体积应约为50 µL。
  4. 弃去滤过液。向每个滤膜装置中加入250 µL剩余的退火vDNA。重复离心并弃去滤过液。用450 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）洗涤三次，完成缓冲液置换。
  5. 将滤膜装置倒置，在室温下以1,000 × g离心2分钟。每个滤膜装置的最终截留液体积应约为50 µL。合并所有截留液，并转移至1.5 mL螺口管中。
  6. 测定vDNA在260 nm处的紫外（UV）吸光度。利用该数值计算最终的摩尔浓度。该vDNA的消光系数（ε260）为622,803 cm-1 M-1，分子量为23,972 Da。储存于-20 ˚C。

2. 整合体组装

  1. 若条件允许，应在带有可调温控系统的较小房间内进行整合体（intasome）组装。将温控系统调节至约 18–22 ˚C。
    注意：根据我们的经验，在 4 ˚C 下进行整合体组装效率较低。
  2. 在装有搅拌子的搅拌板上的 2 L 烧杯中，配制 1 L 透析缓冲液（20 mM Bis-tris 丙烷，pH 7.5，200 mM NaCl，2 mM 二硫苏糖醇（DTT），25 µM ZnCl2）。将缓冲液在 18–22 ˚C 环境中平衡至少 6 小时。
  3. 为组装整合体，将 50 mM Bis-tris 丙烷（pH 7.5）、500 mM NaCl、120 µM PFV IN 和 50 µM vDNA 混合，总体积为 150 µL。
    注意：PFV IN 应不含核酸酶污染活性7,8。若 PFV IN 浓度过低，无法在 150 µL 体积中达到 120 µM，则可将最终体积增至 200 µL。此步骤的关键在于维持 IN 与 vDNA 的摩尔比（2.4:1），并确保有足够的复合物可在层析过程中被观察到。
  4. 用双蒸水（ddH2O）或可获得的最高纯度水清洗一段长约 10 cm、截留分子量为 6–8 kDa 的 10 mm 透析管及夹子。夹紧透析管的一端。
    注意：操作透析管时应小心，避免实验室环境中可能的污染。
  5. 配制 15 mL 透析管冲洗缓冲液（50 mM Bis-tris 丙烷，pH 7.5，500 mM NaCl）。用 1–2 mL 冲洗缓冲液重复冲洗透析管内部三次。使用移液器和细长的凝胶上样枪头尽可能吸除残留冲洗液。
  6. 如有需要，使用洁净的剃刀刀片或解剖刀裁切透析管，以便细长的凝胶上样枪头能够触及管底。
  7. 使用移液器和细长的凝胶上样枪头，将第 2.3 步中组装的整合体转移至透析管中。夹紧透析管开口端，尽量减少管内引入的空气量。将透析管放入透析缓冲液中。
  8. 在轻柔搅拌条件下透析过夜（16–20 小时），使透析管旋转但不形成涡流。确保透析管完全浸没且可自由移动。约一小时后，可观察到透析管内出现可见沉淀。
    注意：若使用 Cy3 或 Cy5 荧光标记的 vDNA，沉淀现象更为明显。无论是末端标记还是内部标记的荧光 vDNA，均呈现此现象。

3. 整合体溶解

  1. 在干净的表面上，使用新的剃刀或手术刀片从200 µL枪头末端切去2-4 mm，制备两个宽口移液枪头。
    注意：这些枪头将在步骤3.3和3.5中使用。
  2. 将透析管从透析缓冲液中取出。为防止夹子附近管端残留的透析缓冲液稀释整合体样品，使用带有细小枪头的微量移液器移除任何过量的透析缓冲液。然后从透析管的一端移除夹子。
  3. 使用步骤3.1中的宽口移液枪头，将包含透析管内沉淀物的样品转移至冰上的1.5 mL离心管中。记录回收物质的总体积；通常总体积约为~140 µL。
  4. 含沉淀物的样品当前NaCl浓度为200 mM；通过加入适量的5 M NaCl储备液，将盐浓度提高至终浓度320 mM NaCl。例如，对于150 µL样品，加入3.9 µL 5 M NaCl和1.1 µL ddH2O，终体积为155 µL。将装有样品的冰桶转移至4 ˚C冷藏室中。
  5. 使用步骤3.1中的宽口移液枪头，通过移液操作重悬并溶解沉淀物。每20分钟重复一次，至少持续1小时。观察发现大部分沉淀物应进入溶液。
    注意：当观察到沉淀物在不同时间点之间不再明显减少时，即可停止通过移液进行重悬操作。当vDNA未标记或内部标记时，根据目视评估沉淀物减少约90%。而对于Cy5末端标记的vDNA，沉淀物仅减少约20%；带有荧光标记末端vDNA的大部分沉淀物不会溶解。实际可有效溶解的沉淀物量存在差异，应通过实验确定。

4. 整合体纯化

  1. 配制 250 mL 尺寸排阻色谱（SEC）运行缓冲液（20 mM Bis-tris 丙烷，pH 7.5，320 mM NaCl，10% 甘油）。使用 0.2-µm 滤器对缓冲液进行无菌过滤，并于 4 ˚C 保存。
    注意：所有纯化步骤均在 4 ˚C 冷室中进行。
  2. 使用 SEC 运行缓冲液以 0.4 mL/min 的流速平衡交联琼脂糖 SEC 色谱柱（直径 = 10 mm；长度 = 300 mm；柱床体积 = 24 mL；上样体积 = 25 - 500 µL；最大耐压 = 1.5 MPa；排阻极限 = 4 × 107 Da；可分离分子量范围为 5 至 5,000 kDa，参见材料表）。
    注意：若其他尺寸排阻色谱柱能够有效分离 300 kDa 与 44 kDa 的组分（例如 Superose 12 10/300 GL 或 Superose 6 Increase），也可用于本纯化流程。Superose 12 10/300 GL 分辨率较低，导致峰重叠较多；而 Superose 6 Increase 分辨率更高，可实现更佳的分离效果。
  3. 将整合体样品在微量离心机中以 14,000 × g 在 4 ˚C 离心 10 分钟，以沉淀任何残留的不溶物。小心移除上清液，并将上清液转移至可容纳约 200 μL 的 200 µL 进样环（管路）。将样品上样至 SEC 色谱柱。
    注意：较小的上样体积有助于提高 SEC 的分辨率。
  4. 用 25 mL SEC 运行缓冲液进行洗脱，共收集 95 个馏分，每份 270 µL。观察 SEC 洗脱图谱，可见三个 A280/A260 吸光度峰（图 1）。
    注意：第一个峰应为聚集体（洗脱体积约为 9.0 - 11.5 mL），随后是 PFV 四聚体整合体峰（洗脱体积约为 12.0 - 14.75 mL），以及 PFV IN 单体与游离病毒 DNA（vDNA）峰（洗脱体积约为 15.0 - 18.0 mL）。

5. 整合链转移实验、组分筛选与保存

  1. 将2 µL每种intasome峰组分与50 ng 3 kb超螺旋质粒DNA（储存浓度为50 ng/µL）加入反应缓冲液（10 mM Bis-tris丙烷，pH 7.5，110 mM NaCl，5 mM MgSO₄）中混合4，4 µM ZnCl2，10 mM DTT）中，终反应体积为15 µL。37 ˚C孵育5分钟。
  2. 设置一个未添加PFV整合体的阴性对照。加入0.75 µL蛋白酶K（20 mg/mL储存液）和0.75 µL SDS（10%储存液）以终止反应。在55 ˚C孵育1小时。根据需要将样品储存于-20 ˚C，以备后续分析。
    注意：本实验是对整合活性的定性评估。在进行本实验前，未测定各组分中intasome的摩尔浓度。用于整合链转移实验的组分可置于冰上保存（包括过夜保存），直至确认整合活性并选取所需组分进行分装。本实验中使用pMP2，一种pUC19衍生物。9我们还成功使用了5.4 kb的质粒pcDNA 3.1。任何可解离为松弛环状、线性和超螺旋形式的质粒均可作为整合的靶标。
  3. 配制120 mL含0.1 μg/mL溴化乙锭（EtBr，10 mg/mL储存液）的1%质量体积比（w/v）琼脂糖凝胶，使用1×TAE缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA）10将琼脂糖溶液融化后倒入15 cm × 10 cm的凝胶制备板中。插入一个带有15个孔、孔宽5 mm、厚度0.75 mm的梳子。
    注意：与1.5 mm厚的加样孔相比，较窄的加样孔可获得更好的条带分辨率。
  4. 让凝胶在室温下凝固。将凝胶浸入含0.1 μg/mL EtBr的1X TAE缓冲液中。
  5. 向5.2步骤中的每个整合反应体系中加入3 µL 50%甘油。将全部反应体积上样至凝胶。在样品两侧的泳道中各加入1 µL 10 kb DNA分子量标记物（储存浓度为150 ng/µL）；即DNA分子量标记物应位于样品泳道的两侧。
  6. 在外侧泳道中加入 6 µL 橙G染料（0.25% 橙G，30% 甘油）。以恒定电压 10 V/cm（100 V）在室温下电泳 1 小时，或直至橙G染料前沿迁移至凝胶末端。
  7. 立即使用荧光扫描仪对琼脂糖凝胶成像，扫描仪设置为检测溴化乙锭（激发波长532 nm，发射滤光片610 nm）。若使用了荧光染料标记的vDNA，则还需采用相应的荧光染料设置进行成像。
    注意：例如，检测Cy5标记的DNA时，应使用633 nm激发光和670 nm发射光滤光片进行成像。协同整合产物（CI，线性DNA）的迁移位置应与约3 kb的大小相符，未反应的超螺旋质粒（SC）迁移较快（约2 kb），半位点整合产物（HSI，松弛环状DNA）迁移较慢（约3.5 kb）。未反应的vDNA应按其实际大小迁移，约为40 bp。
  8. 使用成像软件对每条带进行定量分析7计算每条泳道中CI、HSI或SC形式DNA所占的比例；vDNA不包含在此计算中。
    注意：整合效率，即超螺旋DNA（SC）转化为线性产物的比例，通过将协同整合产物（CI）的像素体积除以三条带（HSI+CI+SC）的总像素体积来计算。如果整合体（intasomes）带有荧光标记，HSI和CI产物也可通过荧光信号进行定量。
  9. 选择具有最强协同整合活性的组分。
    注意：根据我们的经验，协同整合活性的峰值与鉴定为四聚体PFV整合体的蛋白峰一致。测量A280 各组分的浓度，并计算最终的整合体浓度。ε280 对于本文所述的含有两个vDNA的野生型PFV IN四聚体，其沉降系数为908,339 cm-1M-1 分子量为225.5 kDa。浓度变化应与SEC色谱峰及链转移实验中的模式一致。
  10. 将每份组分以5 µL分装，液氮速冻。分装样品于-80 ˚C保存。用于储存的组分浓度通常为200 - 600 nM。

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结果

PFV整合体由重组的IN蛋白和vDNA组装而成。组装完成后，通过SEC对整合体进行纯化（图1）。使用超螺旋DNA作为靶标，并通过琼脂糖凝胶电泳检测各组分的整合活性（图2）。该凝胶使用荧光扫描仪成像，检测EtBr（若使用了荧光标记的vDNA，则同时检测荧光基团）。利用图像分析软件，可通过条带的像素体积计算整合效率（图3）。将整合效率最高的组分迅速冷冻，以备后续使用。冷冻的组分可保持整合活性（图4），从而实现组装后整合体的长期保存。任何标记分子及其在vDNA中的位置均可能影响整合体的组装效率（图5）。

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讨论

逆转录病毒整合酶（IN）与病毒基因组DNA形成多聚体复合物，以执行整合功能并延续病毒生命周期。每个整合体（intasome）中的IN单体数量可能是四聚体、八聚体，或更高阶的多聚体11,12,13,14。PFV整合体是由重组IN蛋白与模拟病毒基因组DNA末端的双链DNA寡核苷酸组成的四聚体复合物3。 这类整合体已被用于结构与动力学研究3,5,13,14。

PFV整合体的组装是在从相对高盐浓度缓冲液透析至低盐浓度缓...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 AI099854 和 AI126742，授予 KEY。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DNA 寡核苷酸IDTN/A定制 DNA 寡核苷酸
Tris 超纯级Gojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器Sigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa 截留分子量
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS 丙烷，>=99.0%（滴定法）Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
甘油Thermo Fisher ScientificG37-20
凝胶加样枪头，1 - 200 μLCorningCLS4853-400EA
剃刀刀片；单刃；100 支/包；每包 100 片Fisher Scientific12-640
带 PES 膜的无菌一次性滤器，> 250 mLThermo Fisher Scientific568-0020
透析管夹Spectrum Labs132734
6-8 kDa，10 mm 透析管Spectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517201
高分辨率标准琼脂糖AGTC BioproductsAG500D1
溴化乙锭Thermo Fisher ScientificBP1302
橙色 GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb，500 泳道Denville ScientificCB4225-4

参考文献

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