ExCYT 是一个基于 MATLAB 的图形用户界面（GUI），可让用户通过常用的高维数据分析技术来分析其流式细胞术数据，包括通过 t-SNE 进行降维、多种自动和手动聚类方法、热图以及新型高维流式图。
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本文内容
摘要
摘要
随着流式细胞仪能够检测的参数数量不断增加，科研人员持续开发更大的抗体组合，以对细胞样本进行表型特征分析。然而，这些技术进步产生了高维度的数据集，使得在传统的基于手动设门的分析软件中客观地分析数据变得愈发困难。为了更好地分析和展示数据，科学家们常与擅长高维数据分析的生物信息学专家合作，共同解析其流式细胞术数据。尽管这些方法已被证明在流式细胞术研究中极具价值，但尚未被整合为一种简单直观、易于使用的工具包，供缺乏计算或编程背景的科研人员使用。为满足这一需求，我们开发了ExCYT——一个基于MATLAB的图形用户界面（GUI），通过集成常用的高维数据分析技术，简化了高维流式细胞术数据的分析流程，这些技术包括t-SNE降维、多种自动与手动聚类方法、热图以及新型高维流式图。此外，ExCYT还提供传统设门功能，允许用户选择感兴趣的细胞群体，进一步进行t-SNE和聚类分析，并支持直接在t-SNE图上应用设门。该软件的另一优势在于可处理已补偿或未补偿的FCS文件。若需在数据采集后进行补偿，用户可提供单染样本文件夹及未染色对照样本，程序将自动识别各通道中的阳性事件，并利用这些选定数据更客观地计算补偿矩阵。综上所述，ExCYT提供了一套完整的分析流程，能够以FCS文件形式导入流式细胞术数据，使任何具备或不具备计算背景的研究人员均可应用最新的算法手段深入理解其数据。
引言
流式细胞术的进步以及质谱流式细胞术的出现，使得临床医生和科研人员能够以前所未有的分辨率快速识别并进行生物学和临床相关样本的表型表征，从而产生信息丰富的大规模高维数据集1,2,3。尽管传统的流式细胞术数据分析方法（如人工设门）在标记物较少且各标记物可清晰分辨出细胞群的实验中较为直接有效，但在分析高维数据集或标记物染色呈连续谱分布的数据时，该方法往往难以生成可重复的结果。例如，在一项多中心研究中，研究人员采用胞内细胞因子染色（ICS）实验评估抗原特异性T细胞反应定量结果的可重复性，尽管各实验室之间的检测精密度良好，但数据分析过程（尤其是设门策略）引入了显著的变异来源4。此外，人工设门鉴定目标细胞群的过程不仅高度依赖主观判断，而且耗时且劳动强度大。然而，以稳健、高效且及时的方式分析高维数据集的问题，在科研领域并非新挑战。基因表达研究通常会产生极高维度的数据集（通常涉及数百个基因），在这些数据集中采用人工方式进行分析根本不可行。为应对这类数据集的分析难题，已有大量工作致力于开发用于解析基因表达数据的生物信息学工具5。随着检测参数数量的增加，这些算法化方法最近已被引入细胞术数据分析中，并在高维数据集的分析中展现出不可替代的价值....
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方案
1. 收集和准备流式细胞术数据
- 将所有单染样本单独放置在一个文件夹中，并按通道名称（以荧光染料命名，而非标记物）进行标记。
2. 数据导入 & 预处理
- 在整个分析流程中如需暂停或保存，请使用程序左下角的保存工作区按钮，将工作区保存为“*.MAT”文件，之后可通过加载工作区按钮重新载入。请勿同时运行程序的多个实例。因此，在加载新的工作区时，务必确认没有其他 ExCYT 实例正在运行。
- 开始分析流程时，首先在文件选择参数下选择细胞仪类型（流式细胞仪或质谱流式细胞仪 – CYTOF），并选择从文件中采样的事件数量（本示例中使用 2,000 个事件）。数据成功导入后，将弹出一个对话框，提示用户数据已成功导入。
- 点击自动补偿按钮，执行可选的自动补偿步骤，该步骤由 Bagwell & Adams9 提出。选择包含单染样本的目录，并在用户界面对话框中选择未染色样本。
- 在该目录中的任意样本上设置前向/侧向散射门，用于选择用于计算补偿矩阵的事件。建议使用未染色样本完成此步骤。此时，算法已实现，在未染色样本的第 99th 百分位数处设定一致的阈值，以定义....
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结果
为了测试 ExCYT 的可用性，我们分析了 Chevrier et al. 发表的一个经过整理的数据集，题为“透明细胞肾细胞癌的免疫图谱”，该研究团队对来自 73 名患者的肿瘤样本使用了广泛的免疫抗体组合进行了质谱流式细胞术（CyTOF）分析11。该研究使用了两个独立的抗体组合——髓系和淋巴系抗体组合，以对肿瘤微环境进行表型表征。我们研究的目的是重现其 t-SNE 和聚类分析结果，证明 ExCYT 可以得出与原文相同的结论，同时展示其他可视化和聚类分析方法。
在原始手稿中，该研究团队通过淋巴细胞面板鉴定了22个T细胞簇，通过髓系面板鉴定了17个细胞簇。在该出版物的图3和图4中，研究团队展示了细胞簇的热图、以不同颜色编码聚类结果的t-SNE图，以及分图A、B和C中的t-S.......
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讨论
本文介绍了 ExCYT，这是一种新型的图形用户界面，运行基于 MATLAB 的算法，可简化高维细胞术数据的分析流程，使无编程背景的用户也能应用最新的高维数据分析算法。该软件向更广泛的科学界开放，将使科研人员能够以直观且简便的工作流程探索其流式细胞术数据。通过执行 t-SNE 降维、应用聚类方法、快速筛选和排序这些聚类结果，并生成灵活且可自定义的热图以及高维流式图/箱形图，科研人员不仅能够识别样本中独特定义的亚群，还能创建出直观且易于被同行理解的可视化结果。
尽管该程序在处理多种数据类型（传统流式细胞术与质谱流式细胞术）方面具有灵活性，但在最大限度发挥程序效用时仍需考虑若干因素。首要因素是数据质量，特别是流式细胞术数据的质量。正确补偿以及对重叠发射光谱的有效分辨至关重要。补偿不当的数据可能无意中导致标记物的虚假共关联，以及形成并无真实生物学意义的聚类。因此，在进行 t-SNE 分析及后续下游分析之前，强烈建议输入的数据应具备良好的质量。此外，ExCYT 中实现的自动补偿算法需要所有通道均具备清晰的单染样本，以准确计算补偿参数。
.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 台式机 | SuperMicro | 定制组装 | 用于运行分析的计算机 |
| MATLAB | Mathworks | 不适用 | 用于开发 ExCYT 的软件 |
参考文献
- Benoist, C., Hacohen, N. Flow cytometry, amped up. Science. 332 (6030), 677-678 (2011).
- Ornatsky, O., et al. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).
- Tanner, S. D., et al.
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