回顾性 microRNA 测序：使用福尔马林固定石蜡包埋 RNA 标本的互补 DNA 文库制备方案

摘要

福尔马林固定石蜡包埋的标本是人类疾病分子生物标志物的重要来源。本文介绍一种基于实验室的cDNA文库构建方案，该方案最初针对新鲜冷冻RNA设计，并已优化用于分析储存时间长达35年的组织中存档的微小RNA（microRNA）。

摘要

——存档的、经临床分类的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织可为癌症发生发展的回顾性分子研究提供核酸。通过分析那些后续发展为侵袭性疾病的患者所采集的非侵袭性或癌前病变组织，基因表达分析可能有助于识别出易感癌症风险的早期分子改变。已有充分报道指出，从 FFPE 组织中提取的核酸经历了严重的物理损伤和化学修饰，导致其分析困难，通常需要采用经过优化的检测方法。然而，微小 RNA（miRNA）是一类长度仅约 18–24 个核苷酸的小 RNA 分子，已被证明能够耐受长期储存，并已在 FFPE 样本中成功实现分析。本文介绍一种专为从存档组织中提取的小 RNA 分析而优化的 3' 端条形码互补 DNA（cDNA）文库构建方案，该方法在使用储存时间长达 35 年的存档临床样本时，已被证明具有良好的稳健性和高度可重复性。该文库构建方法适用于降解或质量较差样本的多重分析：可将最多 18 个 RNA 样本分别连接带有独特 3' 端条形码的接头，随后合并进行后续的酶学和生化处理，再进入分析流程。所有纯化步骤均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）完成，从而实现对条形码标记的小 RNA 物种进行特异性大小筛选和富集。该 cDNA 文库构建方法适用于极微量的 RNA 起始量，通过预实验聚合酶链式反应（PCR）可确定最佳扩增循环数，以获得适用于下一代测序（NGS）的适量产物。该方法针对储存时间长达 35 年的 FFPE 降解 RNA 进行了优化，可提供高度可重复的 NGS 数据。

引言

miRNA 在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本中保存极为完好^1,2,3先前的研究表明，利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的总RNA可有效检测这些短链调控性非编码单链RNA分子的表达水平，并且与原始新鲜组织相比，能够提供具有相关性的基因表达数据^4,5,6,7,8与大片段信使RNA相比，后者已被证实会受到福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织处理过程（甲醛、加热、干燥）的显著影响 等等。），内源性RNase以及样本保存时间的影响，miRNA分子较小（约18–24个核苷酸）的特性使其对降解具有较强抵抗力，并能耐受长期储存。这一优势已在存档样本的研究中得到证实，miRNA表达分析的表现优于高通量mRNA分析。⁹使用存档临床样本进行的miRNA表达研究大多为小规模分析，结果表明，在对这些检测方法进行优化后，可采用单重或多重定量PCR检测、不同类型的微阵列技术，以....

方案

1. 所有试剂和引物的准备

1. 按照图1所述订购所有引物和接头。
2. 制备校准品混合物原液，该原液将被加入到每个单独的连接反应中。
   1. 用无RNase的水将载体寡核苷酸（图1）重悬至0.5 µM。使用0.5 µM的载体寡核苷酸溶液将10种校准寡核苷酸（图1）分别重悬至100 µM。
   2. 取每种10种校准品各10 µL，加入硅化微量离心管中，得到100 µM的校准品混合原液，并配制0.026 nM的工作溶液，于-20 °C保存。
3. 用无RNase的水将20种独特的冻干腺苷化3'接头稀释至终浓度为50 µM（图1）。
   注意：建议将每种接头分装为2.5 µL的单次使用量至独立的硅化管中，于-80 °C保存，可稳定长达2年。
4. 将脱盐处理的19 nt-3'接头和24 nt-3'接头大小标记寡核苷酸重悬至250 ng/mL（图1）。
5. 用无RNase的水将HPLC纯化的5'接头重悬至100 µM。使用无RNase的水将5'和3' PCR引物分别重....

结果

如本方法所述，将总共18份独立的FFPE RNA样本（每份100 ng）分别置于不同的离心管中，进行3'端腺苷酸化条形码寡核苷酸的T4连接酶过夜连接反应。次日，将酶促反应通过加热灭活后合并，并在单个离心管中进行沉淀。将RNA沉淀重悬，并在15%变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上分离连接后的RNA分子，通过PAGE凝胶相邻泳道中迁移的RNA寡核苷酸大小标记物，选择适当大小的3'端条形码小RNA（图2）。将切下的凝胶条置于NaCl溶液中过夜孵育，以洗脱连接的RNA分子。次日，对洗脱的RNA进行沉淀，并进行5'端接头连接反应。随后，将连接了5'端接头的小RNA分子在12%丙烯酰胺凝胶上电泳分离，此时再次利用迁移的RNA大小标记寡核苷酸，对同时含有3'端条形码寡核苷酸和5'端接头的小RNA进行按大小切胶回收（图3）。切下的凝胶条再次在NaCl溶液中过夜孵育，以实现RNA的洗脱。次日，将洗脱后的连接小RNA沉淀，将沉淀重悬于无RNase的水中，随后进行逆转录；取部分.......

讨论

本方案介绍了一种高度可重复且稳健的cDNA文库构建方法，用于对存档于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中的小RNA进行高通量测序（NGS），该方法是在Hafner et al.²²所述方法基础上改进和优化的版本。

本方案的所有步骤均已针对从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的陈旧、降解的总RNA进行优化。该方案处理少量FFPE来源RNA的关键步骤在于将所有RNA样本合并即在使用18种独特的3'端条形码接头对18个独立的100 ng FFPE RNA样本分别进行连接后，该关键步骤使得这18个FFPE RNA样本能够均一地经历小RNA cDNA文库构建所需的全部后续生化与酶促反应。此外，该步骤通过增强小RNA分子的载体效应以及便于观察沉淀物和凝胶筛选，最大限度地提高了在沉淀和凝胶纯化过程中参与反应的RNA量。本方案的另一重要特征是采用预实验PCR反应以确定cDNA文库的最佳扩增循环数，进一步凸显了该方法在处理微量FFPE RNA样本时的灵活性。此步骤还可揭示文库扩增与引物二聚体扩增之间的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% Triton x-100	Invitrogen	HFH10
10 mM ATP	Ambion	AM8110G
10X dNTPs	Ambion	AM8110G
10x TBE	Thermofisher Scientific	15581044
14M 巯基乙醇	Sigma	O3445I-100
20 nt DNA 标准分子量标记物	Jena Bioscience	M-232S
20 mg/ml 牛血清白蛋白	Sigma	B8894-5ML
50X Titanium Taq	Clontech Laboratories	639208
过硫酸铵	Fisher Scientific	7727-54-0
BRL 垂直凝胶电泳系统（含玻璃板和梳子）	GIBCO	V16
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D9170-5VL
Eppendorf 微型离心机 5424R	USA scientific	4054-4537Q
Eppendorf 恒温混匀仪	USA scientific	4053-8223Q
Fisherbrand™ 硅化低吸附微型离心管 1.5 ml	Fisher Scientific	02-681-320
0.5 ml 凝胶破碎管	IST Engineering Inc,	3388-100
7 cm × 10 cm 小型凝胶电泳装置 Mini-sub Cell GT（含凝胶托盘和梳子）	Biorad	1704446
Glycoblue	Ambion	AM9516
Jersey-Cote	LabScientific, Inc	1188
2 M KCl	Ambion	AM9640G
1 M MgCl₂	Ambion	AM9530G
Minifuge 双转子个人离心机	USA scientific	2641-0016
Model V16 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（含玻璃板、梳子和垫片）	Ciore Life Science	21070010
寡核苷酸	IDT	订购时确定序列
Owl EasyCast B2 小型电泳系统（含凝胶托盘和梳子）	Thermofisher Scientific	B2
Qiaquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
限制性内切酶 PmeI	NEB	R0560S
无RNase水	Ambion	AM9932
Safe Imager 2.0	Life Technologies	G6600
Safe Imager 2.0 蓝光透射仪	Thermofisher	G6600
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50002
Superscript III 反转录试剂盒	Invitrogen	18080-044
SybrGold	Life Technologies	S11494
T4 RNA 连接酶 1	NEB	M0204S
T4 RNA 连接酶 2 截短型 K227Q	NEB	0351L
TEMED	Fisher Scientific	O3446I-100
带加热盖的PCR仪	Applied Biosystem	4359659
1 M Tris，pH 7.5	Invitrogen	15567027
1 M Tris，pH 8.0	Ambion	AM9855G
UltraPure Sequagel 系统浓缩液、稀释液和缓冲液	National Diagnostics	EC-833