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方法文章

通过类球体、克隆形成实验及斑马鱼异种移植模型对抗癌香豆素OT48生物活性的临床前评估

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DOI：

10.3791/57490

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2018年6月26日

 ,  , 
1Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了利用三维培养和斑马鱼进行抗癌香豆素类化合物的临床前筛选。

摘要

体外和体内的临床前筛选是癌症药物研发中不可或缺的工具。尽管人类癌细胞系在二维（2D）单层细胞培养中对治疗性化合物有反应，但为了在更接近生理条件的模型中理解药物的疗效，已开发出三维（3D）培养系统。近年来，临床前研究领域出现范式转变，即在3D培养系统中验证新分子的药效，以更精确地模拟肿瘤微环境。这些系统能以更符合生理相关性的方式表征疾病状态，有助于更深入地理解特定分子的药理作用机制和效力。此外，随着当前改进体内癌症模型的趋势，斑马鱼已成为评估体内肿瘤形成及研究治疗剂作用的重要脊椎动物模型。在此，我们通过三种不同的3D培养系统——集落形成实验（CFA）、球体形成实验（SFA）以及体内斑马鱼异种移植模型，研究了羟基香豆素OT48单独或联合BH3模拟物在肺癌细胞系A549中的治疗效果。

引言

癌症由细胞突变引起，导致生化信号通路受到破坏，从而触发细胞不受控制地分裂并抵抗细胞死亡。肿瘤会干扰消化系统、神经系统和循环系统的生理功能，并继而影响邻近组织1。尽管已开展大量研究，癌症仍是全球最普遍的威胁生命的疾病2。精准医学已被视为未来癌症治疗的基础。新的分子实体正被常规地与现有药物联合测试，以改善临床治疗效果。

然而，新开发高效靶向疗法面临的一个重要局限性在于，常用检测方法无法准确模拟药物暴露后的实际生物学效应3。癌症药物研发目前仍主要依赖于在二维单层培养的癌细胞系中测试治疗剂的疗效，而这类结果在临床试验中往往难以验证4。因此，人们日益关注开发更佳的癌症模型，以更真实地模拟体内肿瘤的固有特征in vivo5。近年来，随着对三维（3D）培养模型的兴趣不断增加，已推动了多种改进方法的发展，用于构建更优的3D肿瘤模型5。

本文介绍了一种结合三种不同3D细胞培养技术的方法，可在进行更深入的体内实验之前，增进对羟基香豆素OT486与BH3模拟物联合作用效能的理解。我们的方法是将克隆形成实验和SFAs与基于斑马鱼模型的体内肿瘤形成实验相结合，以进一步验证OT48与BH3模拟物在肺癌细胞中的联合疗效，并在活体生物中监测癌症进展。

集落形成实验常规用于评估抗癌药物对实体瘤和血液系统肿瘤的疗效。该实验用于测定细胞无限增殖并形成集落的能力7。通过观察集落数量和/或大小的减少，可判断抗癌药物对细胞集落形成能力的影响。

类球体代表 体外 肿瘤模型可作为抗癌药物的低成本筛选平台。类球体是由细胞在悬浮状态下或嵌入三维基质中聚集形成的细胞团。该方法广泛用于药物筛选以及肿瘤生长、增殖和免疫相互作用的研究。8.

为了充分了解一种新药的特性，必须在啮齿类动物上进行体内实验。然而，这种传统方法成本高昂且耗时较长。近年来，斑马鱼（Danio rerio）已成为广泛研究的实验模式生物，其养殖成本更低且周期更短。在斑马鱼体内形成的肿瘤代表了一种三维细胞培养方法，但其处于脊椎动物的体内环境中9。

总体而言，我们在此采用了三种不同的三维培养方法，包括CFAs、SFAs和斑马鱼 体内 通过肿瘤形成实验，验证香豆素衍生物OT48联合BH3模拟物在肺癌A549细胞模型中的抗肿瘤作用。

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方案

1. 克隆形成实验

  1. 在75 cm2培养瓶中，将A549细胞以20,000个细胞/cm2的浓度接种于15 mL RPMI1640细胞培养基中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素，在37 °C、5% CO2的CO2培养箱中培养。
  2. 实验当天，使用血细胞计数板测定细胞浓度。取细胞悬液于1.5 mL微量离心管中，以400 × g离心7分钟收集50,000个细胞，弃上清后用100 µL 1×无菌PBS（磷酸盐缓冲液）重悬细胞，置于1.5 mL离心管中。
  3. 使用多通道移液器将1.1 mL半固体甲基纤维素培养基（MCBM）分装至15 mL离心管中，每种实验条件准备一管。
  4. 使用P200移液器向1.1 mL MCBM中加入110 µL FBS。
  5. 按每毫升1,000个细胞的密度接种细胞。使用P2移液器从细胞储备液（50,000个细胞溶于100 µL 1× PBS）中吸取2.4 µL细胞悬液，加入含10% FBS的1.1 mL MCBM中。
  6. 加入细胞后，将离心管垂直放置，以最高速度涡旋振荡1分钟，充分混匀MCBM与细胞。
  7. 加入待测化合物（OT48单独使用或与A1210477联合使用）。另设一管仅加入溶剂作为对照（此处为二甲基亚砜，DMSO）。根据化合物浓度及各条件下的加样体积，溶剂对照组应包含所用稀释液中最高浓度的溶剂，以评估溶剂可能引起的不良影响。
  8. 将各管涡旋振荡1分钟。
  9. 每项检测中，使用P1000移液器将1 mL混合液加入12孔细胞培养板的中央孔中。
  10. 向空孔中加入1 mL无菌水或1× PBS，以维持培养箱内湿度稳定。
  11. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育10天。
  12. 孵育10天后，向每孔加入200 µL MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）储备液（5 mg/mL），使终浓度达到1 mg/mL。
  13. 在37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育10分钟。存活的细胞克隆将呈现紫色。
  14. 使用数码相机配合白色背景板（LAS white dia tray）拍摄图像。设置如下：方法为“digitize”；曝光类型为“precision”；曝光时间为手动1秒；灵敏度/分辨率设为高分辨率。图像保存为TIFF格式。
  15. 使用ImageJ软件对存活克隆进行定量分析。选择菜单 "Image | Type | 8 bit"。选择菜单 "Adjust | Threshold"。将阈值设为对照组水平，并在所有实验条件下保持一致；选择菜单 "Analyze | Analyze Particles"。保存数据，并使用统计学软件进行图形化分析。

2. 类球体形成实验

  1. 将A549细胞以20,000个细胞/cm2的浓度接种于75 cm2培养瓶中，加入15 mL RPMI 1640培养基，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素。
  2. 实验当天，准备一块96孔U型底培养板。
  3. 将10,000个细胞接种至已含有待测化合物（此处为50 µM OT48和/或20 µM A1210477）的孔中，用细胞培养基调整终体积至100 µL。能够形成边界完整、形态均一的球状体的细胞数量被视为适合用于球状体形成。
  4. 在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育3天。
  5. 孵育3天后，使用4倍物镜的光学显微镜拍摄球状体的图像。

3. 斑马鱼异种移植实验

注意：该技术方法以示意图形式展示（图1）。

  1. 储备试剂的配制
    1. 配制1 L的30倍浓度Danieau’s溶液：1740 mM NaCl、21 mM KCl、12 mM MgSO4∙7H2O、18 mM Ca(NO3)2 和150 mM HEPES。使用pH计将缓冲液的pH值调节至7.6。
    2. 配制1%（50倍浓度）三卡因溶液：将20 mg的氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（tricaine）溶解于2 mL蒸馏水中。
    3. 配制1%酚红-PBS溶液：在1.5 µL离心管中，将2 µL酚红钠盐溶液加入198 µL无菌PBS溶液中。
    4. 配制3%甲基纤维素溶液：将3 g甲基纤维素加入100 mL的1倍浓度Danieau’s溶液中。
  2. 斑马鱼卵的产生与孵育
    1. 将一条雌性与一条雄性斑马鱼分别置于装有经紫外线灭菌和过滤的自来水、温度为28.5 °C的分隔养殖箱中，在黑暗条件下饲养。分离24小时后，将两尾鱼混合以启动交配。将受精卵从交配箱转移至含有5 mL新鲜Danieau’s溶液的培养皿中。
    2. 用5 mL Danieau’s溶液清洗卵子三次。清洗时，用移液器小心吸取卵子并转移至5 mL新鲜溶液中。在28.5 °C条件下孵育8小时。
      1. 在Danieau’s溶液中孵育8小时后，更换为含有0.03% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的Danieau’s溶液，以抑制色素形成。挑出不透明的卵（未受精或含有未发育胚胎的卵），防止污染。
  3. 胚胎脱膜处理
    1. 受精后24小时（hpf），使用尖头镊子对斑马鱼胚胎进行脱膜。将孵化中的胚胎在含0.03% PTU的Danieau’s溶液中于28.5 °C继续孵育至48 hpf。
  4. 化合物处理细胞的制备
    1. 将A549细胞以20,000个细胞/cm2的密度接种于25 cm2培养瓶中。接种24小时后，在37 °C、5% CO2的培养箱中加入化合物（此处为OT48 50 µM 和/或 A1210477 20 µM）处理24小时。设定每种化合物的处理时间，以维持细胞存活率的同时诱导其进入细胞死亡程序。该时间点需根据细胞活力、形态及分子标志物个体化确定。
    2. 在处理结束前2小时，于37 °C、5% CO2条件下用4 µM荧光细胞示踪染料CM-Dil对细胞进行染色。染色2小时后，用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将106个细胞重悬于50 µL酚红-PBS溶液中，准备注射。
  5. 用于异种移植的癌细胞微量注射
    1. 将斑马鱼置于0.02%三卡因溶液中麻醉5分钟，直至其静止于琼脂板上。
    2. 使用微量移液器拉制仪拉制外径（OD）为1.0 mm的玻璃毛细管（程序设置：P: 300，Heat: 260，Pull: 60，VEL: 50，Time: 200）。用注射器切断毛细管以形成锐利切口。向毛细管中加载20 µL细胞/酚红-PBS混合液。设定注射压力和时间，使每次注射体积为2 nL。
    3. 通过3至5次注射，向卵黄囊内注射100–200个细胞（每次注射6至10 nL）。注射后，将鱼转移至含PTU的新鲜Danieau’s溶液（5 mL）中恢复10至30分钟。随后将鱼分装至24孔板中，每孔加入含PTU的Danieau’s溶液1 mL，并在28.5 °C孵育72小时。
    4. 孵育72小时后，用0.02%三卡因溶液麻醉鱼，并在载玻片上用一滴3%甲基纤维素固定。在620至750 nm波长下，使用荧光显微镜拍摄5倍放大图像。
    5. 使用ImageJ软件定量荧光肿瘤的大小。选择菜单 "Analyze | Measure"。保存对应于荧光信号的数值，并使用统计软件进行图形化分析。

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结果

在图2中，将肺癌细胞系A549接种于MCBM中，并用OT48单独或联合BH3模拟物A1210477在指定浓度下处理，以形成克隆。结果显示，经10天培养后，联合处理显著减少了克隆的数量、大小以及总面积。

在图3中，A549细胞单独使用OT48处理，或与BH3模拟物A1210477联合处理，并采用U型底板法诱导其形成球状体。培养3天后，拍摄球状体图像。使用Image J进行球状体定量分析，并生成三维图像。

在图4中，A459细胞单独或联合使用OT48与BH3模拟物A1210477处理24小时后，注射至斑马鱼卵黄囊中。72小时后，荧光肿瘤的定量结果反映了化合物的...

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讨论

MCBM 中菌落形成率取决于细胞类型。通常情况下，非贴壁细胞形成的菌落数量远高于贴壁细胞。我们观察到 A549 细胞在 10 天后形成 30 至 40 个菌落。此前我们报道过，不同白血病细胞的菌落数量在 200 至 250 之间。9我们的结果表明，OT48 单独使用并未显著减少菌落数量。然而，当与 BH3 模拟物 A1210477 联用时，A549 细胞的集落形成能力被协同抑制。此前我们曾报道，另一种羟基香豆素衍生物 OT52 也能与 BH3 模拟物协同作用，抑制 A549 细胞的集落形成能力。建议的接种浓度可能在 1 × 103 至 1.5 × 103使用MethoCult进行的集落形成分析（CFA）是一种常用于评估多种癌细胞系致瘤性的有价值技术，但该方法存在一些局限性。实验后，活细胞集落的回收往往不便，且细胞一旦从MCBM中分离并接种至RPMI1640培养基中，生长状况通常不佳。尽管如此，该技术仍被广泛认可为一种重要的临床前研究手段，可用于深入理解癌症在三维环境中的进展机制。三维生长条件能够更准确地模拟肿瘤形成的自然环境 体内

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

首尔国立大学的研究工作获得了韩国教育部（MEST）通过国家研究基金会（NRF）资助的肿瘤微环境全球核心研究中心（GCRC）项目[项目编号 2011-0030001]、首尔国立大学研究基金以及脑韩国（BK21）PLUS计划的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
集落形成实验所需材料
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20 C°
青霉素-链霉素Lonza17-602E-20 C°
细胞培养瓶 T75SPL70075室温
PBS 溶液HycloneSH30256.02室温
1.5 ml 离心管ExtrageneTube-170-C室温
15 ml 离心管Hyundai MicroH20015室温
12 孔板SPL30012室温
MethoCultStemCell Technologies4230-20 C°
噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT 粉末）SigmaM56224 C°
LAS4000GE Healthcare Technologies室温
类球体形成实验所需材料
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20 C°
青霉素-链霉素Lonza17-602E-20 C°
细胞培养瓶 T75SPL70075室温
PBS 溶液HycloneSH30256.02室温
胰蛋白酶-EDTAGibco25-300-0544 C°
Corning Costar 超低吸附 96 孔板Corning3474室温
显微镜NikonEclipse TS100室温
斑马鱼异种移植实验所需材料
A549ATCCCCL-18537 C°
RPMI 1640Lonza300964 C°
FBSBiowestS1520-500-20 C°
青霉素-链霉素Lonza17-602E-20 C°
细胞培养瓶 T25SPL70025室温
细胞培养瓶 T75SPL70075室温
细胞培养瓶 T175SPL71175室温
1.5 ml 离心管ExtrageneTube-170-C室温
24 孔板SPL30024室温
培养皿SPL10100室温
PBS 溶液HycloneSH30256.02室温
胰蛋白酶-EDTAGibco25-300-0544 C°
氯化钠Sigma-Aldrich71382室温
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541室温
七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）Sigma-AldrichM2773室温
四水合硝酸钙（Ca(NO3)2）Sigma-AldrichC1396室温
HEPES 溶液Sigma-AldrichH0887室温
甲磺酸乙酯氨基苯甲酸酯（Tricaine）Sigma-AldrichE10521室温
酚红溶液Sigma-AldrichP0290室温
甲基纤维素Sigma-AldrichM0512室温
1-苯基-2-硫脲（PTU）Sigma-AldrichP7629室温
CM-Dil 染料InvitrogenC7001-20 C°
玻璃毛细管World Precision InstrumentsTW 100F-4室温
微量移液器拉制仪Shutter Instrument, USAP-97室温
显微注射仪World Precision InstrumentsPV820室温
注射器KOVAX1ml室温
微量加样器Eppendorf5242956003室温
载玻片MarienfeldHSU-1000612室温
荧光显微镜LeicaDE/DM 5000B室温

参考文献

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