回顾性 microRNA 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 RNA 标本的互补 DNA 文库制备方案

摘要

福尔马林固定石蜡包埋的标本是人类疾病分子生物标志物的重要来源。本文介绍了一种基于实验室的cDNA文库构建方案，该方案最初针对新鲜冷冻RNA设计，并已优化用于分析储存时间长达35年的组织中存档的微小RNA（microRNA）。

摘要

——存档的、经临床分类的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织可为癌症发生发展的回顾性分子研究提供核酸。通过分析那些后续发展为侵袭性疾病的患者所采集的非侵袭性或癌前病变组织，基因表达分析可能有助于识别出易感癌症风险的早期分子改变。已有充分报道指出，从 FFPE 组织中提取的核酸经历了严重的物理损伤和化学修饰，使其分析变得困难，通常需要采用经过优化的检测方法。然而，微小 RNA（miRNA）是一类长度仅约 18–24 个核苷酸的小 RNA 分子，已被证明能够耐受长期储存，并已在 FFPE 样本中成功实现分析。本文介绍一种专为从存档组织中提取的小 RNA 分析而优化的 3' 端条形码互补 DNA（cDNA）文库构建方案，该方法在使用储存时间长达 35 年的存档临床样本时，已被证明具有良好的稳健性和高度可重复性。该文库构建方法适用于降解或质量较差样本的多重分析：可将最多 18 个 RNA 样本分别连接带有独特 3' 端条形码的接头，随后合并进行后续的酶学和生化处理，再进入分析流程。所有纯化步骤均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）完成，从而实现对条形码标记的小 RNA 物种进行特异性大小筛选和富集。该 cDNA 文库构建方法适用于极微量的 RNA 起始量，通过预实验聚合酶链式反应（PCR）可确定最佳扩增循环数，以获得适合下一代测序（NGS）的适量产物。该方法针对储存时间长达 35 年的 FFPE 降解 RNA 进行了优化，可提供高度可重复的 NGS 数据。

引言

miRNA 在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本中保存得非常完好^1,2,3先前的研究表明，利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的总RNA可有效检测这些短链调控性非编码单链RNA分子的表达水平，并且与原始新鲜组织相比，能够提供具有相关性的基因表达数据^4,5,6,7,8与大片段信使RNA相比，后者已被证实会受到福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织处理过程（甲醛、高温、干燥）的显著影响 等等。），内源性RNase以及样本保存时间的影响，miRNA的小分子尺寸（约18–24个核苷酸）使其对降解具有较强的抗性，并能在长期储存中保持稳定，这一点已在存档样本的miRNA表达研究中得到证实，其表现优于高通量mRNA研究⁹使用存档临床样本进行的miRNA表达研究大多为小规模分析，结果表明，在对这些检测方法进行优化后，可采用单重或多重定量PCR检测、不同类型的微阵列技术，以及最新发展的高通量测序（NGS）来评估保存miRNA的表达水平^{10,11,12,13,14}.

鉴于miRNA表达失调与多种人类恶性肿瘤的发生相关，且临床上可能存在大量带有注释的存档样本，这些小RNA分子已成为潜在癌症生物标志物的有前景来源^15,16,17,18。与PCR和/或微阵列等靶向技术相比，采用高通量基因表达技术（如NGS）的优势在于能够对所有miRNA转录本进行全面评估¹⁹。因此，为实现大规模回顾性研究，已优化出一种适用于从陈旧存档样本中制备小RNA的cDNA文库、经济实惠且易于操作的实验方案²⁰。

我们此前建立了一种同步提取RNA/DNA的实验方案，可分别从较陈旧的存档样本中回收RNA和DNA，其效果优于当前的商业试剂盒²¹。利用该提取方法，为从长期存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中获得总RNA，我们优化了用于高通量测序（NGS）的cDNA文库构建流程，以检测在临床样本中保存长达35年的miRNA。此外，在最近发表的一项研究中，我们从经临床分类的导管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）样本中构建了cDNA文库，鉴定出差异表达的miRNA，并通过定量PCR进行了验证。结果表明，与未发展为乳腺癌的患者相比，发生乳腺癌的患者其DCIS病灶中可能存在可检测到的特异性miRNA表达变化。

考虑到商业小RNA cDNA文库制备试剂盒的成本、可能停产的风险，以及其中受版权或专利保护而无法优化的试剂，我们决定改进一种此前发表的、基于实验室且无需试剂盒的3'端条形码cDNA文库制备方案，用于对存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的小RNA进行高通量测序，从而实现18个样本的并行分析²²本方案提供了一套理想且可靠的分步操作流程，包含可视化和技术评估检查点，这些对于适配福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本至关重要，并具有广泛应用于其他降解或难处理RNA材料的潜力。通过以荧光标记替代原方案中的放射性标记分子量标准，显著提升了原方案的适用性。例如，SYBR Gold）在大型聚丙烯酰胺凝胶上筛选连接文库时所用的可检测RNA大小标记物。该优化方案依赖于将3'端条形码接头连接至18个独立的FFPE RNA样本，随后将这些样本混合，进行5'端接头连接、逆转录以及小规模PCR分析，以针对最终cDNA文库进行定制化扩增，再进行大规模PCR扩增、纯化，并在高通量测序仪上进行NGS分析。

方案

1. 所有试剂和引物的准备

1. 按照图1所述订购所有引物和接头。
2. 制备校准品混合物原液，该原液将被加入到每个单独的连接反应中。
   1. 用无RNase的水将载体寡核苷酸（图1）重悬至0.5 µM。使用0.5 µM的载体寡核苷酸溶液将10种校准寡核苷酸（图1）分别重悬至100 µM。
   2. 取每种10种校准品各10 µL，加入硅化微量离心管中，得到100 µM的校准品混合原液，并配制0.026 nM的工作溶液，于-20 °C保存。
3. 用无RNase的水将20种独特的冻干腺苷酸化3'接头稀释至终浓度为50 µM（图1）。
   注意：建议将每种接头分装为2.5 µL的等份，分别置于硅化管中，于-80 °C保存，可稳定保存长达2年。
4. 将脱盐处理的19 nt-3'接头和24 nt-3'接头大小标记寡核苷酸重悬至250 ng/mL（图1）。
5. 用无RNase的水将HPLC纯化的5'接头重悬至100 µM。使用无RNase的水将5'和3' PCR引物分别重悬至100 µM（图1）。
   注意：建议将所有寡核苷酸按单次或两次实验所需量进行分装，于-80 °C保存。
6. 通过混合98.8%甲酰胺、1%（v/v）0.5 M Na₂H₂ EDTA（pH 8.0）和0.2%溴酚蓝，制备聚丙烯酰胺变性（PAA）凝胶上样缓冲液，并将1 mL分装液于-80 °C保存。
   1. 通过将18.6 g Na₂H₂ EDTA粉末加入50 mL无核酸酶水中制备0.5 M Na₂H₂ EDTA溶液。加入NaOH颗粒调节pH至8.0，加水定容至100 mL，得到0.5 M Na₂H₂ EDTA（pH 8.0）储存液。
   2. 在另一个15 mL离心管中称取15 mg溴酚蓝，加入600 µL无核酸酶水，再加入14.25 mL去离子甲酰胺和150 µL 0.5 M Na₂H₂ EDTA（pH 8.0）溶液。
   3. 将15 mL PAA终溶液分装为每份1 mL，于-80 °C保存。
7. 通过混合0.2%溴酚蓝、0.2%二甲苯青FF、50 mM Na₂H₂ EDTA（pH 8.0）和20% Ficoll Type-400，制备5×琼脂糖凝胶上样缓冲液。
   1. 在磁力搅拌器上，室温（RT）条件下，将1.86 g Na₂H₂-EDTA加入盛有50 mL无核酸酶水的400 mL烧杯中。加入NaOH颗粒调节pH至8.0，再加无核酸酶水至100 mL，得到50 mM Na₂H₂ EDTA溶液。
   2. 称取20 mg溴酚蓝粉末、20 mg二甲苯青FF粉末和2 g Ficoll Type-400粉末，溶于5 mL 50 mM Na₂H₂ EDTA溶液中。
   3. 涡旋含有三种染料的离心管，再加入5 mL 50 mM Na₂H₂ EDTA溶液。混匀后制备5×琼脂糖凝胶上样缓冲液，分装为每份1 mL，于-80 °C保存。

2. 使用18个独立RNA样本建立3'端条形码接头连接

1. 鉴定18份独立的RNA样本（已预先分装于1.5 mL硅化微量离心管中，每管含100 ng RNA溶于9.5 µL无核酸酶水中），将管子置于冰上解冻10分钟。
2. 新鲜配制不含ATP的10倍RNA连接酶缓冲液。
   1. 在一支1.5 mL硅化微量离心管中，加入343 µL无RN酶水、500 µL 1 M Tris（pH 7.5）、100 µL 1 M MgCl₂、50 µL 1 M DTT和50 µL 10% Triton X-100。₂，加入50 µL 20 mg/mL 牛血清白蛋白和7 µL 14 M 2-巯基乙醇。轻弹管壁混匀，于2,000 × g离心2秒，室温，然后置于冰上。
      注意：本方案中所有标明的步骤 "离心2秒" 在室温下，使用台式微量离心机以2,000 × g的最高转速离心，使溶液沉降至管底。
3. 在2 mL硅化微量离心管中，将1 mL无RNase水加入1 mL DMSO中，配制50% DMSO水溶液母液，用铝箔包裹管子，室温保存。
4. 将0.026 nM校准品混合液置于冰上解冻10分钟。在1.5 mL硅化微量离心管中，按以下顺序配制连接反应主混合液：使用200 µL移液器加入40 µL 10x RNA连接酶缓冲液和120 µL 50%水溶性DMSO，再使用10 µL移液器加入10 µL 0.026 nM校准品混合液。轻弹1.5 mL离心管混匀，离心2秒，置于冰上备用。
5. 向18份分别分装的FFPE RNA样品中各加入8.5 µL连接反应主混合液，轻轻弹击管壁，离心2秒，置于冰上保存。
6. 从18种3'端带条形码的接头中各取2.5 µL分装样品，置于冰上解冻20分钟。
   1. 使用 3-µL 移液器将每种接头各取 1 µL，转移至含有 RNA 和连接反应主混合液（Ligation Master Mix）的相应 FFPE RNA 样品中即，9.5 µL + 8.5 µL。
   2. 不要上下吹打，只需将液体加入溶液中后直接取出枪头。在处理不同FFPE RNA样本时务必更换枪头。盖紧各管，轻轻弹击混匀，离心2秒，然后置于冰上。
7. 将18个试管置于90 °C的加热块上加热1分钟以使反应变性，随后立即置于冰上。
8. 在新的1.5 mL硅化微量离心管中，将10 µL截短型K227Q T4 RNA连接酶2与10 µL无RNase的水混合，配制连接酶溶液。
9. 使用 3 µL 移液器将 1 µL 稀释后的连接酶转移至 18 个 RNA 样品中（不要反复吹打，且每次更换移液器吸头）。将 18 个连接反应样品置于冰上，并放入 4 °C 冷室中孵育过夜，孵育时间为 18 h。

3. 连接后小RNA的纯化

1. 将18个管子置于90 °C的加热块上1分钟以终止连接反应，然后放回冰上冷却至少2分钟。
2. 在新的硅化微量离心管中，将1 µL与糖原共价连接的蓝色染料加入26 µL 5 M无RN酶的NaCl中，配制沉淀主混合液。
   1. 将1.2 µL沉淀预混液转移至18个试管中。向每个试管中加入63 µL 100%乙醇。盖紧各管，轻轻弹击混匀，离心2秒，然后将试管置于冰上。将全部18个试管中的内容物合并至一个1.5 mL硅化管中。
   2. 盖上管盖，倒置混匀三次，离心2秒，置于冰上60分钟以沉淀。
3. 准备一个大号（16 x 20 cm）²15% 聚丙烯酰胺凝胶用于PAGE。
   1. 使用0.1 cm的间隔物，将两块硅化玻璃板（采用安全的硅烷涂层替代品处理）固定成模具。
   2. 在50 mL离心管中加入9 mL系统稀释液、18 mL系统浓缩液、3 mL系统缓冲液、240 µL APS（9%）和12 µL TEMED。
   3. 使用30 mL移液管将PAGE凝胶溶液注入玻璃板之间，插入14孔梳子（厚0.1 cm），室温静置30分钟使凝胶凝固。
4. 在16,000 × g、4 °C条件下，将含有混合连接产物的1.5 mL离心管离心60分钟。
5. 移除梳子。使用末端装有200 µL枪头的喷瓶，以无RN酶水充分清洗胶孔，逐个冲洗孔内以彻底清除未聚合的丙烯酰胺，并在水槽上方操作。将15% PAGE胶置于电泳装置中，向内外槽加入0.5×Tris-硼酸EDTA（TBE）溶液，于450 V预电泳30分钟。
6. 从离心机中取出含有混合连接产物的离心管，小心地将RNA沉淀干燥。
   1. 用1 mL移液枪头吸除上清液，但保留管底少量液体。倾斜离心管，用20 mL移液管小心吸除剩余上清液，避免接触沉淀。使用末端装有10 µL枪头的巴斯德移液管进行真空抽吸，去除管内残液，注意勿触碰沉淀。
   2. 轻轻弹击离心管，将RNA沉淀重悬于20 µL无RNase的水中。加入20 µL PAA上样缓冲液以重悬RNA，轻轻弹击混匀，室温离心2秒，将离心管置于90 ºC水浴中1分钟，随后立即置于冰上。
7. 更换凝胶电泳装置中的 0.5x TBE 缓冲液为新鲜的 0.5x TBE，将 DNA 标准品、尺寸标记物和连接产物加样至凝胶中央，两侧各留出两个空加样孔图2).
8. 以450 V（35 mA）电泳60分钟，暂停10分钟以冷却，再以520 V（25 mA）继续电泳60分钟。通过移除一块玻璃板卸下15% PAGE凝胶。
9. 将荧光染料溶液（10 µL 溶于 25 mL 0.5x TBE）轻轻喷洒在置于玻璃板上的凝胶上，避光平放静置 5 分钟。
10. 将带有凝胶的玻璃板置于蓝光透射仪上，使用尺子对齐19 nt和24 nt大小的标记，以准确定位连接后的小RNA并进行切胶回收。图2）。切除凝胶。
11. 将切下的凝胶置于专用于破碎凝胶片的0.5 mL管中，并将其牢固地放入1.5 mL硅化微量离心管内。在室温下以16,000 × g离心3分钟。用300 µL的400 mM NaCl溶液重悬破碎后的凝胶，盖紧管盖，并用石蜡膜密封。
12. 将离心管置于4 °C冷藏室中的恒温混匀仪上，以1,100 rpm转速振荡孵育过夜（16–17 h）。

4. 连接5'接头

1. 将溶液和破碎的凝胶转移至置于1.5 mL硅化管中的5 µm滤管中，用石蜡膜密封，于2,300 × g、室温下离心5分钟。
2. 向滤过后的溶液中加入950 µL 100%乙醇，盖紧管盖，倒置混匀，离心2秒，用石蜡膜密封管口，置于冰上1小时。
3. 按步骤3.3所述制备12% PAGE凝胶，但在50 mL离心管中混合12.6 mL稀释液、14.4 mL浓缩液、3 mL缓冲液、240 µL APS和12 µL TEMED。在0.5× TBE缓冲液中，以450 V（约35 mA）预电泳12% PAGE凝胶30分钟。
4. 将纯化的小RNA溶液在4 °C、16,000 × g条件下离心60分钟。
5. 使用1 mL移液器小心吸出上清液以去除大部分液体，再用200 µL移液器吸除残留液体，注意不要触碰沉淀。
6. 使用末端连接真空抽滤瓶的巴斯德吸管，小心抽干沉淀，避免接触沉淀。
7. 将沉淀重悬于9 µL无RNase的水中，不要反复吹打，而是轻轻弹击管壁混匀，离心2秒后置于冰上。
8. 新鲜配制10× RNA连接酶缓冲液（含ATP）：将500 µL 1 M Tris（pH 7.5）、100 µL 1 M MgCl₂、50 µL 20 mg/mL乙酰化BSA、200 µL 10 mM ATP、7 µL 14 M 2-巯基乙醇和143 µL无RNase水混合。
9. 轻轻弹击管壁混匀10× RNA连接酶缓冲液（含ATP），离心2秒使液体沉至管底。
10. 在9 µL 3'条形码小RNA溶液中加入2 µL 10× RNA连接酶缓冲液（含ATP）、1 µL 100 µM 5'接头和6 µL 50%水溶液DMSO，进行5'接头连接反应。
11. 轻轻弹击管壁混匀，离心2秒收集液体，将管子置于90 °C金属浴中1分钟，然后立即转移至冰上至少2分钟。
12. 向溶液中加入2 µL T4 RNA连接酶1（不要反复吹打），轻轻弹击管壁混匀，离心2秒，将管子置于37 °C水浴中浮置60分钟。
13. 同时设置两组连接反应：一组为19 nt-3'接头与5'接头连接，另一组为24 nt-3'接头与5'接头连接。
    1. 在1.5 mL硅化微量离心管中，将2 µL 19 nt-3'接头（250 ng/µL）或24 nt-3'接头（250 ng/µL）与以下组分混合：2 µL 5'接头（100 µM）、2 µL 10× RNA连接酶缓冲液（含ATP）、6 µL 50%水溶液DMSO、6 µL无RNase水和2 µL T4 RNA连接酶1。
    2. 轻轻弹击管壁混匀，离心2秒，37 °C孵育60分钟。
14. 向所有连接反应体系（纯化的小RNA、两个含19 nt-3'接头的连接反应、两个含24 nt-3'接头的连接反应）中各加入20 µL PAA变性缓冲液。
    1. 轻轻弹击管壁混匀，离心2秒，将各管置于90 °C金属浴中孵育1分钟。将所有管子转移至冰上，并准备分子量标记物（3 µL标记物与20 µL PAA混合）。
15. 倒空已预电泳的12% PAGE凝胶装置的上层储液槽，加入新鲜0.5× TBE缓冲液至略低于加样孔水平（用长而细的吸头将加样孔中的液体吸出）。
    1. 使用细吸头加样，如图3所示。
    2. 用新鲜0.5× TBE缓冲液将各加样孔补满至凝胶顶部。
    3. 向加样孔上方的储液槽中加入新鲜0.5× TBE缓冲液，启动电泳，在450 V（约35 mA）下运行60分钟。
    4. 关闭电源暂停电泳10分钟以冷却凝胶，然后重新启动电源，在520 V（约25 mA）下继续电泳60分钟。
16. 关闭电源，将装置倒置于水槽上方排空缓冲液，通过移除一块玻璃板脱去12% PAGE凝胶。
17. 将带有凝胶的玻璃板平放，用喷雾器将10 µL荧光染料溶于25 mL 0.5× TBE中均匀喷洒于凝胶表面，在避光条件下孵育5分钟。将凝胶玻璃板置于蓝光透射仪上，使用尺子对齐19 nt和24 nt两种大小标记物的位置，指导切割连接后的小RNA条带（图3）。
    1. 切下目标凝胶区域，将凝胶块转移至0.5 mL凝胶破碎管中。盖紧管盖，放入1.5 mL硅化微量离心管中，用石蜡膜固定。取出凝胶破碎管，向1.5 mL离心管中的破碎凝胶中加入300 µL 300 mM NaCl和1 µL 100 µM 3' PCR引物。
    2. 用石蜡膜密封管口，在4 °C冷室中以1,100 rpm振荡过夜（17–18小时）。

5. 5' 连接和 3' 带条形码的纯化小RNA的反转录

1. 从温控混匀仪中取出试管，使用5 µM滤膜管对溶液进行过滤纯化。
   1. 使用1 mL移液器将溶液转移至插入1.5 mL硅化无RNase收集管中的5 µM滤膜管。在2,300 × g和室温条件下离心3分钟。
   2. 弃去滤膜管，向含有滤过溶液的1.5 mL微量离心收集管中加入950 µL 100%乙醇。倒置混匀，短暂离心2秒，然后置于冰上60分钟。在16,000 × g和4 °C条件下离心1小时，沉淀RNA沉淀物。
2. 干燥RNA沉淀物。
   1. 打开管盖，用1 mL移液器小心吸除上清液，保留少量液体在管底。
   2. 使用20 µL移液器吸除所有残留上清液，避免接触沉淀物。倾斜试管使残留液体聚集在沉淀物对侧。
   3. 使用带有10 mL未过滤枪头的巴斯德吸管抽吸上清液，并用真空方式干燥沉淀物。
3. 将RNA沉淀物重悬于5.6 µL无RNase水中。
   1. 将逆转录试剂在冰上解冻15分钟。在5.6 µL重悬的RNA溶液中加入3 µL 5×缓冲液、4.2 µL 10×脱氧核苷三磷酸（dNTPs）（每种2 mM）和1.5 µL二硫苏糖醇（DTT），配制逆转录反应体系。
   2. 轻轻弹击试管混匀反应液，短暂离心2秒以收集液体。将反应管置于90 °C金属浴中加热恰好30秒，随后立即转移至50 °C温控混匀仪中。
   3. 将试管在温控混匀仪中静置2分钟，使温度平衡。直接向溶液中加入0.75 µL逆转录酶，轻轻弹击混匀，立即放回50 °C温控混匀仪中继续孵育30分钟。
4. 30分钟后，将试管转移至95 °C金属浴中加热1分钟以终止逆转录反应。向逆转录产物中直接加入95 µL无RNase水，弹击混匀后立即置于冰上2分钟。
5. 在试管上标记cDNA文库名称及文库编号。

6. 预实验PCR与大规模PCR扩增

1. 在硅化微量离心管中加入 304 µL 无 RNase 水、125 µL 2 M KCl、50 µL 1 M Tris（pH 8.0）、10 µL 1 M MgCl₂、5 µL 1% Triton X-100 和 6 µL 1 M 2-巯基乙醇，配制新鲜的 10x PCR 缓冲液，并于室温保存。
2. 通过混合 67 µL 无 RNase 水、10 µL 10x PCR 缓冲液、10 µL 10x dNTPs、0.5 µL 100 µM 5' PCR 引物、0.5 µL 100 µM 3' PCR 引物、10 µL cDNA 原液文库和 2 µL 50x Taq 聚合酶，组装 Pilot PCR 反应。
   1. 在热循环仪上设置两个 PCR 程序如下：程序 1：94 °C 变性 45 秒，50 °C 退火 85 秒，72 °C 延伸 60 秒，共 10 个循环，结束后保持在 4 °C；程序 2：94 °C 变性 45 秒，50 °C 退火 85 秒，72 °C 延伸 60 秒，共 2 个循环，结束后保持在 4 °C。将 Pilot PCR 反应放入热循环仪，启动程序 1。
   2. 程序 1 结束后，打开 PCR 管，使用 20 µL 移液器将 12 µL Pilot PCR 反应液转移至含有 3 µL 5x 上样缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，通过反复吹打混匀，盖紧管盖，并标记为 "10 个循环"。
   3. 盖紧 Pilot PCR 管，启动热循环仪上的程序 2。程序 2 结束后，打开 PCR 管，使用 20 µL 移液器将 12 µL 反应液转移至含 3 µL 5x 上样缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中，并标记为 "12 个循环"。
   4. 重复步骤 6.2.2 和 6.2.3 的操作，分别在 14、16、18 和 20 个 PCR 循环时从 Pilot PCR 反应中收集 12 µL PCR 产物。向每个 12 µL 的 PCR 分装样品中加入 3 µL 5x 上样缓冲液，同时向含有 3 µL DNA 标准品和 9 µL 无 RNase 水的 20 nt DNA 标准品管中也加入 3 µL 上样缓冲液。
3. 配制含 0.5x TBE 的 2.5% 琼脂糖凝胶。
   1. 在洁净烧杯中称取 2.5 g 琼脂糖，加入 100 mL 0.5x TBE 溶液，放入微波炉加热至沸腾。取出后轻轻旋转混匀，加入 4 μL 溴化乙锭（10 mg/mL），然后将溶液倒入两端用胶带封口的 7 x 10 cm² 电泳槽中。
   2. 插入 8 孔梳子，室温下静置使琼脂糖凝胶完全凝固。将凝固后的凝胶转移至盛有 0.5x TBE 缓冲液的电泳装置中。
4. 将 DNA 标准品和 PCR 样品上样至琼脂糖凝胶，在 120 V 电压下电泳 30 分钟。
5. 在紫外成像仪上观察凝胶，确定最佳 PCR 循环数（图 4A）。
   注意：预期 PCR 条带的大小见 图 4B。
   1. 观察各泳道中的两条 PCR 条带（上条带：DNA 文库，下条带：引物二聚体）。
   2. 选择 cDNA 文库条带清晰可见而引物二聚体几乎不可见的循环数，作为 cDNA 扩增的合适循环数。
      注意：通常选择 12–16 个循环之间的某个值。在 图 4A 中，该文库的合适 PCR 循环数为 14。
6. 为琼脂糖凝胶文库纯化设置大规模 PCR 反应（6 个 100 µL 反应体系）。
   1. 按照步骤 6.1 配制新鲜的 10x PCR 缓冲液。
   2. 在 1.5 mL 管中配制大规模 PCR 主混合液：加入 435.5 µL 无 RNase 水、65 µL 10x PCR 缓冲液、65 µL 10x dNTPs、3.25 µL 5' PCR 引物、3.25 µL 3' PCR 引物，反复吹打混匀。
   3. 将 88 µL PCR 主混合液分装至六个 0.5 mL PCR 管中。每管加入 10 µL 冰上保存的 cDNA 原液文库和 2 µL 50x Taq 聚合酶，吹打混匀。
   4. 设置阴性对照 PCR 反应管：加入 77 µL 无 RNase 水、10 µL 10x PCR 缓冲液、10 µL 10x dNTPs、0.5 µL 5' PCR 引物、0.5 µL 3' PCR 引物和 2 µL 50x Taq 聚合酶，吹打混匀。
   5. 将 PCR 管放入热循环仪，使用步骤 6.2.1 所述程序，并设置最佳扩增循环数。按照步骤 6.3 所述方法配制 2.5% 琼脂糖凝胶。
7. PCR 扩增结束后，从每个 PCR 管中转移 9 µL 反应液至六个含有 3 µL 5x 上样缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中。
   1. 在 1.5 mL 管中配制 20 nt DNA 标准品：将 3 µL DNA 标准品加入 9 µL 无 RNase 水中，再加入 3 µL 上样缓冲液。
   2. 将 DNA 标准品、阴性 PCR 对照和 6 个 PCR 产物上样至琼脂糖凝胶，在 120 V 电压下电泳 30 分钟。
   3. 在紫外成像仪上检查各泳道 PCR 扩增结果的一致性（拍摄图像）。
   4. 将 3 个 PCR 反应产物合并至两个硅化 1.5 mL 微量离心管中（共 3x 91 µL），每管加入 27 µL 5 M NaCl 和 950 µL 100% 乙醇，颠倒混匀后置于 -20 °C 过夜，以沉淀 PCR 产物。

7. cDNA文库的纯化与评估

1. 将两管PCR反应物在4 °C条件下，于16,000 × g离心60分钟。
2. 用1 mL移液器吸除上清液，然后将管子倾斜，使沉淀位于上方，液体位于下方，将巴斯德移液管连接至带有导管的真空瓶，使用巴斯德移液管末端装有10 mL吸头吸取残留液体。
3. 设置PmeI酶切反应。
   1. 用17.5 µL无核酸酶水重悬其中一份PCR沉淀，并将重悬后的沉淀转移至另一份PCR沉淀中。加入2 µL 10x缓冲液和0.5 µL PmeI酶，在37 °C水浴中孵育2小时进行酶切反应。
   2. 使用0.5x TBE配制2.5%琼脂糖凝胶（参见步骤6.3）。向酶切产物中加入6 µL 5x上样染料。将每份酶切产物各13 µL分别加入琼脂糖凝胶中相邻的加样孔，在两端加样孔中加入20 nt DNA Marker，于150 V电压下电泳90分钟（图4D）。
   3. 在紫外透射仪上切下凝胶中的上层PCR条带，将凝胶块转移至预先称重的1.5 mL微量离心管中，并称量凝胶块的质量。
4. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书纯化切下的PCR扩增cDNA文库。使用DNA定量检测试剂盒及仪器，按照制造商说明书对cDNA文库进行定量。
5. 使用Bioanalyzer上的高灵敏度DNA芯片评估cDNA文库的片段大小和纯度（图5）。使用高通量测序系统对cDNA文库进行测序。将FASTQ数据文件上传至RNAworld分析流程，进行接头序列修剪并比对至人类基因组，以鉴定miRNA序列。

结果

如本方法所述，将总共18个独立的FFPE RNA样本（每个100 ng）分别置于不同的离心管中，进行3'端腺苷酸化条形码寡核苷酸的T4连接反应，过夜孵育。次日，将酶促反应通过加热灭活后合并，并在单个离心管中进行沉淀。将RNA沉淀重悬，连接后的RNA分子在15%变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上进行分离，通过PAGE凝胶相邻泳道中迁移的RNA寡核苷酸大小标记物，选择适当大小的3'端带条形码的小RNA（图2）。将切下的凝胶片段在NaCl溶液中过夜孵育，以洗脱连接的RNA分子。次日，对洗脱的RNA进行沉淀，并进行5'端接头连接反应。随后，将连接了5'端接头的小RNA分子在12%丙烯酰胺凝胶上迁移并分离，再次利用迁移的RNA大小标记寡核苷酸，切取含有3'端条形码寡核苷酸和5'端接头的小RNA片段（图3）。将切下的凝胶片段在NaCl溶液中过夜孵育，以实现RNA的洗脱。次日，将连接产物RNA沉淀，沉淀物重悬于无RNase的水中，随后进行逆转录；取部分cDNA分子进行预...

讨论

本方案介绍了一种高度可重复且稳健的cDNA文库制备方法，用于对存档于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中的小RNA进行高通量测序（NGS），该方法是在Hafner et al.²²所描述方案基础上改进和优化的版本。

本方案的所有步骤均已针对从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的陈旧、降解的总RNA进行了优化。该方案处理少量FFPE来源RNA的关键步骤在于将所有RNA样本进行合并（即，18个独立的100 ng FFPE RNA样本）在分别与18种独特的3'端条形码接头连接后进行混合。这一关键步骤使得18个FFPE RNA样本能够均一地经历小RNA cDNA文库构建所需的全部后续生化与酶促反应。此外，该步骤通过增强小RNA分子的载体效应以及便于沉淀物的观察和凝胶筛选，最大限度地提高了在沉淀和凝胶纯化过程中参与反应的RNA量。本方案的另一重要特征是使用预实验PCR反应来确定cDNA文库的最佳扩增循环数，这进一步凸显了该方法在处理微量FFPE RNA样本时的灵活性。此步骤还可揭示文库扩增与引...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% Triton x-100	Invitrogen	HFH10
10 mM ATP	Ambion	AM8110G
10X dNTPs	Ambion	AM8110G
10x TBE	Thermofisher Scientific	15581044
14M 巯基乙醇	Sigma	O3445I-100
20 nt ladder	Jena Bioscience	M-232S
20 mg/ml 牛血清白蛋白	Sigma	B8894-5ML
50X Titanium Taq	Clontech Laboratories	639208
过硫酸铵	Fisher Scientific	7727-54-0
BRL 垂直凝胶电泳系统（含玻璃板和梳子）	GIBCO	V16
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D9170-5VL
Eppendorf 微型离心机 5424R	USA scientific	4054-4537Q
Eppendorf Thermomixer	USA scientific	4053-8223Q
Fisherbrand™ 硅化低吸附微型离心管 1.5 ml	Fisher Scientific	02-681-320
0.5 ml 凝胶破碎管	IST Engineering Inc,	3388-100
凝胶电泳装置 7 cm × 10 cm - Mini-sub Cell GT（含凝胶托盘和梳子）	Biorad	1704446
Glycoblue	Ambion	AM9516
Jersey-Cote	LabScientific, Inc	1188
KCl 2 M	Ambion	AM9640G
MgCl₂ 1 M	Ambion	AM9530G
Minifuge 双转子个人离心机	USA scientific	2641-0016
Model V16 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（含玻璃板、梳子和垫片）	Ciore Life Science	21070010
寡核苷酸	IDT	订购时确定
Owl EasyCast B2 小型电泳系统（含凝胶托盘和梳子）	Thermofisher Scientific	B2
Qiaquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
限制性内切酶 PmeI	NEB	R0560S
无RNase水	Ambion	AM9932
Safe Imager 2.0	Life Technologies	G6600
Safe Imager 2.0 蓝光透射仪	Thermofisher	G6600
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50002
Superscript III 反转录试剂盒	Invitrogen	18080-044
SybrGold	Life Technologies	S11494
T4 RNA 连接酶 1	NEB	M0204S
T4 RNA 连接酶 2 截短型 K227Q	NEB	0351L
TEMED	Fisher Scientific	O3446I-100
带加热盖的热循环仪	Applied Biosystem	4359659
Tris 1 M pH 7.5	Invitrogen	15567027
Tris 1 M pH 8.0	Ambion	AM9855G
UltraPure Sequagel 系统浓缩液、稀释液和缓冲液	National Diagnostics	EC-833