Method Article

超 cyt: 一种用于简化高维细胞学数据分析的图形用户界面

DOI:

10.3791/57473

⸱

January 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Immunology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

excyt 是一种基于 matlab 的图形用户界面 (gui), 允许用户通过常用的高维数据分析技术分析他们的流式细胞术数据, 包括通过 t-SNE 降低维数, 各种自动化和手动聚类分析方法、热图和新颖的高维流图。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着流式细胞仪的出现, 能够测量越来越多的参数, 科学家们继续开发更大的面板, 以表型地探索其细胞样本的特征。然而, 这些技术进步产生了高维数据集, 而在传统的基于手动的门控程序中, 这些数据集变得越来越难以客观地进行分析。为了更好地分析和呈现数据, 科学家们与具有分析高维数据专业知识的生物信息学家合作, 分析他们的流式细胞仪数据。虽然这些方法已被证明是非常有价值的研究流式细胞术, 他们尚未纳入一个简单和易于使用的包, 为缺乏计算或编程专业知识的科学家。为了满足这一需求, 我们开发了 excyt, 这是一种基于 matlab 的图形用户界面 (gui), 通过实施常用的高维数据分析技术, 简化了对高维流式细胞术数据的分析, 包括通过 t-SNE、各种自动和手动聚类分析方法、热图和新颖的高维流图来减小维数。此外, excyt 还为选定感兴趣的人群提供了传统的门控选项, 以便进一步进行 t-SNE 和聚类分析, 并能够直接在 t-SNE 图上应用门。该软件提供了处理已补偿或未补偿的 fcs 文件的额外优势。在需要采集后补偿的情况下, 用户可以选择为程序提供一个单一污渍的目录和一个未染色的样本。该程序检测所有通道中的正事件, 并使用此选择数据更客观地计算补偿矩阵。总之, excyt 提供了一个全面的分析管道, 以 fcs 文件的形式获取流式细胞仪数据, 并允许任何个人, 无论计算培训如何, 使用最新的算法方法来了解他们的数据。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

流式细胞术的进步以及大量细胞学的出现, 使临床医生和科学家能够快速识别出具有新分辨率的生物和临床上有趣的样品, 并对其进行表型表征, 从而产生较大的分辨率。信息丰富的高维数据集 1,2,3。虽然传统的流式细胞仪数据分析方法 (如手动门控) 对于那些标记很少且这些标记具有视觉可识别的数量的实验来说更为简单, 但这种方法可能无法生成分析高维数据集或在光谱上使用标记染色的数据集时可重现的结果。例如, 在一项多机构研究中, 正在进行细胞内染色 (ics) 检测, 以评估量化抗原特异性细胞反应的重现性, 尽管实验室间的精度和分析都很好, 特别是门控, 引入了一个重要的变异性来源 4。此外, 手工门控人口的过程, 除了高度主观, 是高度耗时和劳动密集型。然而, 以稳健、高效、及时的方式分析高维数据集的问题, 并不是研究科学的一个新问题。基因表达研究往往产生极高维的数据集 (往往按上百个基因的顺序), 在这些数据集中, 人工形式的分析根本不可行。为了解决这些数据集的分析问题, 在开发生物信息工具来分析基因表达数据方面做了大量的工作。这些算法方法最近刚刚被用于细胞学数据的分析, 因为参数的数量增加了, 并已被证明是非常宝贵的, 在分析这些高维数据集6,7。

尽管产生和应用了各种算法和软件包, 使科学家能够将这些高维生物信息方法应用于他们的流式细胞术数据, 但这些分析技术在很大程度上仍然没有得到利用。虽然可能有多种因素限制了这些方法在细胞学数据方面的广泛采用, 但我们怀疑科学家使用这些方法的主要障碍是缺乏计算知识。事实上, 其中许多软件包 (即flowcore、flowCore 和 opencyto) 都是用编程语言 (如 r) 编写的, 这些语言仍然需要实质性的编程知识。像 flowjo 这样的软件包由于使用简单、"即插即用" 的性质以及与 pc 操作系统的兼容性而受到科学家的青睐。为了向科学家不熟悉的编程提供各种公认和有价值的分析技术, 我们开发了 excyt, 这是一个图形用户界面 (gui), 可以很容易地安装在 pccymac 上, 它可以利用许多最新的技术包括用于直观可视化的维数约简、文献中引用的各种聚类方法, 以及新的特征, 用于利用热图和新颖的高维流箱图来探索这些聚类算法的输出。

excyt 是一个在 matlab 中构建的图形用户界面, 因此可以直接在 matlab 中运行, 也可以提供可用于在任何 pc/mac 上安装软件的安装程序。该软件可在 https://github.com/sidhomj/ExCYT。我们提出了一个详细的协议, 如何导入数据, 预处理它, 进行 t-SNE 降维度, 集群数据, 根据用户偏好对 & 过滤器集群进行排序, 并通过热图和新颖的方法显示感兴趣的集群的信息高维流箱图(图 1)。t-SNE 图中的轴是任意的, 以任意单位为单位, 因此为了用户界面的简单性, 并不总是在数字中显示出来。根据所指示标记的信号, "t-SNE 热图" 中数据点的着色从蓝色到黄色。在聚类解决方案中, 数据点的颜色是基于聚类数字的任意颜色。工作流的所有部分都可以在单面板 gui 中执行(图 2 & 表 1)。最后, 我们将演示使用 excyt 在以前发表的数据, 探索肾细胞癌的免疫景观的文献, 也用类似的方法进行分析。我们用来创建本手稿中的数字以及下面的协议的示例数据集可以在注册帐户时在 https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875 找到。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 收集和准备细胞术数据

  1. 将所有单一污渍单独放置在文件夹中, 并按通道名称 (按荧光, 而不是标记) 标记。

2. 数据输入 & 预处理

  1. 若要暂停或保存整个分析管道, 请使用程序左下角的"保存工作区" 按钮将工作区另存为 ""。以后可以通过"加载工作区" 按钮加载的 mat ' 文件。不要一次运行该程序的多个实例。因此, 在加载新工作区时, 请确保检查没有其他正在运行的 excyt 实例。
  2. 要开始分析管道, 请首先选择类型的细胞学 (流式细胞仪或质量细胞仪–cytof), 在"文件选择参数"下, 从文件中选择要采样的事件数 (在本例中使用 2, 000)。成功导入数据后, 将弹出一个对话框, 通知用户数据已成功导入。
  3. 按"自动补偿" 按钮执行可选的自动补偿步骤, 如 bagwell & adams9所做的那样。选择包含单个污渍的目录。在用户界面对话中选择未染色的示例。
    1. 在此目录中的任何示例上放置一个向前散射门, 这些示例将用于选择事件来计算补偿矩阵。建议将未染色的样品用于此目的。此时, 已经实现了一种算法, 在未染色样本的99% 处设置一致的阈值, 以定义每个单一污渍中的正事件来计算补偿矩阵。完成此操作后, 对话框将通知用户已执行补偿。
  4. 接下来, 按"门填充"并选择感兴趣的细胞群, 就像流式细胞术分析中的惯例一样。选择单元格填充后, 输入下游分析事件的百分比 (在此 10, 000个事件中)。
  5. 接下来, 在 "预处理" 框的最右侧的列表框中选择用于分析的数字通道 (使用示例中显示的特定通道)。

3. t-SNE 分析

  1. 按t-SNE按钮, 让程序开始计算在 t-SNE 按钮下方的窗口中进行可视化的缩减维数数据集。要保存 t-SNE 的图像, 请按保存 tsn 图像。在每台 cpu @ 3.4 ghz 和 8 gm ram 的机器上, 对于 10, 000个事件, 此步骤大约需要 2分钟, 50, 000个事件需要 10分钟, 100, 000个事件需要20分钟。
  2. 要创建 "t-SNE 热图", 如多个 cytof 出版物10、11中所示, 请从"特定于标记的 t-SNE" 弹出菜单中选择一个选项 (使用示例中显示的特定标记 cd64 或 cd3)。将弹出一个图形, 显示可保存用于图形生成的 t-SNE 图形的热图表示形式。
  3. 在用户的 t-SNE 绘图中选择感兴趣的区域, 以便使用gate t-SNE按钮进行进一步的下游分析。

4. 聚类分析

  1. 若要开始聚类分析, 请在"聚类分析方法" 列表框中选择一个选项 (在本例中, 我们 dbscan 在列表框右侧的对话框中的距离因子为 5)。按"群集" 按钮。
  2. 对于 "自动群集参数" 面板中的自动聚类算法, 请使用以下选项之一:
    1. 硬 k联署 (在 t-sne 上): 将 k 均意味着将聚类应用于减少的二维 t-SNE 数据, 并要求将聚类数提供给算法12。
    2. 硬 k联署 (关于 hd 数据): 将 k 均表示聚类应用于提供给 t-SNE 算法的原始高维数据。同样, 需要向算法提供集群的数量。
    3. dbscan:应用聚类分析方法, 称为基于密度的噪声应用程序的空间聚类, 该方法将减少的二维 t-SNE 数据进行聚类, 并需要一个非维距离因子来确定集群。这种类型的聚类算法非常适合于聚类 t-SNE 约简, 因为它能够聚类通常存在于减少的 t-SNE 表示中的非球面聚类。此外, 由于它在二维数据上运行, 因此它是更快的聚类算法之一。
    4. 分层群集:将传统的分层聚类方法应用于高维数据, 在为算法提供设置聚类大小的距离因子之前, 在所有事件之间计算整个欧几里得距离矩阵。
    5. 网络图形-基于: 应用最近引入的聚类方法来分析流式细胞术数据时, 有罕见的亚群, 用户希望检测11,14。此方法依赖于首先创建一个图形, 用于确定数据中所有事件之间的连接。此步骤包括提供一个初始参数来创建图形, 即 k 最近的邻居的数量。此参数通常控制群集的大小。此时, 会弹出另一个对话框, 要求用户使用应用于图形的5种聚类算法中的一种。其中包括3个最大限度地提高图形模块化的选项、d起方法和光谱聚类算法 14、15、16、17、18。如果需要一个通常更快的聚类解决方案, 我们建议频谱聚类或快贪婪模块化最大化。虽然模块化最大化方法与 d起方法一起确定了最佳的聚类数, 但频谱聚类需要为程序提供群集的数量。
    6. 自组织地图:使用人工神经网络对高维数据进行聚类。
    7. gmm–预期最大化: 使用预期最大化 (em) 技术创建高斯混合模型来群集高维数据。19这种类型的聚类方法还要求用户输入群集的数量。
    8. gmm 的变分贝叶斯推理: 创建高斯混合模型, 但与 em 不同, 它可以自动确定混合物分量的数量 k. 20 虽然程序确实需要给出多个聚类 (大于(算法将自行确定最佳数量)。
  3. 若要研究 t-SNE 绘图的特定区域, 请按"手动选择群集"按钮以绘制一组用户定义的群集。值得注意的是, 群集不能共享成员 (即, 每个事件只能属于1个群集)。

5. 集群过滤

  1. 可以通过以下方式筛选手动或通过上述自动方法之一标识的群集集。
    1. 若要按实验中测量的任何标记对群集 (在"群集筛选器" 面板中) 进行排序, 请从 "排序" 弹出菜单中选择一个选项。要设置顺序是升序还是降序, 请按 "排序" 弹出菜单右侧的"升序"按钮。这将更新 "群集 (过滤)" 列表框中的群集列表, 并按该标记的中位聚类表达式的降序对其进行重新排序。在 "群集 (过滤)" 列表框中表示的百分比表示此群集所代表的人口的百分比。
    2. 要在特定通道中为给定群集设置最小阈值, 请从"阈值" 弹出菜单中选择一个选项 (在本例中, 我们使用标记 cd65, 并将阈值设置为 0.75)。要么在图形下方的数字框中键入一个值, 要么使用滑条设置阈值。设置阈值后, 按"添加高于阈值" 或 "添加到阈值以下" 以指定阈值的方向。设置此阈值后, 它将在 "群集筛选器" 面板旁边的 "阈值" 框中列出, 其中将列出标记、阈值和方向, 以便用户了解当前正在应用的阈值。最后, t-SNE 图形将通过模糊不符合过滤要求的集群进行更新, 并且 "集群 (过滤)" 列表框将更新, 以显示满足过滤要求的集群。
    3. 要设置群集频率的最小阈值, 请在"群集频率阈值" (%) 中输入数字截止值"群集筛选器" 面板中的框 (在本例中使用 1%)。

6. 可视化 & 聚类分析

  1. 若要选择群集以进行进一步分析和可视化, 请选择 "群集 (过滤) " 列表框中的群集, 然后按"选择 a"按钮将其移动到 "群集分析" 列表框中。
  2. 若要创建群集的热图, 请在 "群集分析" 列表框中选择感兴趣的群集, 然后按"群集的热图"按钮。按下此按钮时, 将弹出一个图形, 其中包含热图以及集群和参数轴上的树状图。垂直轴上的树形图将按密切相关的群集进行分组, 而水平轴上的树突图将对相互关联的标记进行分组。要保存热图, 请按文件导出设置出口.
  3. 若要创建 "高尺寸框绘图" 或 "高维流图", 请在"群集分析" 列表框中选择感兴趣的群集, 然后按 "高尺寸框图块" 按钮或 "高维流图"按钮。这些图可以用于直观地评估不同集群在所有维度中的给定通道的分布。
  4. 要显示传统二维流图中的聚类, 请在"常规流图" 面板中选择变换 (线性、log10、arcsinh) 和通道, 然后按"常规流图".

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Results

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为了测试 excyt 的可用性, 我们分析了 chevrier等人发布的一个程序数据集, 该数据集的标题是 "透明细胞肾癌的免疫图集", 该小组在该数据集中对73例肿瘤样本进行了广泛的免疫面板分析。病人11。两个独立的面板, 一个髓质和淋巴板, 被用来表型表征肿瘤的微环境。我们的研究目的是总结他们的 t-SNE 和聚类分析的结果, 表明 excyt 可以用来得出相同的结论, 并显示其他的可视化和聚类分析方法。

在原稿中, 该小组描述了22个由淋巴面板识别的 t 细胞团和由骨髓状体面板识别的17个细胞团簇。在出版物的图 3 &图 4中, 该组显示了群集的热图、带有颜色编码群集解决方案的 t-SNE 图以及子面板 a、b、& c 中的 t-SNE 热图。为了...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们提出了 excyt, 这是一个新的图形用户界面, 运行基于 matlab 的算法, 简化了对高维细胞术数据的分析, 允许没有编程背景的个人实现最新的高维数据分析算法。这种软件提供给更广泛的科学界将使科学家能够在直观和直接的工作流程中探索他们的流式细胞仪数据。通过进行 t-SNE 维数约简, 应用聚类方法, 能够快速通过这些聚类进行 s何种过滤, 并制作灵活、可定制的热图和高维流箱图, 科学家们将不仅能够实现灵活、可定制的热图和高维流箱图。了解其样本中唯一定义的子群, 但能够创建直观且易于同事理解的可视化。

虽然该程序可以灵活地处理各种数据类型 (传统的流式细胞术与质量细胞学), 但对于程序的最佳效用, 有几个考虑因素。首先是关于数据质量, 特别是流式细胞术数据。适当的补偿和重叠发射光谱的解析是至关重要的。补偿不足的数据会无意中导致标记的错误协联和不具有真正生物意义的集群的形成。因此, 在进行 t-SNE 分析和进一步的下游分析之前, 输入数据具有良好的质量是非常可取的。此外, 使用 excyt 中实现的自动补偿算法需要所有通道都有清晰的单色污渍, 以便准确计算补偿参数...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人没有得到任何承认。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
运行分析的桌面SuperMicro定制计算机
MATLABMathworksN/A用于开发 ExCYT 的软件
用于

References

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