本文介绍了一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF）测定粗鼠组织提取物中蛋白酶特异性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白酶具有多种生物学功能，包括蛋白质的激活/失活以及食物消化。确定蛋白酶的特异性对于揭示其功能至关重要。本研究提出的方法通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法测定特异性底物的分子量，从而确定蛋白酶的特异性。该底物包含氨基生物素，其被切割位点由氨基酸组成，间隔序列由聚乙二醇构成。当底物被特定氨基酸残基切割后，将产生具有独特分子量的片段。该方法的优点之一是可在单个反应体系中直接使用粗提样品，并适用于多个样品的并行分析。本文描述了一种经过优化的简易实验方法，所用样品提取自小鼠肺组织，包括组织提取、将消化底物加入样品、在不同pH条件下纯化消化后的底物，以及利用MALDI-TOF质谱法测定底物分子量。总之，该技术可利用MALDI-TOF质谱法在组织粗提物中鉴定蛋白酶的特异性，且易于扩展用于高通量的多样品处理。
引言
蛋白酶通过切割蛋白质来调控生理过程，而蛋白酶活性在特定时间和空间上的启动受到调控1。因此，确定在局部受调控的组织中蛋白酶的表达与活性至关重要，并且需要开发一种检测蛋白酶的新方法。本研究提出的方法旨在在检测蛋白酶的同时，平行鉴定其底物特异性。
检测蛋白酶特异性有多种方法。偶氮酪蛋白法因其在蛋白酶检测中的应用而广为人知2，但在获取进一步信息方面存在局限性。Zymography 是另一种全面的蛋白酶检测方法，可用于确定蛋白酶的分子量3，但无法用于研究底物特异性。蛋白酶特异性可通过分光光度法测定，例如使用对硝基苯胺（p-nitroanilide）类底物4；也可通过荧光测定法，使用香豆素类底物5或荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）检测法6。这些方法可在单个孔中实现对单一底物特异性的检测。在本研究中，我们在不同条件下检测组织提取物中的蛋白酶特异性，因为这些提取物含有多种蛋白酶。蛋白酶活性受多种因素调控，包括 pH、辅酶、辅基和离子强度。近年来，基于蛋白质组学的方法已被用于鉴定蛋白酶特异性；例如，Biniossek et al....
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方案
动物实验方案已获日本药科大学伦理委员会批准，并依照日本药科大学《实验动物护理与使用指南》进行。该方案已针对ICR 小鼠来源的组织提取物进行了调整。ICR小鼠购自日本Nippon SLC有限公司（静冈，日本）
1. 亚氨基生物素标记底物的制备
底物采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的氨基酸进行固相合成，具体方法如下所述11。根据目标氨基酸及合成阶段，参考表2确定所用的Fmoc化合物。
- 在合成柱中，用 10 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）冲洗 0.2 g Fmoc-NH-SAL 树脂。
- 加入 5 mL 含 30% 哌啶的 DMF 溶液。振荡反应液 10 分钟，以切除 Fmoc 保护基团。
- 使用三硝基苯磺酸（TNBS）检测 Fmoc 去保护效果12：取 10 µL 1% TNBS 的 DMF 溶液和 10 µL 二异丙基乙胺（DIPEA）加入一支 10 × 75 mm2 玻璃试管中，然后转移少量树脂至该试管。若 Fmoc 已被成功切除，树脂应呈现橙色。
- 若检测结果为阴性，则重复步骤 1.2–1.3。
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结果
利用模式蛋白酶评估蛋白酶特异性鉴定方法
通过使用底物特异性已知的 TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶，对该系统的效率进行了评估。TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶分别预计在赖氨酸和精氨酸残基的羧基端，以及天冬氨酸和谷氨酸残基的羧基侧切割氨基酸序列。表 1 显示了由特定蛋白酶切割的底物及其消化片段的理论分子量。使用 TPCK-胰蛋白酶对底物进行消化后产生了可检测的片段，其中两个片段的分子量分别为 839.81 Da 和 796.76 Da（图 2A）。这些片段的分子量与分别从赖氨酸和精氨酸残基羧基端切割产生的片段的理论分子量高度一致。此外，V8 蛋白酶将前体底物转化为其切割产物，分子量分别为 769.78 Da 和 755.62 Da（图 2B），与谷氨酸和天冬氨酸残基的理论 m/z 值相符。这些结果表明，该.......
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讨论
本方案采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF质谱）鉴定来源于组织提取物的粗提样品中蛋白酶的特异性，并可轻松扩展用于多个样品的高通量处理。特别地，我们通过调节pH值来诱导底物特性的改变。
由于亲和素-生物素复合物（ABC）方法具有结合特异性，已在生物化学领域广泛应用，因此本实验方案采用了该方法。由于ABC具有很强的亲和力，亲和素与生物素的结合几乎不可逆，因此针对ABC的亲和纯化效率极低。基于此原因，我们预计生物素标记底物的回收率会较低。在本研究中，我们仅使用低pH条件进行洗脱；然而，去糖基化的亲和素树脂13或单体亲和素树脂14也可用于纯化生物素标记的底物。
本研究提出的方法可根据不同的实验体系和应用进行调整；但需注意，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）无法进行定量分析。一旦确定了底物特异性，可采用光谱分析法、荧光测定法或荧光共振能量转移（FRET）进行更准确的定量。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了日本药科大学研究基金（2016年）以及日本文部科学省科学研究费补助金（MEXT KAKENHI）项目编号JP17854179的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fmoc-NH-SAL 树脂（-[2,4-二甲氧基苯基-N-(9-芴甲氧羰基) 氨甲基]苯氧基树脂） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-二甲基甲酰胺（DMF） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| 哌啶 | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| 三硝基苯磺酸（TNBS） | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-羟基-1H-苯并三唑一水合物（HOBt） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| 二异丙基乙胺（DIPEA） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| 三异丙基硅烷（TIS） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| 乙二硫醇（EDT） | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Millipore | S6612278 403 | |
| 乙腈 | 国産化学（Kokusan Chemical） | 2153025 | |
| C18固相萃取小柱 | Waters | WAT051910 | |
| 聚氧乙烯辛基苯基醚 | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| 混合型匀浆器 | Kinematica | PT3100 | polytron匀浆器 |
| 考马斯亮蓝G-250（CBB-G250） | 中和化学（Nakarai Chemical） | 094-09 | |
| 甘油 | 中和化学（Nakarai Chemical） | 170-18 | |
| N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| 链霉亲和素琼脂糖 | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA） | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF质谱分析 | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-亚氨基生物素 | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-氨基酸 | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
参考文献
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vop....
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重印与许可
