方法文章

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

DOI：

10.3791/57481

⸱

2018年5月25日

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA 图谱。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎干细胞（ES细胞）的自我更新 和分化受到外源性信号以及转录因子、表观遗传调控因子和组蛋白翻译后修饰等内在网络的共同调控，这些因素协同影响邻近基因的基因表达状态。RNA也被证实可与多种蛋白质相互作用，调控染色质动态 和基因表达。染色质相关RNA免疫沉淀结合高通量测序（CARIP-Seq）是一种用于系统鉴定与染色质蛋白结合的RNA的新方法；而染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）则是一种强大的基因组学技术，可用于在全球范围内绘制胚胎干细胞中组蛋白翻译后修饰、转录因子和表观遗传修饰因子的定位图谱。本文中，我们描述了CARIP-Seq和ChIP-Seq的实验方法，包括高通量测序文库的构建，以获得胚胎干细胞中染色质相关RNA和表观基因组的全局图谱。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胚胎干细胞（ES细胞）的命运决定受到细胞外信号与多种转录调控因子（包括组蛋白修饰酶以及组蛋白尾部的翻译后修饰）之间相互作用的调控。这些相互作用促进了染色质的可及性，并将染色质包装成两种状态之一：具有开放结构且转录活跃的常染色质（euchromatin），以及结构紧密且通常转录失活的异染色质（heterochromatin）。具有DNA序列特异性结合能力的转录因子和表观遗传修饰因子可结合于常染色质区域，参与基因表达的调控。新一代测序技术，如ChIP-Seq1，在绘制全基因组范围内的转录调控网络方面发挥了关键作用，这些网络对于ES细胞的自我更新和多能性至关重要2,3,4,5,6。此外，尽管RNA免疫共沉淀结合新一代测序（RIP-Seq）7对RNA-蛋白质相互作用的研究表明，DNA结合蛋白可通过与RNA相互作用来调控转录事件7,8,9,10,11,12，但目前仍鲜有研究探讨与染色质相关联的RNA在全基因组范围内的定位12，或RNA与组蛋白修饰之间的全局性相互作用。长链非编码RNA（lncRNAs）是一类已被发现可调控染色质相关蛋白活性的RNA13,14,15。例如，Xist是一种lncRNA，可在雌性哺乳动物细胞中通过招募表观遗传抑制因子，介导其中一条X染色体的失活16,17。然而，与染色质相关联的RNA的完整谱系在很大程度上仍不清楚。本文中，我们描述了一种新颖的实验流程：染色质相关RNA免疫沉淀（CARIP）结合新一代测序（CARIP-Seq），用于在全基因组范围内鉴定ES细胞中与染色质相关的RNA，包括用于新一代测序的文库构建，以及通过ChIP-Seq绘制组蛋白修饰、转录因子和表观遗传修饰因子的全基因组占据图谱。与其它RIP-Seq方法7不同，CARIP-Seq包含交联和超声处理步骤，从而能够直接鉴定与染色质相关联的RNA。综上所述，ChIP-Seq是一种强大的用于识别全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的工具，而CARIP-Seq则是一种有效用于系统分析与染色质组分相关联的RNA的方法。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下的培养。

注意：小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在培养基中培养，培养皿需预先包被明胶并铺有一层经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。然而，在进行下游的表观遗传学或表达分析之前，应去除MEFs，以避免MEF相关的染色质和RNA污染。

  1. 饲养层的制备：向6孔细胞培养板中加入2 mL 0.1%明胶水溶液进行明胶包被，并在37 °C孵育20–30分钟。
  2. 制备含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基，其中包含2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。
  3. 从小鼠胚胎发育第13.5至14.5天（E13.5–E14.5）的胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）18,19，或从商业供应商处获取。使用丝裂霉素C处理或γ射线照射等标准方案对MEFs进行有丝分裂失活19。或者，可直接从商业供应商处购买有丝分裂失活的MEFs（iMEFs）。
  4. MEFs的培养：将MEF培养基预热至37 °C，解冻冻存的iMEFs细胞管，然后在37 °C、5% CO2条件下，使用含10% FBS的MEF培养基进行培养。以每孔约200,000个细胞的密度将MEFs接种至6孔培养板中。
  5. 在饲养层细胞（iMEFs）上培养胚胎干细胞（ES细胞）。
    1. 接种iMEFs后12–24小时，将50 mL ES细胞培养基（高糖DMEM、含10 ng/mL白血病抑制因子LIF、15% ES细胞专用胎牛血清、1×细胞培养级2-巯基乙醇、1×谷氨酰胺、非必需氨基酸（NEAA）和1×青霉素/链霉素）预热至37 °C，并置于含5% CO2的培养箱中。
    2. 吸除含iMEFs的细胞培养板中的培养基，将解冻后于37 °C复温的ES细胞用2 mL培养基重悬，接种至iMEFs层上。将培养皿放入培养箱时，应沿"t"字形轨迹移动培养皿，以使细胞均匀分布，并防止细胞聚集于培养皿中心。
  6. 将ES细胞传代至无饲养层的明胶包被培养皿中。在ES细胞达到汇合前进行传代。若ES细胞克隆之间保持均匀间距且未发生汇合，则更有利于维持其自我更新能力。当大量ES细胞克隆相互接触时，表明细胞密度过高。
    1. 按上述方法用明胶包被6孔培养板。将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C预热约10–15分钟。
    2. 随后进行ES细胞传代：首先用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。等待1–2分钟，直至细胞克隆脱落。使用1 mL移液枪头反复吹打约5次，使克隆解离为单细胞悬液。
    3. 在显微镜下确认ES细胞已充分解离为单细胞。为终止反应，即"中和"胰蛋白酶活性，加入含10% FBS的MEF培养基。室温下以300 × g离心3–5分钟，吸除上清液。
    4. 将细胞沉淀用2 mL ES细胞培养基重悬，培养基中添加糖原合成酶激酶-3（GSK3）抑制剂（CHIR99021；GSK3i），或使用2i条件（MEKi/GSK3i）（2–3 µM GSK3i：CHIR99021；1 µM MEKi：PD0325901）。
    5. 吸除培养皿中的明胶溶液，向皿中加入含ES细胞的2 mL培养基，置于37 °C培养箱中（图1A–D）。在无饲养层细胞（iMEFs）且无血清的条件下，同时抑制GSK3i和MEKi可促进ES细胞进入基础态原始多能性20。在进行交联实验前，应将ES细胞连续传代2–3次以彻底清除残留的MEFs。

2. ChIP 和 CARIP 实验中 ES 细胞的交联

  1. 用 PBS 洗涤 ES 细胞以收获细胞，然后加入预热至 37 °C 的 0.25% 胰蛋白酶。在室温下孵育数分钟。避免胰蛋白酶消化过度，否则会导致细胞死亡。使用显微镜评估单细胞解离情况。
  2. 按照上述传代 ES 细胞的方法终止胰蛋白酶消化，并在室温下以 300 × g 离心 3–5 分钟。
  3. 将细胞重悬于预热（37 °C）的 MEF 培养基（10% FBS/DMEM）中，浓度为 2 × 106 个细胞/mL。
  4. 为交联细胞，向细胞中加入 37% 甲醛溶液，使其终浓度为 1%，并在 37 °C 下于锥形管（15 mL 或 50 mL）中孵育 8 分钟。在 8 分钟内翻转管子数次，以实现均匀固定。
    注意：CARIP 实验中交联时间可根据经验优化。若改变交联时间，超声破碎的循环次数也应相应调整。此外，与室温交联相比，37 °C 可提高交联效率。固定温度也可根据经验进行优化。
  5. 为终止固定反应，加入预冷（4 °C）的 1.25 M 甘氨酸溶液，使其终浓度为 0.125 M。将管子置于旋转仪上，以 8 rpm 在室温下翻转 5 分钟。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，并吸除上清液。
  6. 用预冷的 PBS（4 °C）洗涤细胞沉淀，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，吸除 PBS。再次用 PBS 洗涤细胞。随后，将每份 15 × 106 个细胞分装至 15 mL 管中。
  7. 通过将细胞沉淀置于液氮中 1 分钟、干冰上 5 分钟，或立即放入 -80 °C 环境中进行冷冻。
    注意：固定的 ES 细胞沉淀可在不影响后续实验质量的前提下储存长达 6 个月。

3. 用于 ChIP 和 CARIP 的染色质超声处理

  1. 将固定的 ES 细胞沉淀在冰上解冻。用超声破碎缓冲液（2.5 mL）重悬细胞沉淀。对于转录因子或表观遗传调控蛋白（蛋白因子），使用 1× TE、1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂混合液重悬沉淀。对于组蛋白修饰，使用 1× TE、0.1% SDS、1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂重悬沉淀。
    注意：虽然添加 SDS 可提高超声破碎效率，但可能不利于某些染色质组分或转录因子的检测。
  2. 进行染色质免疫沉淀（ChIP）时，以 40% 振幅进行 14–18 个循环（开启 30 秒，暂停 30 秒）超声破碎染色质。进行染色质相关 RNA 免疫沉淀（CARIP）时，减少超声循环次数（8–10 个循环）。由于细胞类型、固定条件及超声设备存在差异，超声条件应通过实验优化确定。
  3. 向超声破碎缓冲液中加入 28 µL 10% SDS（用于蛋白因子）、28 µL 脱氧胆酸钠和 0.28 mL 10% Triton-X100，并充分混匀。
    注意：向超声破碎缓冲液中添加这些成分后即形成 RIPA 缓冲液。
  4. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，以预清除染色质。将上清液转移至新离心管中，随后进行染色质免疫沉淀。
  5. 或者，超声破碎后的染色质可保存于 -80 °C，待后续使用。但需注意，超声破碎后的染色质在 -80 °C 保存可能导致蛋白因子 ChIP 的质量下降。

4. ChIP 和 CARIP 流程

  1. 向一个1.5 mL低吸附离心管中加入40 µL蛋白A或G磁珠。加入600 µL PBS洗涤磁珠。将离心管置于含磁铁的支架上，室温孵育1 min，吸除PBS，再用100 µL PBS重悬磁珠。
  2. 向含有磁珠的离心管中加入 2–4 µg 抗体。将离心管置于旋转仪上，室温下以 8 rpm 转速孵育并旋转 40 分钟，使抗体与磁珠充分结合。将离心管放入磁力架中，室温孵育 1 分钟，随后移除 PBS。
  3. 加入 200 µL PBS 洗涤磁珠。PBS 洗涤用于去除游离的 IgG。每次洗涤步骤之间，在室温下孵育并旋转反应管 5 分钟。将反应管置于磁力架上，吸除 PBS。
  4. 通过将超声处理后的染色质提取物（4 × 106 每轮免疫沉淀使用指定数量的细胞，与磁珠混合后，4 °C 旋转孵育（过夜）。
  5. 洗涤磁珠。将样品在室温下与以下缓冲液孵育，并在每种缓冲液中旋转孵育10分钟：用1 mL RIPA缓冲液（TE（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA）pH 8.0，1% Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS）洗涤两次，再用1 mL含0.3 M NaCl的RIPA缓冲液洗涤两次 NaCl，用1 mL LiCl缓冲液（0.5% 脱氧胆酸钠，0.5% NP40，0.25 M LiCl）洗两次，用含0.2% Triton X-100的TE缓冲液洗一次，再用1 mL TE缓冲液洗一次。
  6. 染色质免疫沉淀的去交联。将磁珠重悬于100 µL TE缓冲液中，加入3 µL 10% SDS和5 µL蛋白酶K（20 mg/mL）。将样品在65 °C孵育过夜。
    注意：此步骤中必须使用帕拉菲膜（parafilm）或塑料封口膜覆盖管口，以防止蒸发。
    1. 次日，将离心管颠倒数次以混匀。接着，使用磁力架将上清液转移至新的离心管中。为洗涤磁珠，加入含0.5 M NaCl的TE缓冲液100 µL，并随后将两次所得上清液合并。
  7. CARIP 脱交联。将磁珠重悬于 100 µL TE 缓冲液中，加入 3 µL 10% SDS 和 5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）。将样品在 65 °C 下孵育 4 至 12 小时。由于不同细胞类型、超声处理条件和固定条件等因素存在差异，65 °C 下的孵育时间需根据经验确定。
    1. 将离心管颠倒3-5次以混匀，置于磁力架上，随后将上清液转移至新的离心管中。
    2. 加入100 µL含0.5 M NaCl的TE缓冲液洗涤磁珠，随后合并两次上清液。
      注意：必须使用无核酸酶的试剂（例如．，TE缓冲液，SDS 等等以防止在去交联步骤中DNA或RNA的丢失。
  8. 使用 200 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（PCI）（25:24:1，v/v）提取 DNA/RNA。
    注意：也可根据制造商说明书使用商业试剂盒提取RNA。振荡30秒，室温下以10,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新离心管中。
    1. 加入 2 µL GlycoBlue、20 µL 3 M 醋酸钠和 600 µL 乙醇以沉淀 DNA/RNA。轻轻颠倒混匀约 5–8 次，将样品置于干冰或 -80 °C 条件下至少 1–2 小时。
    2. 在4 °C下使用台式冷冻离心机以10,000 × g离心30分钟。将沉淀物空气干燥 <1 分钟后重悬于 40 µL EB 缓冲液（10 mM Tris-HCl）中。进行 ChIP-Seq 文库构建时，继续执行步骤 6。
  9. 使用DNase去除染色质相关RNA免疫沉淀（CARIP）样品中的DNA。将10倍浓度的DNase缓冲液加入CARIP样品中至终浓度为1倍。每不超过10 µg RNA（50 µL反应体系）加入1 µL DNase。37 °C孵育30分钟。用苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）抽提RNA样品。将RNA沉淀重悬于无核酸酶的H₂O中。2O.

5. 用于CARIP-Seq的双链cDNA合成

  1. 第一链cDNA的合成。进行逆转录反应时，在适用于PCR仪的离心管中配制以下反应体系：10.5 µL RNA和1 µL随机六聚体引物（3 µg/µL）。
  2. 将离心管在65 °C孵育5分钟以变性二级结构，随后置于冰上保存2分钟。混合以下组分：4 µL第一链缓冲液、2 µL 0.1 M DTT、1 µL dNTP和0.5 µL RNase OUT。接着，向PCR管中加入7.5 µL上述预混液。在25 °C孵育2分钟。加入1 µL Superscript II（200 U/µL），并按以下条件孵育：25 °C孵育10分钟，42 °C孵育50分钟，70 °C孵育15分钟，最后维持在4 °C。
  3. 第二链cDNA合成。将离心管置于冰上。按顺序依次加入以下组分：91 µL经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水、30 µL 5×第二链反应缓冲液、3 µL dNTP混合液（10 mM）、1 µL E. Coli DNA连接酶（10 U/µL）、4 µL E. Coli DNA聚合酶（10 U/µL）和1 µL E. Coli RNase H（2 U/µL）。轻轻涡旋混匀，并在16 °C孵育2小时。
    注意：通过弹击或翻转离心管的方式可能不足以充分混匀试剂。
  4. 加入2 µL T4 DNA聚合酶，在16 °C孵育5分钟。使用PCR纯化试剂盒纯化cDNA（双链cDNA，dscDNA）。用40 µL EB缓冲液洗脱dscDNA。
  5. 片段化双链cDNA。使用水浴超声仪和1.5 mL离心管将cDNA（dscDNA）超声剪切至250–500 bp大小。dscDNA的超声处理对于降低片段长度、促进完整RNA转录本的测序至关重要。
  6. 当使用标准型号的水浴超声仪时，建议对样品进行3次×10分钟或4次×10分钟的超声处理。
    注意：对于总量不超过1 µg的总RNA，应使用3个循环；对于1–5 µg的总RNA，建议使用4个循环。每次超声循环后短暂离心离心管，并通过添加新鲜冰块维持水浴低温。
  7. 当使用Pico超声仪时，建议对1–5 µg总RNA采用6个循环，每个循环条件为（开启30秒，关闭90秒）。每进行2–3个超声循环后短暂离心离心管。可通过将部分剪切后的dscDNA（3–4 µL）上样至2%琼脂糖凝胶电泳来评估超声效率。由于不同超声仪之间存在差异，建议通过实验优化超声条件。
  8. 按照步骤6所述方法进行文库构建，用于下一代测序。

6. ChIP-Seq 与 CARIP-Seq 文库构建

  1. 使用DNA末端修复试剂盒修复DNA末端。该试剂盒用于生成平末端DNA。在1.5 mL低吸附离心管中配制以下反应体系：34 µL DNA、5 µL 2.5 mM dNTPs、5 µL 10 mM ATP、5 µL 10×末端修复缓冲液（含5 mM DTT、100 mM醋酸镁、660 mM醋酸钾、300 mM醋酸三羟甲基氨基甲烷，pH 7.8）以及1 µL末端修复酶混合物（T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶）。
  2. 室温孵育样品45分钟。
  3. 使用反应纯化试剂盒纯化DNA。用32 µL预热（65 °C）的EB缓冲液洗脱末端修复后的DNA。尽管在ChIP后或CARIP后进行文库构建前，我们通常不测定DNA或RNA的浓度，但仍建议起始量至少为5–10 ng的ChIP DNA或CARIP RNA。
  4. 在末端修复后的DNA上添加3' "A"突出端。在1.5 mL低吸附离心管中加入以下组分：30 µL上述DNA、5 µL 10×NEB缓冲液2、1 µL 10 mM dATP储备液、11 µL H2O以及3 µL 5 U/µL Klenow片段（3'-5'外切酶缺陷型），用移液器轻轻混匀。
  5. 37 °C孵育30分钟。
  6. 使用反应纯化试剂盒纯化DNA。用25 µL预热（65 °C）的EB缓冲液洗脱DNA。
  7. 连接接头。在冰上加入以下组分：23 µL上述DNA、3 µL 10×T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL退火后的PE接头或多重测序接头（4 µM）以及3 µL T4 DNA连接酶（400 U/µL），用移液器轻轻混匀。
    注：接头序列也可从商业来源获得。
    寡核苷酸序列：
    PE接头
    5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    多重测序接头
    5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
  8. 室温孵育30分钟。
  9. 使用预制琼脂糖凝胶（2%）进行DNA片段大小选择。电泳运行10分钟。
  10. 切取对应于250–450 bp的条带区域。
    注：通过切取大于200 bp的凝胶区域，可降低未连接接头二聚体污染的可能性。在PCR步骤前必须去除所有未连接的接头。
  11. 使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。用20 µL EB缓冲液洗脱。
  12. 对含有成对末端（PE）接头的连接产物进行PCR扩增及文库纯化。在PCR管中加入以下组分：12 µL上述DNA的50%、12 µL水、25 µL主混合液（Phusion HF）、1 µL PE PCR引物1.0和1 µL PE PCR引物2.0。
    注：寡核苷酸序列也可从商业来源获得。
    寡核苷酸序列：
    PE PCR引物1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    PE PCR引物2.0
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
  13. 对含有Index PE接头的连接产物进行PCR扩增及文库纯化。加入以下组分：12 µL上述DNA的50%、12 µL水、1 µL PCR引物InPE 1.0（1:2稀释）、1 µL PCR引物InPE 2.0（1:2稀释）以及1 µL PCR引物Index（1:2稀释）。
    注：寡核苷酸序列也可从商业来源获得。
    寡核苷酸序列：
    多重测序PCR引物1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    多重测序PCR引物2.0
    5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    PCR引物Index序列1–12
    PCR引物，Index 1
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 2
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 3
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 4
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 5
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 6
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 7
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 8
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 9
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 10
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 11
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
    PCR引物，Index 12
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC
  14. 采用以下条件进行PCR扩增循环（98 °C变性30秒，18个循环：98 °C 10秒、65 °C 30秒、72 °C 30秒，72 °C延伸5分钟，4 °C保存）。
    注：PCR循环数应根据实验经验确定。
  15. 对PCR产物进行片段大小选择。将DNA上样至预制E-Gel EX（2%）或自制2%琼脂糖凝胶，切取300–500 bp的条带区域。
  16. 使用凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化DNA。用20 µL EB缓冲液洗脱最终PCR产物。
  17. 使用荧光计测定文库浓度。进行下一代测序。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们利用本 ChIP-Seq 方案成功检测了胚胎干细胞（ES 细胞）中全基因组范围内的 H3K4me3、H3K4me2 和 KDM5B 的结合情况6。ES 细胞在无饲养层条件下培养（图 1），并按上述方法进行交联。随后按照 ChIP-Seq 方案第 3.2 步所述进行超声处理，并通过 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 片段大小（图 2）。接着，按照第 4 步所述进行 ChIP 实验，并按照第 6 步所述进行文库构建。ChIP-Seq 文库在新一代测序平台上进行测序。代表性自定义 UCSC 浏览器视图显示，在核心多能性基因 POU5F1（图 3A）以及 HOXC 基因簇（图 3B）处，H3K4me3、H3K4me2 和 KDM5B 均存在富集。此外，按照第 4–6 步所述方...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ChIP-Seq 是一种用于评估胚胎干细胞（ES 细胞）中全基因组范围内蛋白质-DNA 相互作用位置的有效方法（例如，转录因子、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰与 DNA 的相互作用），而新开发的 CARIP-Seq 协议则适用于研究 RNA 与染色质组分在全基因组范围内的关联。ChIP-Seq 是评估 ES 细胞及其他细胞类型表观遗传景观的一项基础工具。ChIP-Seq 与 CARIP-Seq 文库的质量在很大程度上依赖于 ChIP 级别的抗体。可通过 ChIP-PCR 实验经验性地确定抗体是否适用于 ChIP-Seq，通常在阳性对照区域相对于无结合区域的富集倍数达到 ≥ 3 至 5 倍时，即可获得高质量的 ChIP-Seq 数据25。同样，可通过与 ChIP-Seq 类似的方法（稍作修改）测试抗体是否适用于 CARIP-Seq。在按照上述方法部分所述完成 CARIP 协议中的 RNA 免疫沉淀（IP）步骤后，应进行逆转录 PCR 以生成 cDNA，并以此为模板进行定量逆转录 PCR（Q-RT-PCR）。建议在多个基因组区域评估 ChIP 或 CARIP 后的富集情况。在评估用...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由韦恩州立大学、卡曼诺斯癌症研究所及美国国家心肺血液研究所（1K22HL126842-01A1）授予 B.L.K. 的资助项目支持。本研究利用了韦恩州立大学高性能计算网格提供的计算资源（<https://www.grid.wayne.edu/>）。我们感谢 Jiji Kurup 在 CARIP-Seq 数据分析方面提供的协助。

作者贡献：

B.L.K. 提出了 CARIP-Seq 方法，设计并实施了 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 实验，分析了测序数据，并起草了 manuscript。所有作者均已阅读并批准了该 manuscript 的最终版本。

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材料

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小鼠白血病抑制因子（ESGRO LIF）EMD Millipore106 或 107 单位
GSK3β 抑制剂 CHIR99021（GSK3i）Stemgent溶剂：DMSO 10 mM
MEK 抑制剂 PD0325901（MEKi）Stemgent溶剂：DMSO 10 mM
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖Invitrogen11965092
PBS（磷酸盐缓冲盐水）Invitrogen10010031
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红Gibco25200056
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15140122
2-巯基乙醇（50 mM）Gibco31350010
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）Gibco11140076
EmbryoMax 胚胎干细胞级胎牛血清，500 mlEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0.1% 明胶溶液EMD MilliporeES-006-B
甘氨酸SigmaG7126-500G水溶液储存浓度为 1.25 M
甲醛溶液SigmaF8775-500ML
TE（Tris EDTA）pH 8.0 1XQuality Biological351-011-131
苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液Sigma93482-250ML-F
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物Roche11697498001
十二烷基硫酸钠溶液（20%）Quality BiologicalA611-0837-10
Q125 超声破碎仪Qsonica4422
Triton X-100 溶液Sigma93443-100ML
脱氧胆酸钠Sigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Protein G 免疫沉淀磁珠Invitrogen10004D
Dynabeads Protein A 免疫沉淀磁珠Invitrogen10002D
Dynabeads Protein A/Protein G 及磁力架起始套装Invitrogen10015D
氯化锂SigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74104
Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（用于从总RNA样品中纯化mRNA）Invitrogen61006
SuperScript 双链 cDNA 合成试剂盒Invitrogen11917010
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
End-It DNA 末端修复试剂盒LucigenER81050
Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型）NEBM0212L
dATP（10 mM）Invitrogen18252015
T4 DNA 连接酶NEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品Invitrogen10488085
E-gel EX 琼脂糖凝胶，2%InvitrogenG402002
Phusion 高保真 2X 预混液（含 HF 缓冲液）Thermo FisherF531LPM
ChIPAb+ 三甲基化组蛋白 H3（Lys4）— 经 ChIP 验证的抗体EMD Millipore17-614
抗组蛋白 H3（二甲基化 K4）抗体 [Y47] — ChIP 级（ab32356）Abcamab32356
Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔）Fisher720083
Falcon 标准组织培养皿（10 cm）Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit 氟光计 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo FisherQ32851
MinElute 反应纯化试剂盒Qiagen28204
MinElute 凝胶回收试剂盒Qiagen28604
抗组蛋白 H4（三甲基化 K20）抗体 — ChIP 级（ab9053）Abcamab9053
Labquake 旋转混合仪Thermo Fisher400110Q
Illumina HiSeq 测序平台Illumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32(2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28(2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

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