此处我们采用二维半变性琼脂糖凝胶电泳来确认存在大小不均一的类淀粉样纤维，并排除纤维在凝胶电泳过程中发生解离而导致大小异质性的可能性。
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本文内容
摘要
摘要
淀粉样或类淀粉样纤维已与多种人类疾病相关联，目前也被发现对许多信号通路具有重要作用。在不同实验条件下便捷地检测这些纤维的形成，对于理解其潜在功能至关重要。已有多种方法用于检测此类纤维，但均存在某些局限性。例如，电子显微镜（EM）或刚果红、硫黄素T染色通常需要对纤维进行纯化。相比之下，半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）可在无需纯化的条件下直接检测细胞裂解物中耐SDS的类淀粉样纤维。此外，该方法可用于比较纤维的大小差异。更重要的是，可通过蛋白质印迹（Western blotting）鉴定纤维中特定的蛋白质。该技术耗时较短，且更易于被更多实验室采用。SDD-AGE结果常显示出不同程度的异质性，这引发了一个问题：这种异质性是否部分源于SDS存在下电泳过程中蛋白复合物的解离？基于此，我们引入了二维SDD-AGE方法，以确定SDD-AGE中观察到的大小异质性是否真实反映了纤维本身的异质性。 体内 而非电泳过程中某些蛋白质发生降解或解离所致。该方法可快速进行定性验证，确认淀粉样或类淀粉样纤维在SDD-AGE过程中未发生部分解离。
引言
由于蛋白质错误折叠导致淀粉样纤维的形成，长期以来已知在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等病理状态中起重要作用1。最近研究表明，淀粉样或类淀粉样纤维的形成也参与了人类的信号传导通路，包括抗病毒天然免疫反应2以及坏死性凋亡3,4，并在酵母等低等生物中同样存在5,6。因此，在实验室中检测这些纤维的能力至关重要。目前，检测淀粉样及类淀粉样纤维主要有三种方法：染料染色法、电子显微镜（EM）以及SDD-AGE。
使用染料（如刚果红或硫黄素T）的优势在于能够通过显微镜或光谱法快速且易于检测7。然而，在刚果红的情况下，显微镜检测无法提供关于纤维由哪些蛋白质组成或纤维尺寸的具体信息。同样，利用光谱法检测刚果红或硫黄素T与蛋白质复合物的结合，仅能给出阳性或阴性结果。
透射电子显微镜（EM）可提供纤维存在的确凿证据，并能获得关于纤维长度和直径的定量信息8。然而，该方法需要极为严格的纯化步骤。此外，EM 是一种专业性较强的技术，需使用昂贵的设备。
SDD-AGE 已被用于检测耐 SDS 的兆道尔顿级蛋白质复合物，包括淀粉样或类淀粉样纤维。该方法具有多种优势。首先，它无需对纤维进行纯化，操作简便9。其次，它可提供关于纤维大小的定性信息，包括相对大小以及纤维异质性的程度。最后，由于电泳后可进行蛋白质印迹（Western blotting），因此只要存在相应抗体，就很容易检测任何目标蛋白；但需要注意的是，由于 SDD-AGE 属于半变性条件，某些表位可能仍处于隐蔽状态，从而增加抗体检测的难度。
近期研究表明，受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和3（RIPK3）可形成淀粉样纤维，作为坏死性凋亡（necroptosis）——一种程序性坏死——过程中的信号传导平台3。在研究这些纤维的过程中，本实验室发现另一种与坏死性凋亡相关的蛋白——混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like, MLKL）——也能形成类淀粉样纤维4。然而，通过SDD-AGE检测发现，MLKL纤维的大小与RIPK1和RIPK3纤维明显不同，而RIPK1与RIPK3纤维的大小则彼此一致（图1）。这一结果出乎意料，因为已知MLKL会结合RIPK1/RIPK3，共同形成称为坏死体（necrosome）的坏死性凋亡信号复合物10。
至少存在两种解释。第一，在坏死性凋亡过程中可能形成两种完全不同的类淀粉样纤维，一种含有RIPK1/RIPK3，另一种含有MLKL。第二，在坏死性凋亡过程中可能仅形成一种含有RIPK1/RIPK3/MLKL的类淀粉样纤维，但MLKL与其他蛋白的结合较弱，因而在SDD-AGE过程中发生解离。
为解决这一问题，我们建议进行二维（2D）SDD-AGE实验。在第一维和第二维电泳过程中，SDD-AGE稳定的淀粉样或类淀粉样纤维将表现出相同的迁移模式。在将蛋白质转移至膜上并进行蛋白质印迹（Western blot）后，可检测到该模式。稳定的纤维将呈现出清晰的对角线条带。若出现偏离此模式的情况，则表明纤维在SDS-电泳过程中发生了改变。
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方案
1. 准备样品
- 在含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的10 mL杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于10 cm组织培养皿中培养2 × 106个产生淀粉样蛋白的HT-29结肠癌细胞。将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中培养过夜。
- 待细胞生长至80%融合度后，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入3 mL胰蛋白酶溶液，在37 °C下孵育3分钟。
- 待细胞完全从培养皿上解离后，加入10 mL培养基，用10 mL移液管将细胞转移至15 mL锥形管中。在室温下以1,000 × g离心3分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 mL培养基中，并使用细胞计数器进行计数。将2 × 106个细胞接种至两个10 cm培养皿中，每皿各一。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中贴壁并恢复过夜。对其中一个培养皿施加处理，以诱导淀粉样纤维形成：加入20 ng/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、100 nM Smac类似物及20 µM泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK11。该组合简称为TSZ。另一培养皿则以溶剂处理作为对照。
- 经过适当时间（通常为6小时）后，收集细胞裂解液。
- 用塑料刮刀将细胞从培养皿上刮下，并用10 mL移液管转移至15 mL锥形管中。在4 °C下以1,000 × g离心3分钟。
- 用10 mL预冷的PBS重悬细胞，洗涤两次，每次在4 °C下以1,000 × g离心3分钟。吸除PBS溶液。
注意：此处可暂停操作，将细胞沉淀用液氮速冻后于˗80 °C保存，最长可保存1个月。 - 将细胞沉淀转移至1.5 mL微量离心管中，加入0.3 mL裂解缓冲液，冰上孵育30分钟。在4 °C下以20,000 × g离心15分钟。上清液即为全细胞裂解液。
注意：此处可暂停操作，将样品于-20 °C保存数月。 - 根据制造商说明书，采用Bradford法测定蛋白浓度。加入4× SDD-AGE上样缓冲液，配制20 µL含3 µg/µL蛋白的样品，并在室温下孵育10分钟。
2. 准备并运行凝胶
- 加入2 g琼脂糖至200 mL 1x 在玻璃烧杯中加入Tris-乙酸盐缓冲液（TAE），微波加热以溶解琼脂糖。加入1 mL 20% SDS，使终浓度为0.1% SDS。轻轻旋转混匀，注意在加入SDS后避免产生气泡。
- 将琼脂糖溶液倒入15 cm × 14 厘米凝胶板。使用 1 mL 移液器排除所有气泡。在顶部插入一个 20 孔梳子。
- 第一维：用移液器吸取 60 µg 全细胞裂解液上样至最右侧泳道。以 60 V 电压电泳约 4 小时（直至染料前沿迁移至约 ¾ 使用含有0.1% SDS的TAE作为电泳缓冲液进行凝胶电泳。
- 第二维：小心地将凝胶旋转90° 逆时针方向 (图2A以 60 V 电压电泳约 4 小时。
注意：常规电泳条件为每厘米凝胶长度4伏特。第一维和第二维的电泳条件必须完全相同。
3. 转移
- 使用毛细管转移法将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（图2B）。
- 向一个约20 cm × 20 cm的容器中加入500 mL转移缓冲液。在容器旁边用纸巾叠放成一个5 cm高的堆，其顶部表面积必须大于凝胶的尺寸。
- 将一张14 cm × 15 cm的滤纸浸入转移缓冲液中，然后平铺在纸巾堆顶部，注意确保滤纸无皱褶或气泡。再用另一张滤纸重复此步骤。
- 将一张14 cm × 15 cm的PVDF膜在甲醇中活化30秒，然后将其覆于滤纸上，并用滚轮仔细滚压以去除所有气泡。用转移缓冲液冲洗凝胶后，将其覆于膜上，再次用滚轮排除气泡。
- 用塑料膜覆盖靠近转移缓冲液容器一侧的纸巾边缘。注意下一步中构建的滤纸桥不得与纸巾堆直接接触。
- 取一张15 cm × 35 cm的滤纸浸入转移缓冲液中，将其一端覆盖在凝胶顶部，另一端浸入转移缓冲液容器中。再用另一张滤纸桥重复此步骤。
- 用塑料膜覆盖容器，于室温下静置过夜。
4. 蛋白质印迹检测
- 在20 cm × 20 cm的容器中，用50 mL含0.05% Tween-20的PBS（PBST）冲洗膜。加入20 mL含5%脱脂牛奶的PBST，室温摇动孵育30 min以封闭。
- 将10 µL兔抗MLKL抗体加入20 mL含5%脱脂牛奶的PBST中，混匀后加入容器中，4 °C摇床上孵育过夜。
- 用20 mL PBST洗涤膜5 min，重复5次。
- 将4 µL抗兔-HRP加入20 mL含5%脱脂牛奶的PBST中，混匀后加入容器中，室温摇床上孵育2 h。
- 用20 mL PBST洗涤膜5 min，重复5次。
- 加入增强型化学发光底物（ECL），按照生产商的说明书操作，曝光至X射线胶片。
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结果
诱导坏死性凋亡后，RIPK1 和 RIPK3 显示出几乎相同的类淀粉样模式（第 2 和第 4 泳道，图 1）。然而，MLKL 纤维更为异质，且似乎比 RIPK1/RIPK3 纤维更小（第 6 泳道，图 1）。这促使我们开发了二维 SDD-AGE 方法，以探究 MLKL 是形成了独立于 RIPK1/RIPK3 的纤维，还是在 SDD-AGE 过程中从大型 RIPK1/RIPK3/MLKL 纤维上解离下来。
电泳和转膜步骤的总体示意图见图2。在第一维SDD-AGE中，淀粉样或类淀粉样纤维会呈现出特征性的弥散条带，如图3A所示。进行第二维SDD-AGE时，可能出现两种结果。如果在凝胶电泳过程中纤维...
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讨论
二维 SDD-AGE 最关键的方面在于第一维和第二维的电泳条件必须完全相同。能否检测到一条清晰的 45° 对角线（表明未发生解离或降解）取决于纤维在两次电泳中的迁移行为是否一致。若使用不同的条件，例如改变电压或运行时间长度，将导致结果模糊不清。此外，与传统的 1D SDD-AGE 一样，应避免对样品进行煮沸，因为这会破坏淀粉样蛋白及类淀粉样纤维。与所有转膜操作一样，需注意避免滤纸、膜和凝胶各层之间产生气泡。最后，在转膜步骤中，必须确保桥接部分不发生下垂并直接接触纸巾堆。一种可靠的预防方法是使用一小块塑料膜覆盖纸巾堆的边缘。
本方案中提供的电泳条件（60 V，4 小时）可以进行调整。例如，在本方案中，琼脂糖凝胶的尺寸为 14 cm × 15 cm。如果使用较小的凝胶，则电压（4 V/cm 凝胶长度）和电泳时间应相应成比例地调整。在制备凝胶时，可通过使用两个梳子同时分析两个样品。样品应加样至每个梳子对应的最右侧加样孔中。在此情况下，电泳时间应再次缩短，以避免上方样品泳动至凝胶的下半部分。如果根据凝胶的一个维度调整了时间，则必须相应地调整另一个维度的参数，以保持匹配。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心（NIH/NCATS）为 S.H.-A. 提供的博士后奖学金（TL1TR001104）、威尔奇基金会资助（I-1827）以及美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）向 Z.W. 提供的 R01 项目资助（RGM120502A）的支持。Z.W. 是弗吉尼亚·默乔森·林赛姆医学研究学者、癌症预防与研究德克萨斯研究所学者（R1222）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 凝胶电泳装置 | Fisher | HE99XPRO | 用于凝胶电泳的装置。 |
| 琼脂糖 | VWR | 97062-250 | 用于琼脂糖凝胶。 |
| 纸塔 | Fisher | 19-120-2484 | 用于转移 |
| 滤纸 | VWR | 21427-386 | 用于转移 |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 162-0177 | 用于转移 |
| 封闭用脱脂奶粉 | 伯乐（Bio-Rad） | 1706404XTU | 用于 Western 印迹中的封闭 |
| MLKL抗体 | Genetex | GTX107538 | 兔抗MLKL抗体 |
| RIPK1 抗体 | BD Biosciences | 610459 | 小鼠抗RIPK1抗体 |
| RIPK3 抗体 | Xiaodong Wang 博士惠赠 | 兔抗 RIPK3。参见文献11。 | |
| 抗兔-HRP | Sigma | A6154 | 二抗 |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western化学发光HRP底物 |
| X射线胶片 | Fisher | F-BX810 | 用于 Western blot 结果 |
| DMEM | Sigma | D6429 | 用于细胞培养 |
| 胎牛血清 | 西格玛 | F4135 | 用于细胞培养 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | 用于细胞培养 |
| 胰蛋白酶溶液 | Sigma | T4049 | 用于细胞培养 |
| 组织培养用 PBS | Sigma | D8662 | 用于细胞培养 |
| 重组 TNF | 在本实验室制备 | 用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献11。 | |
| smac-模拟物 | 王小东博士惠赠 | 用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献11。 | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | 用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献11。 |
| 细胞计数器 | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20；用于细胞计数 |
| Pierce™ BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | 用于测定细胞裂解液中的蛋白质浓度 |
| 细胞刮刀 | Fisher | 07-200-364 | 从培养皿中收集细胞 |
| 裂解缓冲液（1 L） | 20 mL 1 M Tris（pH 7.4） 10 mL 甘油 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH₂O2O 10 mL Triton-X100 （根据需要添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂） | ||
| 10X TAE（1 L） | 48.4 g Tris 碱 11.42 mL 冰醋酸 20 mL 0.5 M EDTA pH 8 ddH20 到 1 升 | ||
| 4X SDD-AGE上样缓冲液（50 mL） | 5 mL 10×TAE 10 mL 甘油 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% 溴酚蓝 31 mL ddH₂O2O | ||
| TBS 转膜缓冲液（1 L） | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH₂O2O | ||
| PBST 洗涤缓冲液（1 L） | 100 mL 10×PBS 800 mL ddH₂O2O 1 mL Tween20 | ||
| 10倍浓度 PBS（10 L） | 800 g 氯化钠 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 加入ddH₂O20 到 10 L |
参考文献
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Methods in Enzymology. 412, Academic Press. 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
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