使用双光子激光消融神经元群体及其在斑马鱼幼鱼中通过钙成像与行为记录进行评估

摘要

本文介绍了一种利用双光子激光消融斑马鱼幼鱼中基因标记的神经元亚群的实验方案。

摘要

为了确定神经元亚群在行为中的作用，必须在活体动物中测试阻断其活性所产生的后果。当神经元被荧光探针特异性标记时，激光消融神经元是实现这一目标的有效方法。本研究描述了使用双光子显微镜对神经元亚群进行激光消融，并检测其功能和行为学后果的实验方案。本研究以斑马鱼幼鱼的捕食行为作为研究模型。已知视顶盖-下丘脑环路介导这种由视觉驱动的捕食行为。实验中对斑马鱼视顶盖区域进行了激光消融，并检测了下丘脑下叶（ILH；视顶盖投射的靶区）的神经元活动。同时，还测试了视顶盖消融后的捕食行为表现。

引言

为了理解行为如何由大脑中的神经元活动产生，有必要确定参与该行为生成的神经环路。在幼体阶段，斑马鱼为研究与行为相关的大脑功能提供了一个理想的动物模型，因为其体积小且透明的大脑使得在观察行为的同时，能够在大脑较大区域内以细胞分辨率研究神经元活动¹。随着基因编码的钙离子（Ca）指示剂（GECIs）如GCaMP的发明，对特定神经元中神经元活动的成像已成为可能²。通过在行为活动的动物中进行钙成像，GCaMP转基因斑马鱼已被证明在将功能神经环路与行为关联方面具有重要价值³。

尽管钙成像可以揭示神经元活动与行为之间的相关性，但要证明因果关系，抑制神经元活动并检测其对行为的影响是至关重要的步骤。实现这一目标有多种方法：利用改变特定神经回路的基因突变⁴、在特定神经元中表达神经毒素^5,6、使用光遗传学工具（如卤视紫红质）⁷，以及靶向神经元的激光消融^8,9。其中，激光消融特别适用于消除数量较少的特定神经元的活动。通过杀死神经元从而不可逆地消除其活动，有助于评估其行为学后果。

在斑马鱼幼体阶段可观察到一种有趣的行为，即捕食行为 （图1A）。这种由视觉引导、具有明确目标的行为为研究视觉敏锐度¹⁰、视觉-运动转换^11,12,13、视觉感知与物体识别^{14,15,16,17,18}以及决策过程¹⁹提供了一个理想的实验系统。捕食者如何识别猎物，以及猎物的检测如何引发捕食行为，一直是神经行为学中的核心问题²⁰。本文重点探讨由前顶盖核（nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis，下文简称为前顶盖）向间脑后外侧核（ILH）投射所构成的前顶盖-下丘脑环路的作用。研究表明，通过激光消融前顶盖可降低斑马鱼幼体的捕食活动，并消除ILH中与视觉猎物感知相关的神经元活动²¹。本文描述了在斑马鱼幼体中进行激光消融操作，并利用Ca²⁺成像和行为记录来检测其效应的实验方案。

方案

1. 使用双光子激光显微镜消融特定神经元亚群

注意：如果用户计划在消融后进行钙成像，请使用 UAShspzGCaMP6s 品系²¹。如果用户计划在消融后进行行为记录，请使用 UAS:EGFP 品系，因为消融 EGFP 阳性细胞比消融表达 GCaMP6s 的细胞更容易操作。

1. 首先建立携带Gal4的果蝇品系与UAS:EGFP或UAShspzGCaMP6s品系的杂交，以标记待研究的特定神经元。务必使用 珍珠层 以便为双亲提供背景信息 珍珠层 可获得纯合子。
   注意： 纯合子 珍珠层 体表不含黑色素细胞（图1B）。在本研究中，使用了标记顶盖前区的 Gal4 品系 gSAIzGFFM119B 和标记间脑后部外侧区（ILH）的另一个 Gal4 品系 hspGFFDMC76A²¹.
2. 在设置交配后的第二天，收集斑马鱼卵，并将其培育至幼体阶段，此时目标神经元将表达荧光报告基因。
3. 将斑马鱼幼鱼固定在2%低熔点琼脂糖中（图1B).
   1. 首先制备2%琼脂糖储备液：将2 g低熔点琼脂糖粉末溶于100 mL系统用水中（即用于在循环水系统中饲养成年斑马鱼的水²² 或 E3 水²³通过将水在微波炉中加热至沸腾并剧烈搅拌。
   2. 将2%低熔点琼脂糖储备液微波加热至沸腾。取3.5–4.0 mL琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿的皿盖中。待琼脂糖冷却至触感温热后，再进行后续操作。
   3. 接下来，将一只幼虫（此步骤无需麻醉）放入琼脂糖中。使用解剖针不断调整幼虫的位置和方向，使其保持直立状态。图1C），直至琼脂糖凝固，以确保幼虫处于正确位置。
      注意： 幼虫将在琼脂糖凝固过程中继续游动。
   4. 幼虫定位后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。
   5. 在琼脂糖上加入5 mL三卡因溶液（0.4%，1x工作浓度）。
      注意： 为避免激光消融过程中幼虫移动，必须在整个消融过程中保持幼虫处于麻醉状态。
4. 使用双光子激光显微镜系统的漂白功能消融幼虫。
   1. 将琼脂糖包埋的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，启动显微成像系统。
   2. 启动图像采集软件并点击 "开启" 按钮 "激光" 按 Tab 键以打开激光器（图1D）。等待 "状态" 激光的波长发生变化 "繁忙" 到 "锁模。"
   3. 在 "通道" 设置激光波长为880 nm（最大功率：约2,300 mW）用于EGFP消融，或设置为800 nm（最大功率：约2,600 mW）用于GCaMP消融。
   4. 手动旋转物镜转盘以选择20倍物镜。点击 "定位" 标签，点击 "GFP" 改变光路，并通过肉眼直接观察荧光。
   5. 将斑马鱼幼体脑部置于视野中央，然后点击 "采集" 按 Tab 键返回双光子显微镜。
   6. 作为消融前状态的记录，使用20倍物镜以快速扫描模式采集z轴层扫图像（以避免热损伤）。随后将消融前与消融后实验所获得的图像进行对比。图2A）。要获取z轴层叠图像，单击 "Z轴层扫" 选择z轴堆叠选项并展开该标签页。设置下限（点击 "设置初始值" 按钮") 在聚焦于幼虫脑腹侧末端后，设置上限（点击 "设置最后" 在聚焦于大脑最背侧表面后，点击按钮。然后，点击 "开始实验" 点击按钮以运行z轴层扫图像采集。
   7. 通过手动旋转物镜转盘，选择63倍物镜。
   8. 点击 "定位" 切换至落射荧光显微镜，通过肉眼观察将待消融的细胞移至视野中央，然后点击 "采集" 按 Tab 键返回激光扫描显微镜。
5. 在 "采集模式" 标签，设置 "帧大小" 256 × 256。单击 "活体" 观察目标神经元。
6. 从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。
7. 在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的小圆形区域作为感兴趣区域（ROI），使用 "区域" 功能。
8. 将扫描速度设置为13.93秒/256×256像素（134.42 µm × 134.42 µm），对应激光驻留时间约为200 µs/像素，或200 µs/0.5 µm。同时设置4次重复（“迭代周期：4”）。或者，可优化迭代次数和扫描速度，以确保实现充分的消融。
9. 使用软件中的“漂白”功能进行消融，并结合“时间序列（2个周期）”对样品在消融前后进行成像，同时使用“区域”功能（用于设定感兴趣区域，ROI）或所用软件中的等效功能图1D).
10. 通过比较时间序列循环中的第一幅图像（消融前）和第二幅图像（消融后），确保在漂白后，靶向细胞中的荧光降低至与背景水平相当的强度图2B).
11. 如果消融后仍存在荧光，则增加迭代次数。
12. 接下来，将焦平面略微向下移动（即，朝向腹侧），并选择下一个出现未消融细胞的焦平面。
13. 按照上述方法执行漂白操作（步骤1.9）。重复这些步骤，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。
14. 在扫描完覆盖待消融神经结构的所有焦平面后，检查细胞的荧光是否已消失。若发现部分细胞因消融不充分仍具有荧光，应按照上述方法再次进行激光照射。
15. 如果需要在激光照射后从琼脂糖中回收幼虫，请勿强行将其从琼脂糖中取出，以免损伤幼虫。相反，应小心地在幼虫周围垂直于其体表方向对琼脂糖进行微小切割。随后，等待麻醉效果消退后幼虫自行游出琼脂糖。
16. 继续对下一个幼虫进行消融，或使用与所研究行为无关的另一群神经元进行对照实验。
    注意： 此处作为对照，采用上述相同方案，利用激光消融了 UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B 幼虫中的嗅球神经元图2A，右侧。
17. 在进行钙成像（第2节）或行为记录（第3节）之前，需让幼虫恢复数小时至一天。在此恢复期间，应检查幼虫的健康状况即，正常自发游泳，消融区域周围无明显热损伤， 等等。）并剔除任何表现出健康不良迹象的幼虫。

2. 钙成像记录视顶盖切除斑马鱼幼体中猎物诱发的神经元活动

1. 准备记录室时，将一个带粘性的密封封接杂交室垫圈置于载玻片上，粘性面朝向载玻片，并揭去顶部密封膜。
   注意： 这形成了一个直径为9 mm、深度为0.8 mm的小型记录腔室（图3A).
2. 接下来，将一张尼龙网膜（孔径：32 µm）置于已切去底部的50 mL离心管上，用管盖将网膜固定在管口（图3B).
3. 制备 草履虫 （即用作幼虫视觉刺激的猎物）。
   注意： 制备 草履虫 培养（步骤 2.3.1 和 2.3.2）需提前进行。
   1. 获取 草履虫 来自商业来源或学术生物资源中心的种子培养物²⁴ 提前。
   2. 培养 草履虫 在含有经高压灭菌的稻草和一粒干啤酒酵母的水中培养数天²² (图3C).
   3. 倒入 草履虫 依次通过两层筛网过滤培养物（第一层孔径为150 µm，第二层孔径为75 µm），以去除培养物中的碎片。
   4. 收集 草履虫 在上一步的流穿液中使用尼龙网膜（13-µm 孔径）进行过滤。
   5. 重悬 草履虫 将尼龙网上的内容物用系统水冲洗至玻璃烧杯中（使用洗瓶）图3D).
4. 冲洗滤网（图3B) 在系统水中清洗 2 次图3E).
   注意： 此步骤的目的是去除可能含有的任何气味物质和味觉物质 草履虫 培养基，因为本研究的目的是观察视觉驱动的神经元活动。
5. 将斑马鱼幼鱼放入三卡因溶液中以进行麻醉。
6. 将单个幼虫置于2%低熔点琼脂糖中包埋。
   1. 首先，将2%低熔点琼脂糖进行微波加热，然后向琼脂糖中加入1/10体积的10倍浓缩三卡因（tricaine）。
   2. 将一滴含有三卡因的琼脂糖置于记录室中（图3A).
   3. 在确认琼脂糖温度不过高后，将麻醉后的幼虫（来自步骤2.5）放入琼脂糖中，并立即去除多余的琼脂糖，使琼脂糖表面呈轻微凸起状。
   4. 用解剖针迅速将幼虫调整至直立位置（图1C).
      注意： 这些步骤必须在几秒内完成，以免琼脂糖凝固。
   5. 幼虫正确放置后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。然后，在琼脂糖上滴加一滴1x三卡因溶液。
7. 移除斑马鱼幼鱼头部周围的琼脂糖，并留出空间 草履虫 使用手术刀在琼脂糖中进行划线接种。操作时，首先在琼脂糖上做几个小切口（图3F然后，轻轻将系统水倒入培养室，以小心去除多余的琼脂糖。
   注意： 在此步骤中，将洗去三卡因。
8. 接下来，放入一个 草履虫 在记录室中作为视觉刺激。
   注意： 当 草履虫 在斑马鱼幼鱼头部附近游动时，会引发神经元反应（图3G).
9. 将记录室置于配备科学级CMOS相机的落射荧光显微镜下图3H）并选择 2.5X 物镜（图3我).
10. 采集GCaMP荧光信号的时间序列记录。
    1. 启动配备相机的图像采集应用程序。
    2. 点击 "序列窗格" 并选择 "硬盘记录" 在面板上。在扫描设置部分，设置 "帧数" 至900或其他任意所需总帧数。
       注意： 如果具备条件，可使用带有模块的时间延时记录软件（此处指 "硬盘记录"可实现将数据高效保存至硬盘。
    3. 在 "捕获" 面板，将曝光时间设为30 ms（即，33.3 帧/秒），以及 2 × 2 采样合并。
    4. 在显微镜控制触摸面板上，选择用于GFP的滤光片组，因为GCaMP的激发/发射光谱与GFP相似。
    5. 点击 "活体" 在捕获面板上定位相机视野中的幼虫并进行聚焦（图4A），然后单击 "停止实时观察" 并点击 "开始" 按钮。将视频保存为 .cxd 格式或任何其他能够保存采集条件信息的格式。
11. 记录结束后，使用免费软件 Fiji，通过获取时间序列视频中设定于脑区结构的感兴趣区域（ROI）的平均像素值，分析 GCaMP6s 荧光信号（Ca 信号）。²⁵.
    注意： Fiji 是 ImageJ 的一个版本，预装了许多有用的插件，并可通过 Bio-Formats 插件读取 .cxd 格式的图像文件。
12. 如果幼虫在记录过程中发生轻微移动，通过运行 TurboReg 插件进行图像配准²⁶ 在 Fiji 中，从菜单中选择“插件”、“配准”和“TurboReg”。
13. 根据研究目的考虑如何分析数据。以下是一个示例。
    1. 按如下方法计算 F/F0（每个时间点的荧光强度除以静息状态或任何钙瞬变发生前的荧光强度）：
    2. 使用 ROI Manager 在前顶盖或 ILH 上设置 ROI：在菜单中选择 "分析，" "工具，" "ROI 管理器"，以及 "添加" 到 ROI 列表中（图4A).
    3. 计算各感兴趣区域（ROI）的平均像素值（即，通过在 ROI Manager 面板中选择来获取 GCaMP6s 的荧光强度 "更多，" "多指标测量"，以及 "好的。" 将结果保存为电子表格文件。
    4. 由于信号存在噪声，使用能够处理电子表格数据的应用程序，对11个时间点的信号进行平均（移动平均）。
    5. 将F（随时间变化的荧光强度）除以F0（基础水平的荧光强度），以计算归一化的荧光强度。作为数据可视化的一个示例，前顶盖和ILH中归一化的GCaMP6s荧光强度变化以颜色编码并映射于 草履虫 轨迹（图4B - D).

3. 激光消融后行为学后果的评估

1. 设置一个行为记录系统，该系统由配备视频摄像机的体视显微镜组成。使用带有适当图像采集软件的摄像机，软件可为商用或定制开发的图5A).
2. 优化光照条件，使 草履虫 可通过图像处理进行检测。例如，使用带间隔器的环形白色LED光源（图5B).
   注意： LED 的距离和角度会影响样本的外观即，明场中为暗色或暗场中为亮色）因此对成功的图像处理至关重要。确定垫片的最佳高度（图5C).
3. 将一条斑马鱼幼鱼（来自第1节所述激光消融实验回收的样本）放入行为记录室（已连接至载玻片）中，移除原有的顶部密封图5D).
4. 收集50 草履虫 使用微量移液器从培养物（步骤 2.3.5）中取出并置于记录室中。
5. 在记录室上方放置盖玻片。在将盖玻片置于记录室的水面上之前，先在盖玻片上滴加一滴水，以避免将空气带入记录室中。
   注意： 在这一步中，加入一些水与 草履虫 将从记录室溢出。剩余的数量 草履虫 记录室内的温度将约为30-40。
6. 将记录室（内含一条幼虫）置于 草履虫) 在照明系统中（图5D).
7. 以每秒10帧的速度开始延时记录，持续11分钟（6,600帧）。
8. （可选）对于每只用于行为测试的幼虫，通过荧光显微镜观察激光消融区域的荧光，以确认激光消融的有效性（即激光照射区域内荧光细胞的缺失或数量显著减少。
   注意： 即使经过照射，在消融后发生分化的细胞中，由于Gal4基因表达的延迟启动，仍可观察到一些荧光细胞²⁷.
9. 记录幼虫行为后，为补偿背景的不均匀性，在Fiji中对每一帧进行与平均图像的逐像素相除操作：点击“Process”（处理）、“Image Calculator”（图像计算器）、“Operation: Divide”（运算方式：相除）、勾选“32-bit (float) result”（32位浮点结果），然后点击“OK”（确定）。生成平均图像的方法为：点击“Image”（图像）、“Stacks”（堆栈）、“Z-Project”（Z轴投影）、选择“Average intensity”（平均强度），然后点击“OK”（确定）。图5E，F).
10. 计数数量 草履虫 通过点击“分析”、“分析颗粒”，并设置覆盖所有颗粒的面积范围，将剩余在腔室中的颗粒进行分析 草履虫，勾选“显示：掩膜”复选框，然后点击“确定”。“显示：掩膜”选项将提供一个提取的 草履虫 图像（图5G），以及颗粒数量列表（草履虫每帧中的）
11. 绘制数量 草履虫 随时间留在记录室中。由于对数量的估计 草履虫 由于数据存在噪声，我们建议在电子表格中对每一点在600帧（1分钟）范围内进行移动平均处理。

结果

特定神经元通过Gal4品系驱动，被遗传标记为EGFP或GCaMP6s。使用Gal4品系gSAIzGFFM119B标记了位于顶盖前区的一个核团（大细胞浅层顶盖前核）以及嗅球中的一类神经元亚群。另一个Gal4品系hspGFFDMC76A用于标记ILH。我们在携带Gal4品系gSAIzGFFM119B并与UAS:EGFP报告鱼杂交的斑马鱼幼鱼中，双侧激光消融了顶盖前区神经元（图2A左图），并以双侧消融嗅球神经元作为对照（图2A右图）。结果显示，双光子激光能够特异性消融靶细胞，而对邻近细胞或神经纤维无影响（图2B）。

顶盖前区神经元将其轴突同侧投射至背侧下丘脑（ILH）。在此，我们利...

讨论

尽管双光子激光器具有优异的空间分辨率，可特异性消融单个神经元，但必须格外注意避免因热量对脑组织造成不必要的损伤。消融实验中最重要的步骤是确定最佳的激光照射剂量。照射剂量不足将无法杀死神经元；而照射剂量过高则会因热效应损伤周围组织，导致非预期的结果。最佳激光照射参数范围（包括感兴趣区域的面积、扫描迭代次数和扫描速度）通常较窄。多个因素会影响消融的效率。

首先，通过使用不同的荧光报告蛋白，需要针对每种报告蛋白优化消融条件。GCaMP 的表达位于无细胞核的细胞质中。相比之下，EGFP 的荧光遍布整个细胞内部，与 GCaMP 相比，这可能更有利于实现靶向细胞的高效且特异性的消融。使用 GCaMP 还存在一个不利因素：激光消融表达 GCaMP 的细胞后，由于瞬间大量钙离子内流，可能导致荧光强度增加；而使用 EGFP 进行消融时，荧光强度则会下降。因此，荧光强度的变化不能作为 GCaMP 消融程度的可靠指标。在此类情况下，可能需要通过观察特定时间后荧光细胞的消失来验证消融效果。消融区域内钙信号的缺失或显著减弱可作为使用 GCaMP 成功消融的另一判断标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NuSieve GTG 琼脂糖	Lonza	Cat.#50080	低熔点琼脂糖
6 cm 培养皿	FALCON	Product#:351007
解剖针	AS ONE Corporation	Cat. No. 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		双光子激光扫描显微镜
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X 物镜
Imager.Z1	Carl Zeiss		落射荧光显微镜
ZEN	Carl Zeiss		共聚焦显微镜图像采集软件
Secure-Seal 杂交室垫圈，8 个腔室，直径 9 mm × 深度 0.8 mm	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	用作钙成像中的记录腔室
成像腔室	Grace Bio-Labs	CoverWell 成像腔室 PCI-A-2.5	用作行为记录腔室
手术刀	MANI	眼科手术刀 MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	型号：C11440-22CU	科学级 CMOS 相机
HCImage	Hamamatsu Photonics		图像采集软件
硬盘记录模块	Hamamatsu Photonics		可实现将视频文件快速保存至硬盘驱动器的软件模块
SZX7	Olympus		体视显微镜
DF PL 0.5X	Olympus		SZX7 用物镜
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	产品编号：GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS 相机
XIMEA xiQ 相机	XIMEA	产品编号：MQ042RG-CM	CMOS 相机
环形 LED 光源	CCS	型号：LDR2-100SW2-LA	白色 LED
尼龙网 32µm	东京筛网	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
尼龙网 13µm	东京筛网	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
金属筛网，孔径 150 微米	东京筛网		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
金属筛网，孔径 75 微米	东京筛网		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		干啤酒酵母
LabVIEW	National Instruments		用于编程的集成开发环境
Mai-Tai HP	Spectra Physics		双光子激光器