使用双光子激光消融神经元群体及其在斑马鱼幼鱼中通过钙成像与行为记录进行评估

摘要

本文介绍了一种利用双光子激光消融斑马鱼幼鱼中基因标记的神经元亚群的实验方案。

摘要

为了确定神经元亚群在行为中的作用，必须在活体动物中测试阻断其活性所产生的后果。当神经元被荧光探针特异性标记时，激光消融神经元是实现这一目标的有效方法。本研究描述了使用双光子显微镜对神经元亚群进行激光消融，并检测其功能和行为学后果的实验方案。本研究以斑马鱼幼鱼的捕食行为作为研究模型。已知视顶盖-下丘脑环路介导这种由视觉驱动的捕食行为。实验中对斑马鱼视顶盖区域进行了激光消融，并检测了下丘脑下叶（ILH；视顶盖投射的靶区）的神经元活动。同时，还测试了视顶盖消融后的捕食行为表现。

引言

为了理解行为如何由大脑中的神经元活动产生，有必要确定参与该行为生成的神经环路。在幼体阶段，斑马鱼为研究与行为相关的大脑功能提供了一个理想的动物模型，因为其体积小且透明的大脑使得在观察行为的同时，能够在大脑较大区域内以细胞分辨率研究神经元活动¹。随着基因编码的钙离子（Ca）指示剂（GECIs）如GCaMP的发明，对特定神经元中神经元活动的成像已成为可能²。通过在行为活动的动物中进行钙成像，GCaMP转基因斑马鱼已被证明在将功能神经环路与行为关联方面具有重要价值³。

尽管钙成像可以揭示神经元活动与行为之间的相关性，但要证明因果关系，抑制神经元活动并检测其对行为的影响是至关重要的步骤。实现这一目标有多种方法：利用改变特定神经回路的基因突变⁴、在特定神经元中表达神经毒素^5,6、使用光遗传学工具（如卤视紫红质）⁷，以及靶向神经元的激光消融^8,9。其中，激光消融特别适用于消除数量较少的特定神经元的活动。通过杀死神经元从而....

方案

1. 使用双光子激光显微镜消融特定神经元亚群

注意：如果用户计划在消融后进行钙成像，请使用 UAShspzGCaMP6s 品系²¹。如果用户计划在消融后进行行为记录，请使用 UAS:EGFP 品系，因为消融 EGFP 阳性细胞比消融表达 GCaMP6s 的细胞更容易操作。

1. 首先建立携带Gal4的果蝇品系与UAS:EGFP或UAShspzGCaMP6s品系的杂交，以标记待研究的特定神经元。务必使用 珍珠层 以便为双亲提供背景信息 珍珠层 可获得纯合子。
   注意： 纯合子 珍珠层 体表不含黑色素细胞（图1B）。在本研究中，使用了标记顶盖前区的 Gal4 品系 gSAIzGFFM119B 和标记间脑后部外侧区（ILH）的另一个 Gal4 品系 hspGFFDMC76A²¹.
2. 在设置交配后的第二天，收集斑马鱼卵，并将其培育至幼体阶段，此时目标神经元将表达荧光报告基因。
3. 将斑马鱼幼鱼固定在2%低熔点琼脂糖中（图1B

结果

特定神经元通过Gal4品系驱动，被遗传标记为EGFP或GCaMP6s。使用Gal4品系gSAIzGFFM119B标记了位于前顶盖区的一个核团（大细胞浅表前顶盖核）以及嗅球中的一群亚群神经元。另一个Gal4品系hspGFFDMC76A用于标记ILH。我们在gSAIzGFFM119B Gal4品系与UAS:EGFP报告鱼杂交所得的斑马鱼幼体中，双侧激光消融前顶盖神经元（图2A左图），并以双侧消融嗅球神经元作为对照（图2A右图）。结果显示，双光子激光能够特异性消融靶细胞，而对邻近细胞或神经纤维无影响（图2B）。

顶盖前区神经元将其轴突向同侧ILH投射。在此，我们利用钙成像技术研究了.......

讨论

尽管双光子激光器具有优异的空间分辨率，可特异性消融单个神经元，但必须格外注意避免因热量对脑组织造成不必要的损伤。消融实验中最重要的步骤是确定最佳的激光照射剂量。照射剂量不足将无法杀死神经元；而照射剂量过高则会因热效应损伤周围组织，导致非预期的结果。最佳激光照射参数范围（包括感兴趣区域的面积、扫描迭代次数和扫描速度）通常较窄。多个因素会影响消融的效率。

首先，通过使用不同的荧光报告蛋白，需要针对每种报告蛋白优化消融条件。GCaMP 的表达位于无细胞核的细胞质中。相比之下，EGFP 的荧光遍布整个细胞内部，与 GCaMP 相比，这可能更有利于实现靶向细胞的高效且特异性的消融。使用 GCaMP 还存在一个不利因素：激光消融表达 GCaMP 的细胞后，由于瞬间大量钙离子内流，可能导致荧光强度增加；而使用 EGFP 进行消融时，荧光强度则会下降。因此，荧光强度的变化不能作为 GCaMP 消融程度的可靠指标。在此类情况下，可能需要通过观察特定时间后荧光细胞的消失来验证消融效果。消融区域内钙信号的缺失或显著减弱可作为使用 GCaMP 成功消融的另一判断标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NuSieve GTG 琼脂糖	Lonza	Cat.#50080	低熔点琼脂糖
6 cm 培养皿	FALCON	Product#:351007
解剖针	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		双光子激光扫描显微镜
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X 物镜
Imager.Z1	Carl Zeiss		落射荧光显微镜
ZEN	Carl Zeiss		共聚焦显微镜图像采集软件
Secure-Seal 杂交室垫圈，8 个腔室，直径 9 mm × 深度 0.8 mm	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	用作钙成像中的记录腔室
成像腔室	Grace Bio-Labs	CoverWell 成像腔室 PCI-A-2.5	用作行为记录腔室
手术刀	MANI	眼科手术刀 MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	型号：C11440-22CU	科学级 CMOS 相机
HCImage	Hamamatsu Photonics		图像采集软件
硬盘记录模块	Hamamatsu Photonics		可实现将视频文件快速保存至硬盘驱动器的软件模块
SZX7	Olympus		体视显微镜
DF PL 0.5X	Olympus		SZX7 用物镜
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	产品编号：GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS 相机
XIMEA xiQ 相机	XIMEA	产品编号：MQ042RG-CM	CMOS 相机
环形 LED 光源	CCS	型号：LDR2-100SW2-LA	白色 LED
尼龙网 32µm	东京筛网	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
尼龙网 13µm	东京筛网	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
金属筛网，孔径 150 微米	东京筛网		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
金属筛网，孔径 75 微米	东京筛网		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		干啤酒酵母
LabVIEW	National Instruments		用于编程的集成开发环境
Mai-Tai HP	Spectra Physics		双光子激光器