本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA 图谱。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎干细胞（ES细胞）的自我更新 和分化受到外源性信号以及转录因子、表观遗传调控因子和组蛋白翻译后修饰等内在网络的共同调控，这些因素协同影响邻近基因的基因表达状态。RNA也被证实可与多种蛋白质相互作用，调控染色质动态 和基因表达。染色质相关RNA免疫沉淀结合高通量测序（CARIP-Seq）是一种用于系统鉴定与染色质蛋白结合的RNA的新方法；而染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-Seq）则是一种强大的基因组学技术，可用于在全球范围内绘制胚胎干细胞中组蛋白翻译后修饰、转录因子和表观遗传修饰因子的定位图谱。本文中，我们描述了CARIP-Seq和ChIP-Seq的实验方法，包括高通量测序文库的构建，以获得胚胎干细胞中染色质相关RNA和表观基因组的全局图谱。
引言
胚胎干细胞（ES细胞）的命运决定受到细胞外信号与多种转录调控因子（包括组蛋白修饰酶以及组蛋白尾部的翻译后修饰）之间相互作用的调控。这些相互作用促进了染色质的可及性，并将染色质包装成两种状态之一：具有开放结构且转录活跃的常染色质（euchromatin），以及结构紧密且通常转录失活的异染色质（heterochromatin）。具有DNA序列特异性结合能力的转录因子和表观遗传修饰因子可结合于常染色质区域，参与基因表达的调控。新一代测序技术，如ChIP-Seq1，在绘制全基因组范围内的转录调控网络方面发挥了关键作用，这些网络对于ES细胞的自我更新和多能性至关重要2,3,4,5,6。此外，尽管RNA免疫共沉淀结合新一代测序（RIP-Seq）7对RNA-蛋白质相互作用的研究表明，DNA结合蛋白可通过与RNA相互作用来调控转录事件7,8,9<....
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方案
1. 小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下的培养。
注意：小鼠胚胎干细胞（ES细胞）通常在培养基中培养，培养皿需预先包被明胶并铺有一层经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。然而，在进行下游的表观遗传学或表达分析之前，应去除MEFs，以避免MEF相关的染色质和RNA污染。
- 饲养层的制备：向6孔细胞培养板中加入2 mL 0.1%明胶水溶液进行明胶包被，并在37 °C孵育20–30分钟。
- 制备含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基，其中包含2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。
- 从小鼠胚胎发育第13.5至14.5天（E13.5–E14.5）的胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）18,19，或从商业供应商处获取。使用丝裂霉素C处理或γ射线照射等标准方案对MEFs进行有丝分裂失活19。或者，可直接从商业供应商处购买有丝分裂失活的MEFs（iMEFs）。
- MEFs的培养：将MEF培养基预热至37 °C，解冻冻存的iMEFs细胞管，然后在37 °C、5% CO2条件下，使用含10% FBS的MEF培养基进行培养。以每孔约200,000个细胞的密度将MEFs接种至6孔培养板中。
- 在....
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结果
我们利用该ChIP-Seq方案成功检测了ES细胞中H3K4me3、H3K4me2和KDM5B的全基因组结合情况6. 胚胎干细胞在无饲养层条件下培养（图1），并按上述方法进行交联。随后按照ChIP-Seq方案第3.2步所述进行超声处理，并通过2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化效果图2。接下来，按照步骤4所述进行ChIP实验，并按照步骤6所述进行文库构建。ChIP-Seq文库在新一代测序平台上进行测序。代表性定制的UCSC浏览器视图显示，在核心多能性基因处存在H3K4me3、H3K4me2和KDM5B的富集 POU5F1 (图 3A），以及 HOXC 基因簇（图 3B）。CARIP-Seq 按照步骤 4-6 所述方案进行。代表性 UCSC 浏览器视图显示，在 ES 细胞中某一.......
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讨论
ChIP-Seq 是一种用于评估胚胎干细胞（ES 细胞）中全基因组范围内蛋白质-DNA 相互作用位置的有效方法（例如，转录因子、组蛋白修饰酶、组蛋白修饰与 DNA 的相互作用），而新开发的 CARIP-Seq 协议则适用于研究 RNA 与染色质组分在全基因组范围内的关联。ChIP-Seq 是评估 ES 细胞及其他细胞类型表观遗传景观的一项基础工具。ChIP-Seq 与 CARIP-Seq 文库的质量在很大程度上依赖于 ChIP 级别的抗体。可通过 ChIP-PCR 实验经验性地确定抗体是否适用于 ChIP-Seq，通常在阳性对照区域相对于无结合区域的富集倍数达到 ≥ 3 至 5 倍时，即可获得高质量的 ChIP-Seq 数据25。同样，可通过与 ChIP-Seq 类似的方法（稍作修改）测试抗体是否适用于 CARIP-Seq。在按照上述方法部分所述完成 CARIP 协议中的 RNA 免疫沉淀（IP）步骤后，应进行逆转录 PCR 以生成 cDNA，并以此为模板进行定量逆转录 PCR（Q-RT-PCR）。建议在多个基因组区域评估 ChIP 或 CARIP 后的富集情况。在评估用.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由韦恩州立大学、卡曼诺斯癌症研究所及美国国家心肺血液研究所（1K22HL126842-01A1）授予 B.L.K. 的资助项目支持。本研究利用了韦恩州立大学高性能计算网格提供的计算资源（<https://www.grid.wayne.edu/>）。我们感谢 Jiji Kurup 在 CARIP-Seq 数据分析方面提供的协助。
作者贡献：
B.L.K. 提出了 CARIP-Seq 方法，设计并实施了 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 实验，分析了测序数据，并起草了 manuscript。所有作者均已阅读并批准了该 manuscript 的最终版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠白血病抑制因子（ESGRO LIF） | EMD Millipore | 106 或 107 单位 | |
| GSK3β 抑制剂 CHIR99021（GSK3i） | Stemgent | 溶剂：DMSO 10 mM | |
| MEK 抑制剂 PD0325901（MEKi） | Stemgent | 溶剂：DMSO 10 mM | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖 | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Invitrogen | 10010031 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红 | Gibco | 25200056 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 2-巯基乙醇（50 mM） | Gibco | 31350010 | |
| MEM 非必需氨基酸溶液（100X） | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax 胚胎干细胞级胎牛血清，500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% 明胶溶液 | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 甘氨酸 | Sigma | G7126-500G | 水溶液储存浓度为 1.25 M |
| 甲醛溶液 | Sigma | F8775-500ML | |
| TE（Tris EDTA）pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液 | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 | |
| 十二烷基硫酸钠溶液（20%） | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 超声破碎仪 | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 溶液 | Sigma | 93443-100ML | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G 免疫沉淀磁珠 | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A 免疫沉淀磁珠 | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G 及磁力架起始套装 | Invitrogen | 10015D | |
| 氯化锂 | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA 纯化试剂盒（用于从总RNA样品中纯化mRNA） | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript 双链 cDNA 合成试剂盒 | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA 末端修复试剂盒 | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型） | NEB | M0212L | |
| dATP（10 mM） | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA 标准品 | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX 琼脂糖凝胶，2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion 高保真 2X 预混液（含 HF 缓冲液） | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ 三甲基化组蛋白 H3（Lys4）— 经 ChIP 验证的抗体 | EMD Millipore | 17-614 | |
| 抗组蛋白 H3（二甲基化 K4）抗体 [Y47] — ChIP 级（ab32356） | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar 平底细胞培养板（6 孔） | Fisher | 720083 | |
| Falcon 标准组织培养皿（10 cm） | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit 氟光计 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute 反应纯化试剂盒 | Qiagen | 28204 | |
| MinElute 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28604 | |
| 抗组蛋白 H4（三甲基化 K20）抗体 — ChIP 级（ab9053） | Abcam | ab9053 | |
| Labquake 旋转混合仪 | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq 测序平台 | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
参考文献
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells....
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重印与许可
