利用肾脏注射法在小型鱼类循环系统中简便高效地施用和可视化微粒

摘要

本文演示了将荧光微粒快速、微创注射至小型鱼类循环系统的基本原理及方法 体内 鱼类血液中微粒的可视化

摘要

将微米级颗粒系统性地注入活体生物体内，可用于血管可视化、药物和疫苗递送、转基因细胞移植以及微型光学传感器的植入。然而，在生物和兽医实验室中常用的实验小动物身上进行静脉内微注射操作非常困难，且需要经过专业培训的技术人员。本文展示了一种通过向鱼类肾脏注射，将微粒高效导入成年斑马鱼（Danio rerio）循环系统中的可靠方法。为在血管系统中可视化所引入的微粒，我们提出了一种在鱼鳃中进行的简单活体成像技术。体内监测斑马鱼血液pH值是通过注射包封的荧光探针SNARF-1实现的，以展示该技术的潜在应用之一。本文详细描述了pH敏感性染料的微胶囊化过程，并阐述了快速注射及在体内记录荧光信号时对所得微胶囊进行可视化的基本原理。该注射方法具有较低的死亡率（0–20%）和高操作成功率（70–90%），且仅需常规实验设备即可实施。所有所述操作均可推广应用于其他小型鱼类物种，如孔雀鱼和青鳉鱼。

引言

将微米级颗粒施用于动物体内，在药物和疫苗递送¹、血管系统成像²、转基因细胞移植³以及微型光学传感器植入^4,5等领域中是一项重要任务。然而，将微米级颗粒植入小型实验动物的血管系统操作较为困难，尤其对于结构精细的水生生物而言更是如此。对于斑马鱼等常用研究模型，建议通过视频实验方案来明确这些操作流程。

心脏内和毛细血管微注射需要经过培训的专业人员以及专门的显微外科设施，以将微小物体递送至斑马鱼血液中。此前，有研究建议采用眼后手动注射³ 作为递送完整细胞的一种简便且有效的方法。然而，根据我们的经验，由于眼部毛细血管网络区域较小，要通过该技术达到理想的注射效果需要大量练习。

本文介绍一种通过手动注射将微粒高效且稳定地植入成年斑马鱼肾脏组织（富含毛细血管和肾血管）从而进入循环系统的方法。该技术基于斑马鱼肾脏细胞移植的视频实验方案⁶，但省略了具有创伤性且耗时的显微外科操作步骤。本方法具有低死亡率（0–20%）和高成功率（70–90%）的特点，且仅需常规设备即可实施。

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方案

所有实验操作均按照欧盟动物实验指令2010/63/EU进行，并已获得伊尔库茨克国立大学生物研究所动物实验研究委员会的批准。

1. 微胶囊的制备

注意：采用带相反电荷的聚电解质逐层组装的方法制备载有荧光染料的微胶囊^7,8。所有操作均在室温下进行。

1. 为了合成包裹荧光染料的多孔 CaCO₃ 微核，将 2 mL 浓度约为 2 mg/mL 的 SNARF-1-葡聚糖溶液（大多数聚合物结合的荧光染料如 FITC-BSA 均可使用）与各 0.6 mL 的 1 mol/L CaCl₂ 和 Na₂CO₃ 溶液在快速搅拌下混合。
   注意：请注意不同荧光染料对光漂白的敏感性差异；若使用对光敏感的荧光探针（如 SNARF-1），操作和储存微粒时应尽可能避免光照。
2. 搅拌 5–10 秒后，将悬浮液转移至 2 mL 微量离心管中，在 10,000–12,000 g 条件下离心 15 秒，以沉淀 CaCO₃ 微核。
3. 弃去上清液，用约 2 mL 去离子水洗涤微核，并通过振荡重新悬浮沉淀。
4. 总共重复离心-洗涤步骤三次。最后一次离心后，弃去上清....

结果

所得结果来自本方案所述的三个主要类别之一：通过包封荧光染料形成荧光微粒（图1），将微胶囊注射至肾脏，随后在鳃部毛细血管中进行进一步观察（图 2 和 3）以及，最后， 体内 利用SNARF-1荧光光谱记录监测血液pH水平（图4).

采用逐层自组装方法，通过在包埋染料的模板CaCO₃微球表面依次涂覆多层带相反电荷的聚合物（PAH和PSS），并在最外层修饰一层生物相容性聚合物（PLL-g-PEG），是一种简单且经济高效的封装多种荧光探针（如SNARF-1-葡聚糖、FITC-BSA或其他探针）的方法（图1A）。该方法最.......

讨论

为了演示将微粒注射到斑马鱼肾脏中的过程，我们使用了装载指示性染料的半透性微胶囊。因此，本方案包含了利用带相反电荷的聚电解质逐层组装技术制备微胶囊的操作说明^{7,8,15,16,17,18}（图1A）。该技术的一个优势在于，仅需常规实验室设备即可轻松完成。根据所用条件和化合物的不同，所制备的微胶囊尺寸可在0.5至100 µm之间，其聚电解质壳层厚度为纳米级¹⁵。本文所述合成参数可获得弹性微胶囊，其由12层聚合物构成（此外还有一层最终的生物相容性涂层），尺寸约为2–6 µm（图 1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SNARF-1-葡聚糖，70000 分子量	Thermo Fisher Scientific	D3304	荧光探针。任何其他合适的聚合物结合的荧光染料均可作为微胶囊填充物
牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物（FITC-BSA）	SIGMA	A9771	荧光探针
罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（RITC-葡聚糖）	SIGMA	R9379	荧光探针
氯化钙	SIGMA	C1016	用于形成 CaCO3 模板
碳酸钠	SIGMA	S7795	用于形成 CaCO3 模板
聚（烯丙胺盐酸盐），分子量 50000（PAH）	SIGMA	283215	阳离子聚合物
聚（苯乙烯磺酸钠），分子量 70000（PSS）	SIGMA	243051	阴离子聚合物
聚-L-赖氨酸 [20 kDa] 接枝聚乙二醇 [5 kDa]，接枝度 g = 3.0 至 4.5（PLL-g-PEG）	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	最终使用的聚合物，用于提高微胶囊的生物相容性
氯化钠	SIGMA	S8776	用于溶解所用聚合物
水净化系统	Millipore	SIMSV0000	用于制备去离子水
磁力搅拌器	Stegler		用于 CaCO3 模板的制备
Eppendorf Research plus 移液器，1000 µL	Eppendorf		用于溶液的加样
Eppendorf Research plus 移液器，10 µL	Eppendorf		用于溶液的加样
移液器吸头，体积范围 200 至 1000 µL	F.L. Medical	28093	用于溶液的加样
移液器吸头，体积范围 0.1–10 μL	Eppendorf	Z640069	用于溶液的加样
Mini-centrifuge Microspin 12，高速离心机	BioSan		用于微胶囊的离心-洗涤步骤
微量离心管，2 mL	Eppendorf	Z666513	用于微胶囊的合成与储存
摇床 Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		用于减少微胶囊的聚集
超声清洗仪			用于减少微胶囊的聚集
耳机			用于保护耳朵免受超声波影响
乙二胺四乙酸	SIGMA	EDS	用于溶解 CaCO3 模板
磷酸二氢钠	SIGMA	S9638	用于制备 pH 缓冲液
磷酸氢二钠	SIGMA	S9390	用于制备 pH 缓冲液
氢氧化钠	SIGMA	S8045	用于调节 EDTA 溶液和缓冲液的 pH
恒温箱			用于在载玻片上干燥微胶囊
血细胞计数板（血球计数室）			用于检测所制备微胶囊的粒径分布和浓度
荧光显微镜 Mikmed 2	LOMO		用于活体观察鱼类血液中的微胶囊
SNARF-1 荧光滤光片组（应根据显微镜型号选择；此处提供示例）	Chroma	79010	用于带有荧光探针的微胶囊的可视化
光纤光谱仪 QE Pro	Ocean Optics		用于在显微镜下对微胶囊进行校准
光纤 QP400-2-VIS NIR，400 μm，2 m	Ocean Optics		用于连接光谱仪与显微镜端口
准直器 F280SMA-A	Thorlabs		用于连接光谱仪与显微镜端口
玻璃显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-A3	用于在显微镜下对微胶囊进行校准
盖玻片，22 × 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	用于在显微镜下对微胶囊进行校准
玻璃毛细管 Intra MARK，10 µL	Blaubrand	BR708709	用于采集鱼类血液
丁香油	SIGMA	C8392	用于鱼类麻醉
11 号采血针	Apexmed international B.V.	P00588	用于切割鱼尾以及从胰岛素自动注射器尖端释放钢针
肝素，5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	用于处理在鱼类血液采集过程中所有与血液接触的表面
Seven 2 Go Pro pH 计，配备微电极	Mettler Toledo		用于测定鱼类血液的 pH 值
胰岛素笔用针头 Micro-Fine Plus，0.25 × 5 mm	Becton, Dickinson and Company		用于注射操作。任何细针（Ø 0.33 mm 或更小）均可适用
玻璃毛细管，1 × 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	用于注射操作
气体喷灯			用于将钢针焊接至玻璃毛细管
显微注射仪 IM-9B	NARISHIGE		用于精确加样微胶囊悬浮液
培养皿，60 mm × 15 mm，聚苯乙烯材质	SIGMA	P5481	用于对麻醉状态下的鱼类进行操作
塑料勺			用于对麻醉状态下的鱼类进行操作
湿润海绵			用于对麻醉状态下的鱼类进行操作
解剖剪刀	Thermo Scientific	31212	用于去除鱼头上的鳃盖
巴斯德移液管，3.5 mL	BRAND	Z331767	用于湿润鱼鳃