使用基于气味的延迟匹配样本测试法检测大鼠的元认知反应

摘要

本方案描述了一种用于研究啮齿类动物元记忆（即记忆意识）可能性的方法。基于气味的延迟匹配样本范式是一种新颖的、具有生态相关性的行为测试，可用于确定啮齿类动物在多大程度上能够根据对自身记忆状态强度的认知监控而作出适应性反应。

摘要

元记忆涉及评估自身记忆强度的认知能力。为了探索非人类动物中是否存在元记忆，研究人员已设计出多种行为任务，其中许多任务包含允许被试拒绝接受记忆测试的选项。为评估大鼠的元记忆，我们采用了这种“拒绝测试”选项范式，将先前为灵长类动物开发的视觉延迟匹配样本测试（DMTS）^1,2 改编为适用于啮齿类动物的基于气味的测试。首先， 让大鼠通过挖掘装有带气味沙子的杯子来学习并记住一个样本气味。经过一段延迟后，大鼠会面对四个不同气味的杯子，其中一个杯子的气味与之前样本中的气味完全相同；如果大鼠选择该匹配的杯子，则会获得更偏好、更大的奖励。若选择其余三个不匹配的、装有带气味沙子的杯子，则无法获得奖励。记忆保持间隔时间根据个体进行调整，使被试的正确率维持在40%至70%之间，从而确保大鼠有时能记住样本气味，有时则会遗忘。在此实验中，元记忆的操作性定义是指个体通过行为反应区分记忆存在与否的能力。为此，在三分之二的试验中，除四个选择杯子外，还会提供一个“拒绝测试”选项（选择试验）。如果大鼠选择该“拒绝测试”选项——即一个无气味但颜色标记的沙杯，则会获得较小且较不偏好的奖励，并可避免进行记忆测试。而在其余三分之一的试验中，不提供“拒绝测试”选项（强制试验），此时当大鼠遗忘样本气味时，只能猜测正确的杯子。在选择试验中，若大鼠具备元记忆能力，当记忆较弱时应选择“拒绝测试”选项，而非冒险参加测试并做出错误选择。因此，选择试验中的表现显著高于强制记忆测试的表现，表明被试适应性地使用了“拒绝测试”反应，反映了元认知行为的存在。

引言

元记忆是指个体评估自身记忆强度的能力^2,3,4。尽管人类已持续展现出这种认知能力，但非人类动物是否具备元记忆仍存在争议e.g.^5,6。检验元记忆可能性的一种常用方法是为非人类动物提供一个拒绝测试选项，若动物选择该选项，则可获得一个确定但比正确完成测试所获奖励更小的 奖励。如果受试者能够监控自身的记忆状态，那么当其记忆较弱时，就应当选择拒绝参加测试（相关综述见：^7,8,9,10）。

在过去的几十年中，为人类和非人类灵长类动物¹¹以及鸽子¹²开发的实验程序已被多方面改进，用于进一步检验猴子是否存在元记忆能力^1,2,13。其中最具开创性的研究或许是Hampton¹所采用的延迟匹配样本测试（delayed match-to-sample test, DMTS）。在完成匹配样本（MTS）任务的训练后，研究人员调整了样本呈现与测试之间的延迟时间，使任务难度处于中等水平，从而使猴子有一定概率记住或遗忘样本。在延迟之后，猴子被给予选择是否参加测试的机会。结果显示，当猴子主动选择接受测试时，其表现显著优于被迫必须参与的试验，这表明猴子能够监控自身对样本的记忆强度¹。

迄今为止，大多数元记忆范式均采用视觉或听觉刺激，这并不令人意外，因为研究最为广泛的物种是高度依赖视觉的非人类灵长类动物例如^11,14。在有关大鼠元认知的少量先前研究中，所使用的感官模式也同样是视觉或听觉^15,16,17,18。鉴于最近在基于气味的任务中已获得元认知反应的有力证据¹⁹，此前在大鼠中得出的不确定结果可能是由于缺乏标准化的实验范式所致。我们设计了一种范式¹⁹，借鉴了上述在猴子中使用的DMTS范式¹，并充分利用大鼠最主要的感觉——嗅觉。本文所描述的任务要求大鼠在装有沙子的杯子中挖掘以获取食物奖励，从而利用了啮齿类动物天然的挖掘行为。

可以使用此处介绍的基于气味的延迟匹配样本任务（DMTS）来评估大鼠的元记忆能力。首先建立食物奖励的等级体系，使受试动物表现出对更高价值奖励的明显偏好。随后训练大鼠通过挖掘带有气味的沙子来获取奖励。在呈现一个有气味的样本杯后，受试动物必须从四个气味各不相同的杯子中选择其中一个。与样本杯气味相同的杯子底部埋有奖励。当大鼠在基本的匹配样本（MTS）测试中表现熟练后，针对每只大鼠调整其记忆保持间隔（RIs），使其表现的成功率维持在40%至70%之间。在2/3 的试验中，允许大鼠选择放弃记忆测试，以换取一个较不偏好的奖励。通过比较大鼠在提供放弃测试选项的试验（选择试验）和必须强制进行测试的试验（强制试验）中的表现，来评估其元认知能力。

尽管在此范式中仅测试了Long-Evans大鼠，但该任务也可用于测试其他品系的实验大鼠和小鼠，以进一步研究啮齿类动物的元记忆。此外，测试老龄啮齿类动物或具有阿尔茨海默病病理特征的转基因小鼠也将有助于更好地理解记忆障碍如何影响元认知过程。

方案

本文所述所有方法均已获得普罗维登斯学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 创建测试装置

1. 使用一个社交互动室（76.2 x 114.3 cm），该房间被分为三个独立区域。
   1. 使用可滑动的硬纸板隔板将中间房间分隔为样本区和延迟区，该隔板可通过侧壁上安装的金属轨道上下移动。
2. 用不透明的贴膜覆盖透明墙壁，以防止动物看到其他房间。
3. 在右侧房间（测试区；见图1）的一侧地面上，铺上沙粒并覆盖红色贴膜，作为提示“放弃”选项的视觉和触觉辨别线索。
4. 在测试区的另一侧地面上，使用美纹纸胶带贴出凸起的条纹，作为提示“选择测试”的视觉和触觉辨别 线索，并用黑色贴膜覆盖条纹。房间中间三分之一区域的地面保持原样，不做任何处理。

2. 建立偏好食物奖励等级/偏好测试

1. 选择可能用于测试的食物奖励，确保其中一种为较大量奖励 "首选" 优于另一种方法。
   1. 使用一整片谷物作为较大的样本， "首选" 奖励和一个 ¼ 麦片碎片较小， "较不推荐" 奖励
      注意： 谷物可包含加糖麦片或脱水棉花糖。也可使用两种不同的奖励物（例如 谷物 与 标准啮齿类动物颗粒饲料（TestDiet，45 mg），但当奖励之间的差异源于质量而非数量时，难以确定个体内部及个体间可靠的偏好排序。
2. 将成年雄性Long Evans大鼠在测试开始前30分钟移入黑暗的测试室。如果大鼠处于其昼夜周期的黑暗期，则使用红光照明测试箱；否则，按照视频所示在正常光照条件下进行测试。
3. 将两份奖励，即一整块谷物和另一份 ¼ 麦片碎片，置于腔室右侧房间的对角角落（参见 图1).
4. 将大鼠放置于箱体的对侧，使其背向奖励物，并允许大鼠食用其中一种奖励物。
   注意： 为了通过偏好测试并确保较大块的谷物是首选奖励，受试者必须在连续两个阶段中，每个阶段的5次试验（每天进行两个阶段，每个阶段5次试验）里，有4次选择食用较大的奖励。
   1. 如果经过10次训练后，大鼠仍未表现出对较大谷物块的偏好，则更换另一种奖励。
5. 在整个测试过程中，为确保大鼠的偏好保持一致，每周进行一次偏好检测。
   1. 以相同方式开展偏好检查，将整块和1/4块麦片分别置于实验箱对角角落，如同偏好测试一样。
      注意： 2 次试验构成一次偏好检测。
   2. 如果大鼠在两次试验中均选择了较不偏好的奖励，则对测试大鼠进行5次试验的完整偏好测试。
      1. 若大鼠通过，则可继续测试。
      2. 若大鼠未通过测试，则停止测试，并更换奖励的类型或数量。

3. 通用方法

1. 在整个测试过程中使用固定的实验人员 ，以便大鼠充分适应实验人员的气味和操作方式。
   注意：假设在测试前，大鼠已由人类处理至少1周，使其习惯被实验人员抓取和搬运。
2. 在测试开始前30分钟，将大鼠连同其鞋盒笼（原居笼）一起带入测试室，使其适应新环境。
3. 若测试在大鼠活动周期的黑暗阶段进行，应保持测试环境 黑暗，仅使用红光照明装置。
4. 确保带气味的选择杯按照 随机化脚本 确定的顺序排列，该脚本已包含 平衡设计。将完整的谷物片放入正确的位置作为诱饵。
5. 仅允许大鼠在其中一个杯中挖掘，一旦大鼠通过挖掘行为选择了一个杯子，应立即将其从装置中移出。将大鼠放回原居笼，使其完成奖励食物的摄取。
6. 试验间间隔（ITI）固定为4分钟。当大鼠回到原居笼后，立即启动秒表计时。
   1. 在ITI期间，使用真空吸尘器清理洒落的沙子，并用70%异丙醇擦拭装置底部。若上一次试验中的奖励未被食用，则将其丢弃。 此外，每周需清洁一次陶瓷杯：倒掉旧沙子，并用异丙醇擦拭杯子。 
   2. 根据随机化脚本 重新排列沙杯顺序，并为正确的杯子添加诱饵，准备下一次试验。

4. 沙杯挖掘训练及对测试装置的适应

1. 倒入约 ½ 将一杯游戏沙倒入陶瓷杯中（直径6.99 cm，高8.81 cm）。
2. 将装有食物奖励的沙子杯放入每只大鼠的饲养笼中过夜。
   注意： 大鼠需连续两个晚上成功挖掘杯中的食物并将其吃掉。
3. 将大鼠置于测试装置中适应5分钟。
   1. 在整个装置内分散放置食物奖励，以促进大鼠对装置的探索以及穿过打开的门。确保大鼠连续两天内不在箱室内排尿、排便或出现僵直行为。
4. 将装有食物奖励的无味沙子杯转移至测试装置中。确保大鼠能够成功在沙子中挖掘并取出奖励，连续两天不出现僵直行为、排便或排尿。如有必要，可移除陶瓷杯，直接将谷物放置于实验箱内。

5. 样本匹配（MTS）训练

1. 通过将约3杯彩沙与以下物质混合，制备4种不同香味的沙堆： ¼ 一茶匙香料（肉桂、咖啡、红椒粉和百里香）。为控制气味线索，将一份奖励物捏碎后放入错误选择的杯子中。
   1. 每周搅拌一次加香沙子，并将其储存在玻璃容器中，以确保测试期间香味强度一致。
2. 倒入 ½ 将每种有香味的沙子各取一杯，分装到4个杯子中，并将这些杯子以半圆形排列在黑色触感纸上（MTS任务区）； 图1A确保所有杯子与入口门的距离相等。
   1. 根据编程软件的输出结果，将杯子按指定位置摆放 "R" 使用无放回抽样函数。
3. 在受试者视线之外，将一份完整的奖励物埋入正确气味的杯子中。埋藏 ½ 在相同气味的样本杯中放入一块奖励物。将所有奖励物至少埋入 ½ 沙层深处
   1. 伪随机选择正确气味的杯子，唯一限制条件 是没有一种气味是样本气味 连续超过2次。
4. 将受试者放入样品室，使用弯头刮勺（手柄托盘呈90度角）降低样品杯。让受试者在样品杯中挖掘并取出样品 ½ 谷物奖励。受试者开始进食奖励时，立即移除杯子。
5. 受试者吃完奖励后，抬起纸板隔断，打开测试室的门，让受试者进入延迟室。
6. 让受试者 "选择" 通过挖掘其中一个杯子进行选择。一旦受试动物做出选择并取回奖励（如有），立即将其从实验箱中移出，并放入转移笼中。大鼠可以嗅闻每个杯子，但仅允许通过挖掘行为表明一次选择。
   1. 在4分钟的间隔时间内，使用70%异丙醇清洁实验箱。吸除可能洒出的沙子，并根据需要补充沙杯。
   2. 获取下一个样本杯，并对样本杯和测试杯均进行诱饵处理。如果受试者在上一次试验中选择了错误的杯子，需移除并丢弃未被吃掉的奖励。
7. 确保受试者每天接受一次包含6次试验的匹配样本训练（MTS）。为了通过MTS训练，受试者必须在连续两次训练中，每次的6次试验中有3次选择正确的杯子。
   注意： 这确保了在四选一测试中，表现高于随机水平但低于上限。

6. 延迟样本匹配任务（DMTS）中的延迟滴定

1. 继续按照之前的方法对受试者进行MTS训练（从0秒延迟开始）。
   注意：正确率必须保持在40%至70%之间，以确保表现显著高于随机水平（25%），但未达到上限。在此范围内，受试者既能体验到成功记住样本的情况，也会经历遗忘样本的情况，从而在引入选择性试验时，使受试者有机会利用衰退测试反应获得优势。
2. 如果在连续两个6次试验的阶段中，正确率均超过70%，则将延迟时间从0秒增加至30秒。
   1. 在延迟时间不为0秒的试验中，使用秒表计时每次延迟。受试者摄取样本后，升起纸板隔板墙，允许受试者进入延迟室。关闭纸板隔板，并用秒表开始计时延迟时间。
   2. 30秒结束后，打开测试室的门，待受试者进入测试室后关闭门。
   3. 其余试验步骤照常进行。
3. 如果在连续两个6次试验的阶段中，正确率仍持续高于70%，则将后续每次延迟时间增加为前一次延迟的1.5倍。
4. 如果在连续两个阶段中，正确率均低于40%，则将延迟时间恢复至上一次使用的延迟。
5. 如果在连续两个阶段中，正确率保持在40%至70%之间，则将该延迟设定为受试者个体的标准延迟。

7. 拒绝使用训练

1. 每次DMTS训练结束后，在与有气味沙子杯子相对的位置放置另一个装有不同质地和颜色沙子的杯子。在该杯子中放入较不受欢迎的奖励物，即¼片麦片，作为拒绝选择杯。将有气味的沙子杯子从实验舱中移除。
2. 按照DMTS训练期间的方式进行试验，允许受试者探查一个随机气味的杯子，然后在延迟舱内等待针对该受试者的特定延迟时间。
3. 允许受试者在无气味的沙子杯子中挖掘并获取奖励物，随后将受试者从实验舱中移出。此类试验被视为"强制拒绝"试验。
4. 每次DMTS训练结束后进行两次强制拒绝试验。

8. 测试：强制 与 选择试验

1. 使用标准延迟时间对受试对象进行 DMTS 测试。每天对每个受试对象进行一次包含 12 次试验的测试会话。
   1. 随机选择其中 8 次试验作为"选择"试验，并将拒绝杯放置在有气味杯的对侧。使用随机化脚本 确定试验类型的顺序，限制条件为：连续出现的“选择” 或“强制”试验 不得超过 3 次。
      注意： 剩余的 4 次试验为"强制"试验，此时需将拒绝杯从测试箱中移除。
   2. 根据受试对象的延迟标准，可在某一只大鼠的 ITI 期间测试另外 2 至 3 只受试对象。在第一个受试对象的 ITI 期间，运行第二个受试对象的试验。每次试验后务必使用异丙醇清洁测试箱。
   3. 对受试对象进行十次测试会话。
2. 在每次试验中，一旦大鼠进入延迟箱，需确认其向左转以拒绝测试，或向右转以接受测试（见图 1A；俯视照片）。记录大鼠是否从房间的一侧移动到另一侧（例如，即 大鼠"决定接受测试"，但随后又移动至拒绝-测试区域）。
   注意： 因此，大鼠在尚未接触到四个选择气味之前，便做出了前瞻性的元记忆选择（关于并发性与前瞻性元记忆测试的详细讨论，请参见结果论文¹⁹）。
3. 在连续两次测试会话后持续计算强制试验的准确率，并监测拒绝-测试的使用情况。
   1. 若在连续两次会话中准确率上升至 70% 以上，则停止测试，并返回延迟滴定阶段，采用更长的延迟时间。
   2. 若拒绝-测试的使用率持续接近 0% 或 100%（连续两次会话），则暂停测试，并考虑提高或降低拒绝-测试反应的设定值，以确保拒绝率维持在 10% 至 40% 之间。
   3. 若在连续两次会话中准确率低于 40%，则停止测试，并返回延迟滴定阶段，采用更短的延迟时间。
   4. 当强制试验的准确率在连续两个会话中保持在 40% 至 70% 之间时，方可恢复测试。
   5. 在整个测试过程中，为确保大鼠的偏好保持稳定，需每周进行一次偏好检查（每会话 2 次试验）。偏好检查方法如前所述。

9. 建议的泛化性测试

1. 泛化性测试，例如结果论文中所述的那些测试¹⁹ 可用于确定元认知反应是否能在不太可能受单一外部刺激关联控制的条件下发生迁移。
   1. 在无样本探测试验中测试大鼠 未呈现样本阶段，但实验的RI阶段和测试阶段与正常试验相同。将4次探测试验与8次正常样本试验随机混合，组成包含12次试验的一轮测试。对受试者进行10轮测试。比较无样本试验与正常试验中的衰退速率。
   2. 在双样本试验中测试大鼠，即向受试动物两次呈现原始样本气味以增强记忆强度。按照上述方法，将探针试验与常规样本试验随机交替进行。比较双样本试验与常规试验中的记忆衰退速率。
   3. 测试大鼠的三种不同反应间隔（RI）：标准延迟、一种较短的延迟例如 0 秒）短于标准延迟，另一个则长于标准延迟（例如 4 分钟）。在每次实验会话的每个延迟阶段，向受试者呈现四次选择试验和两次强制试验，使每次会话共包含 18 次试验 试验。将所有试验随机混合，对大鼠进行十次训练。比较三种延迟条件下试验的衰退速率，其中记忆强度应分别呈现下降和上升趋势。

10. 数据分析

1. 测试完成后，计算每位受试者在强制选择和自主选择试验中的平均正确率。
   1. 计算正确强制试验所占比例的方法是：将正确强制试验的次数除以强制试验的总次数。
   2. 计算正确选择试验所占比例的方法如下：首先，从选择试验的总次数中减去被拒绝的试验次数。然后，将每只大鼠的正确选择试验次数除以该大鼠的选择试验总次数减去被拒绝的试验次数。
   3. 对组数据进行 t 检验，以比较正确强制试验的比例与正确选择试验的比例（参见 图2).
   4. 如果进行了泛化测试，则对正常试验中的下降率进行 t 检验 与 如9中所述进行探测试验。对于混合延迟试验（如9.1.3所述），采用重复测量方差分析（ANOVA），以延迟时间和试验类型作为组内因素，比较强制选择与自主选择测试。此外，对不同延迟条件下的回避选择使用情况进行单因素方差分析，以确定准确性是否随反应间隔（RI）发生变化。

结果

为了研究被试的元认知反应，需将正确完成的强制试验比例（基线记忆表现）与正确完成的选择性试验比例进行比较，其中选择性试验是指存在“放弃选项”的试验。若选择性试验的准确率显著高于强制试验，则表明结果为阳性（图2A）。该结果提示，大鼠可能能够监控自身的记忆状态，并在记忆较弱时选择放弃任务，从而在存在放弃选项的选择性试验中表现出准确率的提升。

如果在选择性试验中的表现准确度与强制性试验相比没有显著提高，则结果为阴性。这种在大鼠中缺乏元记忆证据的假设情况（图2B）表现为：在样本已被遗忘的试验中，未能使用退化测试选项，而在此情况下使用该选项本应是有利的。

如果进行了泛化测试，当受试者拒绝无样本试次的频率显著高于正常样本试次，并且拒绝双样本试次的频率显著高于正常样本试次时，则表明其元认知表现良好。拒绝行为应与记忆准确性呈反比关系，即在强制试次中的准确性越高，拒绝率应越低。如果强制试次中的准确性不随试次条件变化，则应调整参数（例如，增加反应间隔RI），因为此时无法判断受试者是否表现出元认知行为。在混合延迟测试中，受试者在自主选择测试中的准确性应显著高于强制测试中的准确性，且受试者更倾向于拒绝反应间隔较长的测试，而较少拒绝反应间隔较短的测试。有关泛化测试及其相应解释的更多细节，请参见结果论文¹⁹。

图1．实验装置与流程示意图。A) 实验装置照片，经许可改编自文献¹⁹。B) 实验流程。 第一步为适应性训练，即教会大鼠在装有沙子的杯子中挖掘，该过程持续两个晚上。随后，大鼠适应实验装置，并在该装置中接受在装有沙子的杯子中挖掘的训练。接着，给予大鼠两种奖励的选择机会，分别用绿色三角形和红色新月形表示（完整谷物零食 vs. 四分之一大小的谷物零食）。当大鼠对其中一种奖励表现出显著偏好后，即进入MTS训练阶段，此时杯子中填充带有气味的沙子，气味以肉桂、红椒粉、百里香和咖啡的图像表示。若连续两个训练阶段的成功率低于50%，则继续进行MTS训练；若大鼠的成功率达到50%或更高，则进入延迟滴定阶段。在延迟滴定阶段，大鼠继续进行MTS训练，但在样本阶段与测试阶段之间引入时间延迟（起始为0秒）。若大鼠的记忆准确率高于70%，则增加延迟间隔（RI）；若准确率低于40%，则减少延迟间隔，并继续MTS训练。此循环持续进行，直至大鼠在连续两个阶段中的准确率稳定在40%至70%之间。此时，大鼠进入正式实验测试阶段，该阶段包含随机混合的强制试次和选择试次。请点击此处查看该图的放大版本。

图2阳性结果表明存在元认知反应，假设的阴性结果表明缺乏元认知反应。A） 阳性结果改编自 ¹⁹ 经许可。正确反应的平均比例 强制的 和 选定的 试验数据来自9只大鼠每只完成120次试验的表现。*=p<.05，采用配对双尾t检验。选择试验中正确回答的试验比例显著高于强制试验，表明受试者恰当地使用了拒绝测试反应。 B) 在强制选择和自主选择试验中，正确回答的试验比例相当，表明未依据记忆强度对试验进行淘汰。虚线表示偶然水平（0.25）。误差线代表均值的标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种利用基于气味的延迟匹配样本任务（DMTS）评估大鼠元认知反应的新方法。由于嗅觉是啮齿类动物的主要感官，因此在大鼠和小鼠实验中，使用气味刺激优于视觉线索^20,21。利用在沙土中挖掘的行为是大鼠的自然觅食行为，使该任务对啮齿类物种具有生态相关性。

该实验方案中的一个关键步骤是确保食物奖励具有等级层次，其中一种奖励明显比另一种更受偏好。在研究的早期阶段，大鼠需要在被认为更受偏好的奖励（一片甜味麦片）和一小粒标准食物颗粒之间进行选择。然而，偏好测试结果显示大鼠的选择行为无明显差异，因此改用数量差异作为奖励的变化依据。大鼠在整片麦片与¼片麦片之间进行选择时，始终稳定地偏好较大量。若缺乏对食物质量或数量的偏好，则受试者将没有动力选择接受测试而非拒绝测试，因此这一步骤至关重要。

该实验方案的另一个重要方面是建立合适的反应间隔（RIs）和刺激间隔（ITIs），以确保多试次序列记忆任务（MTS）的准确率维持在40%至70%的正确范围内。如果延迟时间过短，且由于ITI较长导致干扰极小，大鼠将从未经历"遗忘"样本的过程。相反，如果RI过长而ITI过短，测试将变得过于困难，大鼠则无法记住样本。此类行为反应不仅可通过强制选择试次的准确率来检测，还可通过回避率是否过高或过低来判断。受试动物应在约10%-50%的选择试次中选择回避：若某受试动物回避所有试次或从不回避，则无法据此判断其是否具备元记忆能力，此时需重新评估回避-测试反应的相对价值。在整个实验过程中，强制试次的平均表现会在连续两天测试结束后持续进行计算。随着大鼠完成更多次的延迟非匹配样本任务（DMTS），其表现可能会提升，此时应启动返回延迟滴定（见图1B），适当延长延迟时间，使准确率保持在70%以下。如果对样本的记忆表现 consistently 高于70%，应考虑缩短ITI；如果对样本的记忆表现 consistently 低于40%，应考虑延长ITI，和/或将气味样本数量从4种增加至10-20种，以降低记忆干扰。

根据所使用的大鼠品系、饲养环境以及动物所处的明暗循环周期，其记忆能力可能较弱或较强 。与其他实验室大鼠品系（如Wistar或Sprague Dawley大鼠）相比，Long Evans大鼠通常能在相对较少的试验次数内掌握认知任务^22,23。因此，其他啮齿类动物可能需要更多的适应阶段和更长时间的训练才能学会该任务。本研究中的大鼠饲养在高度丰富的环境中，并可自由活动，因此其记忆能力可能相对较强^24,25,26。本研究所用大鼠还处于反转的明暗循环周期中饲养，由于测试是在其黑暗周期进行，这可能会提高其认知表现。

选择测试中的表现显著高于强制测试时，表明受试者对衰退测试反应的适应性使用，这提示存在元认知反应。然而，元认知反应可能源于对内部记忆线索或外部线索的依赖⁸。为了确定衰退测试反应的适应性使用是否确实由内部记忆线索驱动，实验者应尽可能消除外部线索的影响^8,14。所谓外部线索，是指受试者可用于指导是否选择衰退测试的任何公开可获取的、与特定测试相关的刺激或线索⁸。本任务中可能的外部线索包括不同气味的相对显著性、样本呈现时间、反应潜伏期以及反应间隔（RIs）的持续时间。如本文及后续结果论文中更详细描述的泛化测试¹⁹，有助于排除基于外部线索（例如因不同实验间任务参数不一致而导致的环境线索关联）的行为反应。

在此范式中，大鼠需要在记忆测试呈现之前（见8.2）就决定接受或拒绝测试，从而在很大程度上消除了反应竞争对拒绝测试反应的控制作用。反应竞争是指当元认知选择与主要记忆测试同时呈现时，大鼠因看到或闻到正确测试选项而倾向于选择接受测试⁸。要求大鼠在接触记忆测试本身之前就选择接受或拒绝测试，可显著降低反应竞争控制拒绝测试反应的可能性。然而，该设计的一个改进方案是，让大鼠通过在与记忆测试区域分离的 房间内做出特定反应来选择接受或拒绝测试。这将进一步增强该范式的前瞻性特征，可能更有效地排除外部线索的影响^8,19。未来研究的另一项改进是，如果可能，记录大鼠进入测试房间至其向左或向右转向（分别对应拒绝或接受测试）之间的反应潜伏期。这将使研究人员能够判断反应潜伏期是否作为外部线索，被受试动物随着时间推移学会与特定反应相关联（见⁸）。同时，记录受试动物是否以及何时改变其反应方向也将具有重要意义（见8.2；例如，从房间内MTS选择侧移动至拒绝测试区域，或反之亦然）。正如结果论文中所讨论的，我们仅观察到一次此类行为，这进一步支持了以下结论：大鼠在进入测试房间后即刻、且在接触记忆测试本身之前就已做出接受或拒绝测试的决定，其方式是系统性地采样每个选择性气味。

由于在此范式中测试的大鼠在多个泛化测试中表现出元认知反应的迁移，因此得出结论：大鼠具备元记忆能力——它们能够监控自身对样本的记忆¹⁹。其他研究团队对这一范式或其类似变式进行测试将十分重要，因为在能够确信大鼠具备元认知反应能力、且该行为受内部而非外部线索调控之前，必须获得来自不同实验室的验证性证据。检测这种重要的记忆能力（其随年龄增长而衰退）的存在，可能在转化医学研究记忆功能障碍时具有应用价值，例如用于转基因小鼠及阿尔茨海默病模型的研究。研究人员若将此行为范式与脑损伤、暂时性脑区失活或激活（例如 光遗传学、化学遗传学）以及电生理记录技术相结合，将尤其富有成效，因为这些研究有望揭示元认知过程背后的神经机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果圈早餐麦片	Kellogg's	B00I8QZ4HM	加糖麦片
社交行为检测室	Noldus Technologies	46503 / 46553
黑色贴膜纸	Con-Tact	B000KKMO90
硬纸板
陶瓷小动物食盘	Norpro	B00061N0QO	直径7 cm，高3.8 cm
儿童用沙子	ACTIVA	B004BNBXJ4	白色沙子
强力胶带	3M	B001HT720O	黑色强力胶带
肉桂	Simply Organic	FNTR07824	Amazon
咖啡	Folgers	B016KZTPJU	Amazon
红椒粉	Simply Organic	B06XB9QGVB	Amazon
百里香	Simply Organic	579193	Amazon
彩色沙子	Sandtastik Products	B000Q4O9UW	橙色沙子
70% 异丙醇	Swan	B00HKDI6WO	Amazon
手持式吸尘器（真空吸尘器）	Black + Decker	B01DAI5BZ2	无线吸尘器
金属轨道	Home Depot	EC751BA	用于检测室的门结构
刮铲	Chef Craft	B00B0M5LQK	呈直角弯曲，用于将样品杯放入检测装置中