小鱼肾注射液循环系统中微粒的简易有效管理与可视化

Summary

本文阐述了快速、微创荧光微粒注入小鱼循环系统的原理和鱼血中微粒的体内可视化。

Abstract

将微粒径粒子系统地管理到生物体中, 可用于血管可视化、药物和疫苗的提供、转基因细胞的植入和微小的光学传感器。然而, 静脉注射 microinjections 的小动物, 主要用于生物和兽医实验室, 是非常困难的, 需要训练有素的人员。在此, 我们展示了一种健壮和有效的方法, 引入微粒进入成年斑马鱼 (斑马斑马) 的循环系统, 注入到鱼肾。为了对微血管中引入的微粒进行可视化, 我们提出了一种简单的鱼鳃活体成像技术。在体内监测斑马鱼的血液 pH 值是使用注射微胶囊荧光探针, SNARF-1, 以证明其中一个可能的应用的描述技术。本文详细介绍了 pH 敏感染料的封装, 并说明了该微胶囊在荧光信号活体记录中快速注射和可视化的原理。所提出的注射方法的特点是低死亡率 (0-20%) 和高效率 (70-90% 成功), 并易于使用常用设备。所有被描述的规程可以执行对其他小鱼种类, 例如孔雀鱼和鳉。

Introduction

在药物和疫苗的提供¹、血管可视化²、转基因细胞植入³和微型光学传感器植入等领域, 微粒径颗粒的管理是一项重要任务。^4,5. 然而, 微型微粒进入小实验动物的血管系统的植入程序是困难的, 特别是对于微妙的水生生物。对于像斑马鱼这样的热门研究标本, 建议使用视频协议来澄清这些程序。

心内和毛细血管 microinjections 需要训练有素的人员和独特的显微外科设施, 以提供 microobjects 到斑马鱼的血液。此前,³是一种简便有效的全细胞管理方法。然而, 在我们的经验中, 由于眼毛管网络的面积很小, 这项技术需要大量的实践才能达到预期的效果。

在此, 我们描述了一种方法, 通过手动注射直接注入到富含毛细血管和肾血管的成年斑马鱼的肾脏组织中, 以强力有效的微粒注入循环系统。该技术是基于视频协议的细胞移植到斑马鱼肾脏⁶, 但创伤和耗时的显微手术步骤被淘汰。该方法具有低死亡率 (0-20%) 和高效率 (70-90% 成功) 的特点, 易于使用常用设备。

Protocol

所有实验程序都是按照欧盟 2010/63/欧盟关于动物实验的指令进行的, 并经伊尔库茨克州立大学生物研究所动物学科研究委员会批准。

1. 微胶囊的制备

注: 携带荧光染料的微胶囊采用相反带电聚电解质^7、8的逐层组装制备。所有的程序都是在室温下进行的。

1. 为了合成多孔碳酸钙₃ microcores 包围荧光染料, 混合2毫升的 SNARF-1-dextran 溶液 (大多数聚合物绑定荧光染料, 如 FITC-BSA 可以使用) 在2毫克/毫升浓度约0.6 毫升每1摩尔/L 溶液 CaCl₂和 Na₂CO₃下快速搅拌。
   注意: 注意荧光染料对漂白的不同敏感性;如果使用光敏荧光探针 (如 SNARF-1), 则必须以尽可能少的光来执行微粒的操作和储存。
2. 经过5-10 秒的搅拌, 将悬浮液转移到2毫升离心管和离心机, 十五年代在1000万克碳酸钙₃ microcores。
3. 丢弃上清, 用〜2毫升的去离子水洗涤芯, 并通过摇动并用重悬颗粒。
4. 重复离心洗涤程序总共三次。最后一次离心后, 丢弃上清。
5. 在超声波....

Results

得到的结果来自三个主要类别的协议: 荧光染料的封装形成荧光微粒 (图 1), 肾脏注射微囊的进一步可视化鳃毛细血管 (图 2 和 3), 最后,在体内光谱记录 SNARF-1 荧光监测血液 pH 值 (图 4)。

逐层方法使用模板碳酸钙₃芯的涂层, 将染料由多个相反电荷的聚合物 (多环芳烃和 PSS) 和一个最外层的生物相容性聚合物 (PLL-克-PEG) 包裹在一起, 是一种简单而经济高效的方法。允许封装不同的荧光探针, 如 SNARF-1-dextran, FITC 或其他 (图 1A)。结果, 得到了具有.......

Discussion

为了证明微粒注入斑马鱼肾脏, 我们使用了半渗透性微胶囊加载的指示染料。因此, 该协议包含使用相反带电聚电解质^{7、8、15、16、}17 的逐层组装制备微囊的指示 ^,18 (图 1A)。这项技术的优点是它易于使用现有的实验室设备。根据所使用的条件和化合物, 制备的微囊可从0.5 到100µm, 纳米厚的聚电解质壳¹⁵。本手稿中所描述的合成参数导致的弹性微囊包括12层 (除最终生物相容层) 的聚合物大约2-6 µm 的大小 (图 1B和 1C)。决定微囊.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-葡聚糖，70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	荧光探针。任何其他合适的聚合物结合荧光染料都可用作微胶囊填料
白蛋白-荧光素异硫氰酸酯偶联物 （FITC-BSA）	SIGMA	A9771	荧光探针
罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖 （RITC-葡聚糖）	SIGMA	R9379	荧光探针
氯化钙	SIGMA	C1016	CaCO3 模板形成
碳酸钠	SIGMA	S7795	CaCO3 模板形成
聚烯丙胺盐酸盐），MW 50000 （PAH）	SIGMA	283215	阳离子聚合物
聚（4-苯乙烯磺酸钠），MW 70000 （PSS）	SIGMA	243051	阴离子聚合物
聚-L-赖氨酸 [20 kDa] 与聚乙二醇 [5 kDa] 接枝，g = 3.0 至 4.5 （PLL-g-PEG）	SuSoS	PLL（20）-g[3.5]-PEG（5）	增加微胶囊生物相容性的最终聚合物
氯化钠	SIGMA	S8776	溶解应用聚合物
净水系统	Millipore	SIMSV0000	制备去离子水
磁力搅拌器	Stegler		用于 CaCO3 模板的形成
Eppendorf 埃彭多夫 研究 plus 移液器，1000 和微量;L	Eppendorf		加液解决方案
Eppendorf 研究 加分管，10 & 微量;L	Eppendorf		加液解决方案
移液器吸头，量程范围 200 至 1000 µL	F.L. Medical	28093	剂量溶液
移液器吸头，量程范围 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	加液解决方案
微型离心机 Microspin 12，高速	BioSan		用于微胶囊离心清洗程序
微量离心管，2 mL	Eppendorf	Z666513	微胶囊合成和储存
床 智能混合器 RM-1L	ELMY Ltd.		减少微胶囊聚集
超声波清洁器			减少微胶囊聚集
耳机			保护耳朵免受超声波
伤害 乙二胺四乙酸	SIGMA	EDS	溶解CaCO3模板
一钠	SIGMA	S9638	pH缓冲液的制备
磷酸二钠	SIGMA	S9390	pH缓冲液的制备
氢氧化钠	SIGMA	S8045	调节 EDTA 溶液和缓冲液的 pH 值
恒温室			干燥载玻片上的微胶囊
血细胞计数室			研究制备的微胶囊的大小分布和浓度
荧光显微镜 Mikmed 2	LOMO		鱼血
中微胶囊的体内可视化SNARF-1 的荧光滤光片组（应根据显微镜型号进行选择;提供了示例）	Chroma	79010	用荧光探针观察微胶囊
光纤光谱仪 QE Pro	海洋光学		显微镜下微胶囊的校准
光纤 QP400-2-VIS NIR， 400 μm， 2 m	海洋光学		将光谱仪与显微镜端口连接
准直器 F280SMA-A	Thorlabs		将光谱仪与显微镜端口连接
玻璃显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-A3	显微镜下微胶囊的校准
盖玻片，22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	显微镜下
微胶囊的校准玻璃微毛细管 Intra MARK， 10 & micro;L	Blaubrand	BR708709	收集鱼血
丁香油	SIGMA	C8392	鱼麻醉
柳叶刀 No 11	Apexmed international BV	P00588	切开鱼尾并从胰岛素自动注射器尖端释放钢针
肝素，5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	用于处理鱼血采集过程中与鱼血接触的所有表面
7 2 Go Pro pH 计，带微电极	梅特勒-托利多		测定鱼血 pH 值
笔针 Micro-Fine Plus， 0.25 x 5 毫米	Becton， Dickinson and Company		用于注射程序。任何细针（Ø 0.33 毫米或更小）都是合适的
玻璃毛细管，1 x 75 毫米	Hirschmann Laborgeräte GmbH &Co	9201075	用于注射程序
气体火炬			用于将钢针焊接到玻璃毛细管上
显微注射器 IM-9B	NARISHIGE		用于微胶囊悬浮
培养皿的精确剂量 培养皿，60 mm x 15 mm，聚苯乙烯	SIGMA	P5481	用于麻醉下鱼的作
塑料勺			用于麻醉下鱼的作
湿海绵			用于麻醉下鱼的作
解剖剪刀	Thermo Scientific	31212	去除鱼头上的鳃盖
巴斯德移液管，3.5 mL	品牌	Z331767	润湿鱼鳃