用于个体化囊性纤维化跨膜电导调节因子研究的人鼻上皮细胞球体的生成

摘要

本文介绍一种建立人鼻腔上皮细胞三维球状体培养的方法。通过刺激球状体，诱导其产生囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）依赖性的离子和液体分泌，并以球状体管腔大小的变化作为CFTR功能的指标进行定量分析。

摘要

尽管囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）调节药物的引入已彻底改变了囊性纤维化（CF）的治疗模式，但目前采用的基因型导向治疗模型仍存在若干局限性。首先，罕见或研究不足的突变类型通常被排除在确证性临床试验之外。此外，随着更多调节药物进入市场，为个体患者优化药物选择将变得愈发困难。上述两个问题可通过使用源自患者的、个性化的CFTR功能与调节的临床前模型系统加以解决。人鼻上皮细胞（HNEs）是构建此类模型时易于获取的呼吸道组织来源。本文中，我们描述了一种利用原代HNEs建立的三维类球体模型，用于评估CFTR功能及其调节。HNEs以微创方式从受试者中分离获得，在条件重编程条件下扩增后接种至类球体培养体系。接种后两周内，类球体培养可形成HNE类球体，可通过添加生成3',5'-环磷酸腺苷（cAMP）的激动剂来激活CFTR功能。随后通过量化类球体的肿胀程度，作为CFTR活性的替代指标。HNE类球体充分利用了鼻源细胞微创获取且具有呼吸道来源特性的优势，构建出一种易于获取、个体化且与反映疾病发病率和死亡率的上皮组织密切相关的研究模型。与气液界面培养的HNE模型相比，类球体成熟速度相对较快，从而降低了整体污染率。目前该模型的局限性在于通量较低，但组织获取的相对简便性在一定程度上弥补了这一不足。HNE类球体可用于在个体水平上可靠地定量和表征CFTR活性。一项正在进行的研究正致力于将该定量结果与 体内 药物反应将决定HNE类球体是否能真正成为预测患者对CFTR调节治疗反应的临床前模型。

引言

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种致命的常染色体隐性遗传病，全球有超过7万人受其影响¹。这种缩短寿命的遗传性疾病由囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, CFTR）基因突变引起²。CFTR属于腺苷三磷酸结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette）蛋白家族，作为离子通道发挥作用，介导氯离子和碳酸氢根离子跨多种极化上皮细胞的顶膜转运，这些上皮组织包括胃肠道、汗腺和呼吸道等^3,4。因此，CFTR功能异常会导致多系统上皮功能障碍，其中大多数死亡源于呼吸系统疾病¹。在CF患者的肺部，CFTR介导的气道表面液体（airway surface liquid, ASL）调节功能及黏液分泌失控，导致黏液增厚、气道阻塞、慢性感染以及进行性的气道重塑和肺功能下降^1,5。

尽管已确定CFTR功能障碍是该疾病的病因，但囊性纤维化（CF）的传统治疗主要集中在缓解症状（例如，胰酶替代疗法、气道清除疗法）¹。近年来，随着一类新型治疗药物——即"CFTR调节剂"——的出现，这一治疗模式发生了革命性变化，这类药物可直接靶向功能异常的CFTR蛋白。该策略使临床治疗从症状管理转向疾病修饰治疗，但仍存在若干局限性^6,7,8,9,10。调节剂的作用具有特异性，仅针对特定CFTR突变所伴随的蛋白缺陷，且仅适用于部分遗传人群¹¹。这一局限性源于蛋白缺陷的异质性，也受限于在罕见突变群体中开展临床试验的可行性较低。此外，在基因型已被充分研究的患者中（例如，F508del/F508del CFTR，这是最常见的CFTR突变），疾病负担和对调节剂的治疗反应仍存在显著个体差异^6,7,8,9,11。

为克服上述两个问题，研究人员已提出在临床前测试中采用个体化模型¹²。该概念利用患者特异性组织构建个性化的体外（ex vivo）模型系统，用于化合物测试，以个性化方式预测个体对治疗的体内（in vivo）反应。一旦经过验证，此类模型可被临床医生用于指导精准治疗，而无需考虑患者潜在的CFTR基因型。

在肺移植时从移植组织中获取的人支气管上皮（HBE）细胞，首次证明了此类囊性纤维化（CF）模型的可行性^13,14。在气液界面（ALI）培养的HBE细胞可通过电生理检测直接定量功能性的囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR），或通过气道表面液体（ASL）稳态的指标间接评估^13,15。该模型对理解CFTR生物学功能至关重要，并在CFTR调节剂的研发过程中发挥了关键推动作用¹⁶。然而，由于获取组织的方式具有侵入性（肺移植或支气管刷检），且罕见突变或轻症患者缺乏可用样本，HBE模型难以作为个体化模型广泛应用。相比之下，通过直肠或十二指肠活检获取的肠道组织可用于肠电流检测（ICM）或基于肿胀的类器官检测，以研究个体化的CFTR功能^17,18,19。尤其是类器官检测，对CFTR活性具有极高的敏感性^20,21,22。但这两种模型均受限于组织来源（肠道组织，而大多数疾病病理发生在呼吸系统）以及获取方式的半侵入性。此外，已有若干研究者采用人鼻上皮（HNE）细胞来模拟CFTR功能的恢复^23,24,25。HNE细胞可通过刷取或刮取方式安全地从各年龄段受试者中获取，在ALI培养条件下可重现HBE细胞的多种特性^25,26,27,28。传统上，HNE单层培养模型受限于鳞状化生及成熟周期较长的问题²⁹。此外，报道的HNE细胞短路电流测量值小于HBE细胞，提示其检测治疗效果的动态范围较小²⁵。

鉴于需要一种个性化的、非侵入性的、用于研究CFTR功能的呼吸道组织培养模型，我们尝试将基于肿胀的类器官检测的高灵敏度与HNEs的非侵入性和呼吸道特性相结合。在此，我们描述了一种生成HNEs三维"球状体"培养物的方法，用于在基于肿胀的检测中进行个体化的CFTR研究³⁰。HNE球状体能够稳定地极化，其上皮顶端朝向球体中心，即管腔。该模型重现了下呼吸道上皮的多种特征，并且比气液界面（ALI）培养成熟更快。作为一种功能性检测方法，HNE球状体可稳定地量化一系列CFTR功能，以及在已有深入研究的突变组（e.g.，F508del CFTR）中的功能调节。该基于肿胀的检测利用CFTR的离子/盐转运特性，通过水跟随顶端盐分外排而间接测量液体向球状体内的流入。在这种方式下，具有完全功能性CFTR的刺激后球状体会显著膨胀，而CFTR功能异常的球状体则膨胀较少或发生收缩。这一变化通过图像分析在刺激前和刺激后1小时的球状体进行量化，测量管腔面积并计算其变化百分比。随后，该指标可用于不同实验组之间的比较，以实现针对患者特异性的药物生物活性筛选。

方案

HNE 样本来自通过辛辛那提儿童医院医学中心囊性纤维化研究中心招募的受试者。本研究所述所有方法均已获得辛辛那提儿童医院医学中心机构审查委员会（IRB）的批准。所有受试者在检测前均签署了书面知情同意书。

1. 准备扩增培养基和抗生素培养基

1. 收集下表所列的培养基组分 表1在室温下解冻冷冻材料，并按指示配制所需的储备溶液 表1 在……下方 "扩增培养基".
   注意：霍乱毒素具有毒性，若摄入可致中毒，且对皮肤、眼睛和呼吸道具有刺激性，操作时需小心。所有溶液和培养基的配制及混合均应在生物安全柜内的洁净条件下进行。
2. 使用50 mL血清移液管，从一个容器中移除并弃去50 mL基础培养基（DMEM/F12），以补偿后续添加的其他成分。将所有基础培养基手动倒入一个已灭菌的1 L玻璃瓶中。
3. 根据需要，使用50 mL刻度吸管或1 mL移液器，将所有剩余组分从 "扩增培养基" 部分 表1 倒入含有培养基的已灭菌玻璃瓶中。用手轻轻摇晃瓶子以混匀。
4. 按照制造商说明，使用新的无菌1 L、0.22 µm聚醚砜（PES）滤器过滤培养基，并标注 "扩增培养基" 和日期。
5. 制备抗生素培养基。按照表1中的说明配制所需的抗生素储备液。 "抗生素培养基"
   1. 使用一支50 mL刻度吸管，将150 mL扩增培养基转移至一个洁净的250 mL autoclaved玻璃瓶中。
   2. 使用1 mL移液器，将所有组分从 "抗生素培养基" 部分 表1 加入到含有培养基的已灭菌玻璃瓶中。用手轻轻旋转混匀，直至培养基外观均匀一致。
   3. 按照制造商说明，将滤膜过滤至一个新的无菌250 mL、0.22 µm PES滤瓶中，并标注 "抗生素培养基" 和日期。
6. 将培养基在 4 °C 保存，最长可存放一个月；若出现浑浊，提示可能污染，应丢弃。

2. 准备分化培养基

1. 收集 表2 中列出的培养基组分。在室温下融化冷冻材料，并按照 表2 中的说明配制所需的储备液。
   注意：操作视黄酸时需谨慎，该物质具有生殖毒性，吞食后可能有毒，并可引起皮肤刺激。所有溶液和培养基的配制、分装及混合均须在生物安全柜内的洁净条件下进行。
2. 从一个容器中移除并弃去 52 mL 基础培养基，以补偿后续添加的其他成分。将所有基础培养基倒入一个已灭菌的 1 L 玻璃瓶中。
3. 根据需要使用 25 mL 血清移液管或 1 mL 移液器，将 表2 中其余所有组分转移至盛有培养基的已灭菌玻璃瓶中，用手轻轻旋转混匀。
4. 按照制造商说明，使用 0.22 µm 聚醚砜（PES）滤膜将培养基过滤至新的无菌 1 L 滤瓶中，并标注 "分化培养基" 及日期。
5. 将培养基在 4 °C 保存，最多可保存一个月；若出现浑浊，提示可能污染，应予以丢弃。

3. 包被培养皿并接种饲养层成纤维细胞

注意：所有步骤均须在生物安全柜内的洁净条件下进行。

1. 在50 mL锥形管中，将0.5 mL胶原蛋白储备液与37.5 mL无菌水混合。
2. 用移液器将4–5 mL胶原蛋白溶液加入每个洁净的P100培养皿中，确保完全覆盖整个表面。
3. 盖上培养皿盖，在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。
4. 在生物安全柜中，取下所有培养皿盖，轻轻旋转溶液使其覆盖皿底，然后吸除溶液。
5. 用紫外光（UV）照射1小时进行灭菌。重新盖上皿盖，叠放培养皿并用铝箔包裹。
6. 将包被好的培养皿在4 °C保存3–6个月；在用于细胞培养前，需在紫外灯下重新灭菌15–30分钟。
7. 在获取HNE样本前24小时，对一个预包被的培养皿进行灭菌，并标记为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）及日期。
8. 用移液管加入扩增培养基，覆盖培养皿表面（约5 mL）。
9. 在37 °C水浴中解冻一支含2 × 10⁶个辐照处理的MEF细胞的冻存管。细胞一旦解冻，立即用1 mL移液器将半管（约10⁶个细胞）加入培养皿中，并手动轻轻旋转以分散细胞。
10. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜，为HNE培养做准备。
    注意：如有需要，步骤3.7–3.10最晚可在细胞接种前60分钟进行，但过夜孵育为最佳方案。

4. 获取并处理 HNE 样本

1. 确保已获得所有受试者的机构审查委员会（IRB）批准的知情同意或同意书。
2. 让患者擤鼻，清除松散的黏液。
3. 使用鼻镜观察下鼻甲，确保无可能妨碍采样的病变或息肉存在。
4. 通过刮取或刷取方式从第一个鼻孔采集鼻腔细胞。
   1. 刮取法：在刮匙中点处弯曲，使其形成一个约135^°的轻微角度，刮匙杯端朝向远离顶端方向。将刮匙插入鼻孔，并将刮匙杯置于下鼻甲下方。轻轻将刮匙杯压向下鼻甲，并向前拉动刮匙进行刮取，共重复3-4次。
   2. 刷取法：将细胞学刷通过下鼻甲下方，然后在不退出鼻孔的情况下，轻微旋转并前后移动刷子4-5次。
5. 将刮匙或刷子放入含有抗生素培养基的15 mL锥形管中。对另一侧鼻孔重复步骤4.3-4.4，将同一根刮匙或刷子放入同一个锥形管中。
6. 将锥形管置于冰上保存，直至准备处理。确保在样本采集后4小时内进行处理，但必要时最晚可在采集后24小时内处理。

5. 在培养皿中处理并扩增 HNE 细胞

注意：所有步骤均需在生物安全柜内的洁净条件下进行。

1. 使用1 mL移液器和样本锥形管中的培养基，将所有细胞从刮匙/细胞学刷上冲洗至同一锥形管中。冲洗干净后，弃去刮匙/细胞学刷。
2. 在4 °C条件下，以360 × g离心5分钟。
3. 吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
4. 用3 mL细胞解离液重悬细胞沉淀，使用1 mL枪头吹打混匀，使混合物均质化。
5. 在4 °C条件下，以360 × g离心5分钟。
6. 重复步骤5.3–5.5一次。
7. 吸除剩余上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
8. 用1 mL抗生素培养基重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
9. 使用1 mL移液器，将细胞逐滴接种到步骤3.10中已包被且接种了成纤维细胞的培养皿上。加入足量抗生素培养基以完全覆盖培养皿表面，并使细胞均匀分散。标记培养皿内容物及日期，置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
10. 48小时后，确认细胞已贴壁。吸除旧培养基，更换为足量新鲜抗生素培养基以覆盖培养皿。
11. 每周更换培养基三次，使用真空泵和巴斯德移液器吸除旧培养基，并加入足量新鲜培养基覆盖培养皿。在抗生素培养基中培养5天后，更换为扩增培养基，并继续每周更换三次。
    注意：培养第一周污染风险较高。建议将新鲜样本置于独立的培养箱中，以最大限度降低交叉污染风险。
12. 每周多次观察细胞生长情况。当细胞融合度达到约70–80%时，进行传代操作。

6. 传代 HNE 细胞

1. 在乙二胺四乙酸（EDTA）中配制0.1%胰蛋白酶溶液。
   注意：胰蛋白酶对皮肤、呼吸道和眼睛具有刺激性，操作时需谨慎。
   1. 称取15 mg猪胰蛋白酶于锥形管中。
   2. 在另一个锥形管中称取 56 mg EDTA。
   3. 在生物安全柜中，将胰蛋白酶和EDTA转移至已灭菌的250 mL玻璃瓶中。使用少量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胰蛋白酶/EDTA管，以确保完全转移。
   4. 加入无菌 PBS 至终体积为 150 mL，盖紧盖子。
   5. 将胰蛋白酶溶液置于37 °C水浴中孵育，直至完全溶解。每15分钟检查一次，一旦溶解立即取出。
      注意：请勿长时间不检查例如， 过夜），因为溶液中的胰蛋白酶若加热时间过长会发生变性。
   6. 用70%乙醇喷洒2-3次清洁瓶子，然后放回生物安全柜。
   7. 使用制造商提供的说明，将0.1%胰蛋白酶-EDTA溶液经0.22 µm聚醚砜（PES）滤器过滤至一个洁净无菌的250 mL滤瓶中，并标注内容物和日期。
   8. 将胰蛋白酶-EDTA 溶液在 4 °C 保存，最长一个月，若出现浑浊则弃用。
2. 将分化培养基、0.1% 胰蛋白酶-EDTA 溶液和无菌 PBS 在 30 分钟内恢复至室温。用 70% 乙醇清洁后转移至洁净的生物安全柜中。
3. 在生物安全柜中，使用真空泵和巴斯德吸管吸取并弃去组织培养皿中的培养基。用干净的血清移液管加入5 mL PBS，轻轻晃动培养皿后吸取，完成洗涤步骤。
4. 使用5 mL血清移液管，向组织培养皿中加入5 mL 0.1%胰蛋白酶-EDTA溶液，然后将培养皿放回37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 5 分钟。
5. 在倒置显微镜下以4-10倍物镜观察细胞。检查细胞是否已从培养皿脱离、变圆并悬浮。轻敲培养皿侧壁以促进细胞脱落，和/或再孵育5分钟，直至大部分细胞脱离。
   注意：细胞一旦从培养皿上脱落，应迅速移除；长时间暴露于0.1%胰蛋白酶-EDTA会降低细胞活力。
6. 使用10 mL血清移液管，向培养皿中加入5 mL扩增培养基，收集全部液体内容物（共10 mL），转移至已标记的无菌50 mL锥形管中。
7. 如果细胞仍然贴附在培养皿上，重复步骤6.4至6.6最多两次，将收集物置于同一锥形管中。
   1. 如果细胞在经过三轮胰蛋白酶溶液处理后仍贴壁于培养皿上，可使用无菌细胞刮棒轻轻刮下剩余细胞。刮取后，用5 mL扩增培养基冲洗刮棒和培养皿，并将冲洗液收集至同一已标记的锥形管中。
      注意：若需传代为球状体，应修改本操作步骤以进行差异性胰蛋白酶消化。加入胰蛋白酶溶液后（步骤6.4），需频繁观察培养皿，直至成纤维细胞脱落（通常为1–2分钟），仅剩多边形上皮细胞仍贴壁。收集并保留此上清液，可用于后续扩增培养。使用相同的胰蛋白酶溶液重复步骤6.4–6.6，仅收集剩余的上皮细胞用于球状体培养。
8. 将锥形管在 360 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
9. 用1 mL扩增培养基重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板进行细胞计数。
10. 定量后，可根据需要对细胞进行分瓶处理，随后传代至新的培养皿中（包括成纤维细胞共培养的制备，步骤3，以及细胞扩增的接种，步骤5.9-5.12），或作为球形体进行培养（步骤7）。
    注意：若将细胞传代至新的培养皿中进行扩增，接种密度应为 0.5–1 × 10⁶ 建议使用P100培养皿中的细胞。

7. HNE 类球体培养的细胞接种

注意：除离心步骤外，本步骤中的所有操作均须在洁净的生物安全柜中进行。

1. 根据制造商说明，将基底膜基质在冰上解冻（每个类球体孔使用 100 µL）。
   注意：建议在收到基底膜基质后，立即无菌分装成每管 500 µL 的小份；此用量可接种一个 4 孔板。
2. 从第 6.9 步中分离适量经不同胰蛋白酶消化并传代的细胞，使其在基质中的终浓度为每毫升 500,000 个细胞。对于一个 4 孔板，使用 200,000 个细胞，并收集至 1.5 mL 离心管中。
3. 将细胞与培养基混合物在 4 °C 条件下以 360 × g 离心 5 分钟。使用 1 mL 移液枪小心且彻底地吸除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
4. 使用 1 mL 移液枪头，向含有细胞的 1.5 mL 离心管中加入每预定孔 100 µL 的基底膜基质。保持离心管置于冰上。
5. 反复吹打以小心且充分地将细胞在基底膜基质中重悬。操作应迅速，以避免基质凝固。吹打时避免将移液枪头完全排空，以防在细胞/基质混合物中引入气泡。
6. 将 100 µL 基质分装液接种至 4 孔体外受精（IVF）培养板的每一孔中。
   1. 使用干净的剪刀，剪去 200 µL 移液枪头末端 3–4 mm。
   2. 使用剪短后的枪头，小心地将 100 µL 细胞/基质混合物移至每个孔的中央。移液时应缓慢操作，目标是在每个孔中央形成一个单独的基质"液滴"。液滴应保持球形，且不接触孔壁。移动培养板时应小心，避免扰动这些液滴。
   3. 将基底膜基质液滴置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟，直至完全凝固。
   4. 小心地向每个孔中加入 500 µL 分化培养基，注意不要扰动基质液滴。确保培养基刚好覆盖液滴，必要时可补充更多培养基。

8. 分化和成熟 HNE 类球体

1. 使用 1 mL 移液枪头，轻柔地吸出孔内所有培养基；避免吸到基质，否则会破坏该区域基质中的类球体，但残留的类球体可能仍保持活性。
2. 使用新的 1 mL 移液枪头，围绕基质在孔中轻柔加入 500 µL 分化培养基。切勿触碰基质，避免扰动基质液滴。
3. 将类球体放回 37 ^oC、5% CO₂ 的培养箱中继续培养。每周重复步骤 8.1 至 8.3 三次。
4. 每天在 20X 倒置显微镜下观察类球体形态。类球体通常在接种后 3–5 天内形成，并在约 10 天内达到成熟。

9. 分析用HNE类球体的预处理、刺激及成像

1. 根据先前所述方法，在成像前对类球体进行所需的预处理³⁰.
   注意：对于VX809预处理，在成像前48–72小时向培养基中加入3 µM VX809。将1 µL的10 mM VX809储备液（参见 材料表) 在 3.3 mL 培养基中配制该浓度。
2. 将每个孔中的类球体更换为1 mL新鲜分化培养基，并在成像前进行预处理（步骤8.1–8.3）。
3. 现配制新鲜的刺激药物溶液（Forskolin、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 [IBMX]、VX770 和 CFTR 抑制剂 172 [Inh172]），从储备液开始配制（参见 材料表）。对于佛司可林/forskolin 和 IBMX，取每种储备液各 1 µL，加入同一支已标记的 1.5 mL 离心管中的 98 µL 无菌水中。对于 VX770 和 Inh172，分别取每种储备液 1 µL，加入两支单独标记的 1.5 mL 离心管中的 99 µL 无菌水中。配制总体积应足以每孔检测提供 50 µL 溶液。在生物安全柜内以无菌条件配制溶液。
4. 将球体培养板转移至设定为 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中₂，置于配备电子图像采集软件和用于XY方向调节的机械载物台的倒置显微镜上。打开显微镜、相机以及成像计算机。
5. 拍摄一个孔中类球体的基线图像。
   1. 打开图像采集软件（以下以 Slidebook 5.5 为例）。初始化后，通过点击新建文件 "文件"，然后 "新方法"相应地命名文件并单击 "保存".
   2. 小心取下培养皿盖，将一滴基质液置于物镜正上方中央。
   3. 从基质滴的顶部开始，使用显微镜目镜在20倍放大下以网格状移动寻找类球体。上下调节焦距，以捕获类球体最宽处的清晰图像。在基质滴示意图上标注每个类球体的位置，以便成像后重新识别。
   4. 在软件中，单击 "图像采集"曝光设置，选择 "手动" 并输入 50 ms。确保其他设置合适（Bin Factor：1x1，W：512，H：512，X 和 Y 偏移：0）。为每幅图像输入适当的名称 "名称" 盒例如， 球状体1 基线）。点击 "开始" 以查看实时图像， "保存" 以获取基线图像。
   5. 重复步骤 9.5.1–9.5.4，直至达到目标数量或完成整个基质液滴的成像。
      注意：每种条件下仅需3-5个类球体即可检测出组间差异，但为了提高统计效能，我们通常对每种条件下10个或更多的类球体进行成像。该检测方法的变异性在下文中有所体现。 图2 的 "代表性结果" 以每名受试者8-10个类球体样本为例进行切片。
6. 刺激类球体。
   1. 使用200 µL移液器，向孔内的培养基中加入50 µL相应的刺激药物，注意不要扰动基质。
      注意：经过10倍稀释后（将50 µL加入500 µL培养基中），药物的终浓度为：forskolin 10 µM，IBMX 100 µM，VX770 1 µM，Inh172 10 µM。
   2. 仅针对cAMP实验，只加入forskolin/IBMX。
   3. 对于cAMP + VX770，先加入forskolin/IBMX，2分钟后加入VX770。
   4. 对于抑制条件，先加入 Inh172，2 分钟后再加入 forskolin/IBMX。
7. 刺激后立即通过延时成像监测类球体肿胀情况，持续1小时。在软件中点击 "图像采集". 点击 "延时摄影"，将间隔设为30秒，持续时间为60分钟。输入适当的名称，然后点击 "保存" 开始延时拍摄。
   注意：标准延时成像为每30秒采集一次单个球状体的图像，以确保获得高质量视频。或者，可对整个孔进行较低倍率的成像采集例如， 4倍），并根据需要减少采集的图像数量。如果使用自动载物台，则利用预设坐标对所有类球体进行延时成像；否则，对部分类球体进行延时成像，以定性评估肿胀情况，并确保成像过程中未出现系统性问题（例如， 孔板中基质的脱离
8. 在完成1小时延时成像后，立即使用步骤9.5.3中创建的地图，采集所有类球体的刺激后图像（按步骤9.5）。
   1. 参考刺激前的图像，确保后续图像使用相同的焦平面（周围细胞、球状体或碎片的焦质量对此过程具有重要帮助）。
   2. 保存步骤 9.5.4 中配对的注释文件（例如， 类球体1 刺激后
      注意：延时成像结束后应立即完成此步骤，因为球状体可能持续膨胀。
9. 更换成像孔中的培养基为新鲜的分化培养基。
10. 针对每个孔/条件重复步骤 9.5 至 9.9，根据实验条件的要求调整刺激药物。
11. 所有成像完成后，将类球体放回37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养。₂.
    注意：根据培养用显微镜腔室的无菌程度，类球体在刺激后的污染可能较为常见。可将已成像的类球体置于单独的培养箱中，以尽量降低交叉污染风险，或在成像后立即弃置类球体。

10. 分析 HNE 类球体图像

1. 将所有捕获的图像导出为与图像分析软件兼容的格式。在软件中，点击 "查看"，将鼠标悬停于 "导出"，并选择 "所有图像的默认视图格式为TIFF..."保存至硬盘或闪存盘以进行分析。
   注意：一种商业分析软件（材料表）和 .tiff 文件格式效果良好，本文所述方法基于此，尽管也可使用其他平台进行分析。在命名文件时，负责图像分析的人员应对实验条件设盲，但需知晓哪些图像是成对的（刺激前与刺激后），以确保分析的一致性。
2. 使用分析软件勾画每个球状体图像的管腔区域，并导出至数据分析软件。
   1. 打开分析软件。点击 "文件"，然后 "打开" 并导航至包含球状体图像的文件夹。选择所有图像进行分析，然后单击 "打开".
   2. 点击 "测量" 并选择 "区域测量"在“区域测量”对话框中，选择下拉选项卡 "配置" 并确保 "图像名称" 和 "面积" 方框已勾选。
   3. 点击 " 日志" 并选择 "开放数据日志". 点击 "好的" 在“数据记录”对话框中，相应地命名文件（例如，条件X，日期）。这将把所有测量数据传输到电子表格中。
   4. 选择 " 示踪区域" 工具按钮，并在第一张图像中仔细描记球状体的管腔以进行分析。在区域测量对话框中，点击 " 记录数据" 将测量数据记录到 Excel 中。
   5. 重复步骤 10.2.2–10.2.4，直至所有球状体均被分析完毕。
3. 计算每个球状体图像对在刺激后相对于基线的管腔面积变化百分比（100 × [刺激后 - 基线] ÷ 基线），并整理数据以供分析。

结果

HNE细胞应在接种后72小时内贴附于培养皿并形成小的细胞岛；培养一周后良好和不良细胞岛形成的示例分别见图1A和1B。这些细胞岛应在15至30天内逐渐扩展并覆盖整个培养皿。较小或质量不佳的样本可能需要更长时间，且通常无法形成可用的类球体。若培养基呈现深黄色或浑浊、细胞无法贴附于培养皿，和/或直接观察到真菌/细菌，提示存在病原微生物污染。任何受污染的培养物应立即丢弃，以防止交叉污染。

在培养基质膜基质中的前3-4天内，基质中应开始形成微小的囊状结构。这些结构将在大约10天内发育成熟，成为具有薄壁和腔面的完整球状体。若以所述密度接种，成功的培养物每滴基质中应含有50-100个球状体。腔内可相对清晰（图1C），或充满细胞碎片和黏液（图1D）；前者多见...

讨论

本方案描述了患者来源的鼻腔细胞球状培养物的建立方法，该培养物可用于构建个体化、特异性的CFTR功能模型。该过程包含若干关键步骤，需密切注意以避免操作困难。首先是获取高质量的患者鼻腔样本。理想的样本应具备 >50,000 个细胞，黏液或碎片较少，并且在 4 小时内可进行处理（尽管在冰上过夜运输也容易成功）。研究团队需经过使用刮匙或刷子采集样本的操作培训，建议初期由一至两名操作者集中完成样本采集，以提高其熟练程度。其次，所有组织培养步骤中必须严格遵守无菌操作技术。根据我们的经验，人鼻上皮（HNE）培养失败的主要原因是细菌或真菌污染，这可能会影响原始样本以及其他在培养箱中正在生长的培养物。对于患有慢性感染的受试者，其样本培养的污染风险更高例如，CF），因此成功在很大程度上取决于保持培养物清洁和分离的能力。我们的做法是在最初的5-7天内使用单独的培养箱专门培养易受感染的细胞，以保护较老且已建立成功的培养物免受意外污染。第三，在细胞扩增阶段需密切观察细胞，避免过度汇合。若细胞在培养板上达到完全汇合，培养物可能进入衰老状态，或细胞开始死亡并脱落。最后，在以类球体形式接种细胞时，必须将细胞充分分散于基质中，并接种分布均匀的样品...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf 管	USA Scientific	4036-3204
150 mL 滤瓶	Midsci	TP99150	用于过滤培养基
15 mL 锥形管	Midsci	TP91015
1 L 滤瓶	Midsci	TP99950	用于过滤培养基
35 mm 玻底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0-20-C	可选
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）	Fisher Scientific	AC228420010	用 1 mL DMSO 溶解 22.0 mg 配制 100 mM 储存液
50 mL 锥形管	Midsci	TP91050
Accutase	Innovative Cell Technologies, Inc.	AT-104	细胞解离溶液
腺嘌呤	Sigma-Aldrich	A2786-25G	参见表 1
两性霉素 B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	参见表 1
牛脑提取物（9 mg/mL）	Lonza	CC-4098	参见表 2
头孢他啶水合物	Sigma-Aldrich	C3809-1G	参见表 1
细胞刮刀 20 cm	Midsci	TP99010
CFTR Inh172	Tocris Bioscience	3430	用 1 mL DMSO 溶解 4.0 mg 配制 10 mM 储存液
霍乱毒素 B（来自霍乱弧菌）	Sigma-Aldrich	C8052-.5MG	参见表 1
CYB-1	Medical Packaging Corporation	CYB-1	细胞刷
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D5879-500ML
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F12 Hepes	Life Technologies	11330-057	基础培养基；参见表 1 和表 2
表皮生长因子（重组人蛋白，无动物源成分）	Thermo Fisher Scientific	PHG6045	参见表 1
肾上腺素	Sigma-Aldrich	E4250-1G	参见表 2
乙醇	Fisher Scientific	2701
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E0135-500ML	16.6 mM 溶液；参见表 2
乙二胺四乙酸（EDTA）	TCI America	E0084
胎牛血清（高性能 FBS）	Invitrogen	10082147	参见表 1
福斯科林（Forskolin）	Sigma-Aldrich	F6886-50	用 1 mL DMSO 溶解 4.1 mg 配制 10 mM 储存液
生长因子减少型 Matrigel	Corning, Inc.	356231	Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无酚红，无LDEV，10 mL
血细胞计数板	Hausser Scientific	1483
人胶原蛋白溶液 I 型（VitroCol；3 mg/mL）	Advanced BioMatrix	5007-A	胶原溶液
HyClone（又称 FetalClone II）	GE Healthcare	SH30066.03HI	参见表 2
氢化可的松	StemCell Technologies	07904	参见表 1 和表 2
胰岛素，人重组，锌溶液	Life Technologies	12585014	4 mg/mL 溶液；参见表 2
IVF 4 孔板，未处理	NUNC（通过 Fisher Scientific）	12566350	用于类球体培养的 4 孔板；孔大小与 24 孔板相似
MEF-CF1-IRR	Globalstem	GSC-6001G	经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞
Metamorph 7.7	Molecular Devices		分析软件；https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software 获取报价
Olympus IX51 倒置显微镜	Olympus Corporation	已停产	成像显微镜。替代型号：Olympus IX53，https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  获取报价
青霉素-链霉素（Pen Strep）	Life Technologies	15140122	参见表 2
磷酸乙醇胺	Sigma-Aldrich	P0503-5G	参见表 2
视黄酸	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	参见表 2
Rhinoprobe	Arlington Scientific, Inc.	96-0905	鼻腔刮匙
Slidebook 5.5	3i, Intelligent Imaging Innovations	已停产	成像软件。替代型号：Slidebook 6，https://www.intelligent-imaging.com/slidebook 获取报价
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	20012050
无菌水	Sigma-Aldrich	W3500-6X500ML
组织培养皿 100	Techno Plastic Products	93100	用于细胞扩增的组织培养皿
妥布霉素	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	参见表 1
转铁蛋白（人转铁蛋白 0.5 mL）	Lonza	CC-4205	参见表 2
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T6397-1G	3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐  [T3]；参见表 2
猪胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T4799-10G
Ultroser-G	Crescent Chemical（通过 Fisher Scientific）	NC0393024	20 mL 冻干粉末；参见表 2
万古霉素盐酸盐（来自东方链霉菌）	Sigma-Aldrich	V2002-5G	参见表 1
VX770	Selleck Chemicals	S1144	用 1 mL DMSO 溶解 0.4 mg 配制 1 mM 储存液
VX809	Selleck Chemicals	S1565	购买或用 1 mL DMSO 溶解 4.5 mg 配制 10 mM 储存液
Y-27632 二盐酸盐  ROCK 抑制剂	Enzo LifeSciences	ALX-270-333-M025	参见表 1