MALDI 质谱法测定小鼠组织提取物蛋白酶特异性: 操作 PH 值导致特异性改变

摘要

在这里, 我们提出了一个协议, 以确定蛋白酶特异性的粗鼠组织提取物使用 MALDI 的光谱。

摘要

蛋白酶具有多种生物学功能, 包括蛋白质活化/失活和食物消化。鉴定蛋白酶特异性对揭示蛋白酶功能具有重要意义。本研究提出的方法通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱法测定独特基质的分子量来确定蛋白酶的特异性。基体中含有 iminobiotin, 而劈裂部位由氨基酸组成, 间隔由聚乙二醇组成。被劈裂的基底将产生一个独特的分子量, 使用裂解氨基酸。该方法的优点之一是可以用粗样品在一锅中进行, 也适用于多种样品的评估。在本文中, 我们描述了一个简单的实验方法优化, 从小鼠肺组织提取的样本, 包括组织抽取, 消化基质的放置到样品, 消化基质的纯化在不同的 pH 条件下, 用 MALDI 质谱法测定基质的分子量。总之, 这项技术可以识别的蛋白酶特异性从组织提取物中获得的 MALDI 的质谱, 可以很容易地扩大到多样本处理。

引言

蛋白酶通过裂解蛋白质调节生理过程, 并且在特定时间和地点启动蛋白酶活性的调控¹。因此, 确定局部调节组织的表达和活性是很重要的, 并开发一种新的检测蛋白酶的方法。本研究提出的方法旨在鉴别蛋白酶的特异性, 同时检测蛋白酶。

有几种检测蛋白酶特异性的方法。azocasein 方法在检测蛋白酶²中是众所周知的, 但在获取进一步信息的能力方面是有限的。酶谱法是另一种综合的蛋白酶检测方法, 可用于测定蛋白酶的分子^量3, 但它不能用于检查基底特异性。蛋白酶特异性可以通过光谱分析, 使用 nitroanilide⁴的基质, 和荧光化验, 使用香豆素基底⁵或荧光共振能量转移 (烦恼) 化验⁶。这些方法使单个井中所含基底的单特异性检测得以实现。本研究在不同条件下考察组织提取物的蛋白酶特异性, 因为这些萃取物含有多种蛋白酶。蛋白酶活性受多种因素的制约, 包括 pH 值、辅、假体组和离子强度。近年来, 蛋白质组学方法已被用于鉴定蛋白酶特异性;例如, 由 Biniossek et al报告的方法。⁷使用蛋白质组来确定基材的特异性, 即使是在粗提取物中, 也可以精确地测定识别多个氨基酸序列⁸的蛋白酶的裂解活性。但是, 这种方法不适合对大量样品进行分析。相比之下, 我们的方法可以同时处理多个样本, 利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱进行样品分析, 便于快速、简便地检测出基质。

本文概述了用 MALDI 质谱法测定蛋白酶特异性的方法, 以测量独特基质的分子量。在图 1和表 1中显示了被切割基底的分子形式以及它们的理论分子权重。以前的研究使用了含有 polyglycine 间隔和生物素⁹的基质;然而, 这些基质是有缺陷的, 因为 polyglycine 序列可能会由识别甘氨酸序列的酶所切割。此外, 亲和和生物素之间的高度亲和性可能导致回收率低。为了改善这些缺点, 我们在本研究中合成了一种独特的基质, 它由聚乙二醇 (PEG)、iminobiotin 和氨基酸组成, 它可以识别出裂解部位 (图 1)。为了区分相似分子量的氨基酸, 在 PEG 间隔与氨基酸在劈裂部位添加 d-丝氨酸。

该基板的 N 端被标记为 iminobiotin, 这使得从粗样品中进行亲和纯化。使用 iminobiotin 而不是生物素是至关重要的;生物素与亲和有很强的亲和性, 这导致亲和树脂的生物素标记基质的回收率较低, 而 iminobiotin 对亲和的亲和性可以通过 pH 值来改变。在 ph 值为9的条件下, Iminobiotin 标记的基板将绑定到亲和, 而亲和在 4 ph 值以下的条件下释放 Iminobiotin 标记的基底。因此, iminobiotin 用于亲和纯化¹⁰。总之, 我们描述了一个详细的协议, 以检测蛋白酶特异性使用独特的基质。

方案

日本制药大学伦理委员会批准了动物实验协议, 并按照日本制药大学实验室动物的护理和使用指导方针进行。该协议已被调整的组织提取物从代表的小鼠。小鼠是从日本的公司购买的。

1. Iminobiotin 标记衬底的制备

基板采用 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 基团 (芴甲氧羰基) 保护的氨基酸进行固相合成, 如下¹¹所述。使用表 2确定所用的芴甲氧羰基化合物, 这取决于所需的氨基酸和合成阶段。

1. 将0.2 克芴甲氧羰基-NH-萨尔树脂与10毫升 n-, n-甲基酰胺 (DMF) 在合成柱上。
2. 在 DMF 中加入5毫升30% 哌啶。岩石的解决方案为10分钟, 以切割 n-芴甲氧羰基基团。
3. 检查 n-芴甲氧羰基裂解与硝基苯酸 (TNBS) 测试¹²: 添加10µL 1% TNBS 在 DMF 和10µL (diisopropylethylamine) 到 10 x 75 毫米²玻璃管, 然后转移到玻璃管的少量树脂。n-芴甲氧羰基裂解树脂应发展为橙色的颜色。
   1. 如果此结果为负值, 请重复步骤 1.2-1.3。
4. 用5毫升的 DMF 洗涤树脂三倍。
5. 添加5毫升的 DMF, 其中含有0.3 毫摩尔的芴甲氧羰基化合物, 列于表 2 (从阶段1中使用的化合物开始), 0.3 毫摩尔 (6-氯-1 h benzotriazol-1 基)-n, n, n ', n-'-tetramethyluronium 六氟磷酸盐 (HCTU), 0.3 毫摩尔 1-Hydroxy-1H-benzotriazole, 一水合物 (对 hobt) 和0.6 毫摩尔 diisopropylethylamine (DIPEA)。岩石的解决方案为30分钟与树脂夫妇。
   1. 使用 TNBS 测试检查此步骤。如果结果是肯定的, 这意味着反应没有足够的进展, 这一步必须重复。
6. 用5毫升的 DMF 洗涤树脂三倍。
7. 重复步骤 1.2-1.6, 改变在步骤1.5 中使用的芴甲氧羰基化合物, 根据表 2, 重覆伸长反应。
8. 在三氟乙酸酸中加入1毫升2.5% 水, 1% triisopropylsilane (TIS) 和 2.5% ethanedithiol (EDT), 以从树脂和保护基团中切割多肽。岩石解决方案为60分钟。
9. 过滤, 并收集滤液在一个50毫升管。
10. 加入40毫升的冷二乙醇, 并在-20 摄氏度隔夜贮存。
11. 离心机 4000 x g 在-20 °c 为30分钟收集颗粒。
12. 用干燥 3 h 去除二乙基醚。
13. 加入1毫升50% 乙腈水, 溶解粗肽。Lyophilize 去除三氟乙酸酸的溶液。重复此步骤几次。
14. 使用 C18 墨盒柱纯化多肽。
    1. 使用3毫升乙腈 (ACN) 激活 C18 墨盒柱上的树脂。
    2. 平衡与5毫升 5% ACN, 0.1% TFA 在 H₂O。
    3. 将粗合成肽装入 C18 墨盒柱中。
    4. 用10毫升 5% ACN, 0.1% TFA 在 H₂O 洗涤。
    5. 洗脱3毫升 60% ACN, 0.1% TFA 在 H 2 O 中的样品.
15. 用 MALDI 质谱法测定其分子量, 检查肽的含量。
    1. 在靶板上用吸管1µL 淋洗。在50% 乙腈中立即加入饱和α氰基-4-肉桂酸 (CHCA) 溶液, 0.1% 三氟乙酸酸
    2. 空气干燥使混合物结晶。
    3. 根据仪器制造商的协议获取样品的质谱。
       1. 手动将 MALDI 质谱仪设置为正反射模式。
       2. 用 CHCA、缓激肽片段 1-7 (monoisotopic 分子量 = 756.3997 Da) 和血管紧张素 II (monoisotopic 分子量 = 1045.5423 Da) 校准质谱仪。
       3. 获得合成肽的质谱, 然后通过与理论分子量的比较进行评价。

2. 组织提取物的制备

1. 麻醉在异氟醚吸入腔内的雄性小鼠, 并通过脚趾捏检查麻醉深度。弄死颈椎脱位对小鼠进行了实验。
2. 使用剪刀, 使中线腹部切口通过皮肤延伸到剑突过程。
3. 切开隔膜, 收集所有肺组织。把纸巾切成小块。
4. 用冰冷的50毫米三缓冲盐水冲洗组织三次 (pH 7.4)。
5. 重量的组织和转移约100毫克的组织到 12 x 75 毫米²玻璃管。
6. 加入0.3 毫升的萃取缓冲器 (50 毫米三缓冲器, pH 7.4, 含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚)。
7. 用混合均质器融汇肺组织样品。
   1. 把样品放在冰上冷却。
   2. 融汇的样品在 2万 rpm 三十年代在搅拌机。重复此步骤, 直到样品完全均匀。
      注: 不要连续融汇超过1分钟, 以避免温度升高。
8. 将匀浆1000µL 到1.5 毫升管和离心机5分钟, 在 1万 x g 处4摄氏度。
9. 将上清的500µL 转移到一个新的1.5 毫升塑料管上。
10. 使用10µL 的样品, 以确定蛋白质浓度, 使用的方法, 如二辛可宁酸 () 或考马斯灿烂的蓝色 (CBB) 方法。
11. 为防止冷冻, 在样品中加入80% 甘油, 最终浓度为50% 甘油。
12. 将样品保存在-80 摄氏度, 直到进一步使用。

3. 蛋白酶和组织提取物中基质的消化

1. 添加10µL 0.1 µg/µL 的 n-甲苯磺酰基-l-苯丙氨酸氯甲基酮 (TPCK)-胰蛋白酶, 0.1 µg/µL 金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶, 或10µg/µL 的组织提取成890µL 的消化缓冲。
   1. 为了澄清蛋白酶特异性的差异取决于 ph 值, 使用缓冲调整到 ph 值 3, 5, 7 和9。消化缓冲的组成在表 3中显示。
   2. 用非活性蛋白酶在组织提取物中进行阴性对照, 在沸水中孵化 (或加热100摄氏度) 进行10分钟。
2. 添加10µL 的 iminobiotin 标记基底 (溶解在二甲基亚砜 (亚砜), 最终浓度 = 100 pmol/10 µL)。
3. 孵育3小时在37°c 消化 iminobiotin 标记的底物。
4. 孵化后, 用沸水停止底物的消化 (或以100摄氏度加热) 10 分钟。
5. 在4摄氏度的 1万 x g 处离心消化基质5分钟。
6. 将上清液转移到新的1.5 毫升管中。

4. Iminobiotin 标记衬底的纯化

1. 添加50µL 50% 链亲和素琼脂糖珠在1米三缓冲 (pH 9) 包含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚。
   1. 使用 ph 值测试纸确保溶液在 ph 值9左右。如果溶液的 ph 值较低, 则通过加入1米的三缓冲 (ph 9) (含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚), 将其调整到大约 ph 值9。这一步很重要, 因为它涉及到将 iminobiotin 标记的基板绑定到链亲和素。
2. 在4°c 一夜之间孵化, 在旋转轮上连续的温和混合, 将 iminobiotin 标记的基板绑定到链亲和素。在孵化过程中, 珠子应该保持悬浮状态。
3. 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c。移除上清。
4. 洗涤珠五倍如下:
   1. 添加1000µL 的洗涤缓冲器 (50 毫米的三缓冲器, pH 9) 的珠子。
   2. 清洗10分钟在4°c 与连续温和的混合在一个转子车轮上。在孵化过程中, 珠子应该保持悬浮状态。
   3. 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c 和去除上清。
5. 添加100µL 0.2% 三氟乙酸酸的珠子。
   1. 使用 ph 值测试纸确保溶液低于 pH 值2。如果溶液的 ph 值高, 则通过加入1% 三氟乙酸酸将 ph 值调整到低于2。
6. 在室温下孵育30分钟, 在旋转轮上连续温和搅拌。
7. 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c, 然后转移上清到一个新的1.5 毫升管子。

5. 样品制备和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (MALDI 质谱)

注: 以下步骤中的所有解决方案均应采用高效液相色谱 (HPLC) 级或氨基酸序级水来制备。

1. 将乙腈500µL 到 C18 树脂上活化。取出二手乙腈。重复此步骤三次。
2. 平衡 C18 树脂, 100 µL 0.1% 三氟乙酸酸。删除淋洗。重复此步骤三次。
3. 要装载样品, 用吸管将样品与树脂粘合。
4. 用20µL 0.1% 三氟乙酸酸清洗树脂。重复此步骤五次。
5. 洗脱样品与3µL 60% 乙腈在0.1% 三氟乙酸酸。将淋洗在靶板上进行 MALDI 质谱测定。立即加入饱和α氰基-4-肉桂酸 (CHCA) 溶液在50% 乙腈0.1% 三氟乙酸酸。
6. 空气干燥使混合物结晶。
7. 根据仪器制造商的协议获取样品的质量谱。
   1. 手动将 MALDI 质谱仪设置为正反射模式。
   2. 用 CHCA、缓激肽片段 1-7 (monoisotopic 分子量 = 756.3997 Da) 和血管紧张素 II (monoisotopic 分子量 = 1045.5423 Da) 校准质谱仪。
   3. 获取样品的质谱, 密切关注质谱从700到 900 Da 为生物素标记基质的劈裂形式。
8. 使用表 1标识检测到的峰值。适当分子量的检测表明, 在相关氨基酸的 C 终点处有裂解。

结果

模型蛋白酶鉴定蛋白酶特异性方法的评价

利用 TPCK 胰蛋白酶和 V8 蛋白酶对该系统的效率进行了评价, 得到了基体的特异性。TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶被估计为在赖氨酸和精氨酸残留物的 C 末端, 以及天门冬氨酸和谷氨酸残留物的羧基端, 分别对氨基酸序列进行劈裂。表 1显示了基板的理论分子量和由特定蛋白酶劈裂的消化片段。基片消化使用 TPCK-胰蛋白酶产生的切割碎片, 其中两个可以检测到 839.81 da 和 796.76 da (图 2A)。这些片段的分子量与赖氨酸和精氨酸 C 末端的片段的理论分子权重密切相关。此外, V8 蛋白酶将前体基质转化为其劈裂形态, 其分子量为 769.78 da 和 755.62 da (图 2B), 分别与谷氨酸和天门冬氨酸的理论 m-/z 相匹配。结果表明, 该...

讨论

本协议采用 MALDI 质谱法对组织提取物中的粗样品中的蛋白酶特异性进行识别, 并可方便地进行多样本加工。特别是, 我们操纵 pH 值导致基材特异性的改变。

亲和生物素复合物 (ABC) 方法在生物化学中得到了广泛应用, 其结合特异性, 在我们的协议中得到了应用。由于 ABC 的强烈亲和力, 亲和对生物素的约束几乎是不可逆转的。因此, 对 abc 的亲和纯化效率极低。因此, 我们报告说, 生物素标记的基质的回收率是低的。在本研究中, 我们只用低 pH 值洗脱;然而, deglycosylated 亲和树脂¹³或单体亲和树脂¹⁴也可用于纯化生物素标记的基质。

本研究提出的方法可以根据不同的实验系统和应用进行调整;铭记 MALDI 质谱仪无法进行定量分析。一旦确定了基材的特异性, 就可以更好地使用光谱测定法、荧光分析仪或荧光共振能量转移 (烦恼) 进行量化。

质谱的标定是本协议中最...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fmoc-NH-SAL树脂（-[2,4-二甲氧基苯基-N-（9-芴基甲氧基羰基） 氨基甲基]苯氧基树脂）	渡边化学株	A00102
N，N-二甲基甲酰胺 （DMF）	Watanabe Chemical Co.， Ltd.	A00185
哌啶	Watanabe Chemical Co.， Ltd.	A00176
三硝基苯磺酸 （TNBS）	WAKO Chemical	209-1483
O-（6-氯-1H-苯并三唑-1-基）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU）	渡边化学株式会	A00067
1-羟基-1H-苯并三唑，一水合物（HOBt）	渡边化学有限公司 Watanabe Chemical Co.， Ltd.	A00014
二异丙基乙胺 （DIPEA）	渡边化学株式会社 Watanabe Chemical Co.， Ltd.	A00030
三异丙基硅烷 （TIS）	渡边化学株式会	A00170
乙二硫醇 （EDT）	Watanabe Chemical Co.， Ltd.	A00057
三氟乙酸 （TFA）	Millipore	S6612278 403
乙腈	国产化学	2153025
C18 小柱	沃特世	WAT051910
聚（氧乙烯）辛基苯醚	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
混合均质器	Kinematica	PT3100	Polytron 均质器
考马斯亮蓝 （CBB） -G250	Nakarai Chemical	094-09
甘油	Nakarai Chemical	170-18
N-甲苯基-L-苯丙氨酸氯甲基酮 （TPCK）-胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T1426
二甲基亚砜 （DMSO）WAKO	Chemical	043-07216
链霉亲和素琼脂糖凝胶	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
&α;-氰基-4-羟基肉桂酸 （CHCA）	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF 质谱法	Bruker Daltonics， Germany	autoflex
2-亚胺生物素	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-氨基酸	Watanabe Chemical Co.， Ltd.