利用二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳验证淀粉样或类淀粉样纤维的大小异质性

摘要

此处我们采用二维半变性琼脂糖凝胶电泳来确认存在大小不均一的类淀粉样纤维，并排除纤维在凝胶电泳过程中发生解离而导致大小异质性的可能性。

摘要

淀粉样或类淀粉样纤维已与多种人类疾病相关联，目前也被发现对许多信号通路具有重要作用。在不同实验条件下便捷地检测这些纤维的形成，对于理解其潜在功能至关重要。已有多种方法用于检测此类纤维，但均存在某些局限性。例如，电子显微镜（EM）或刚果红、硫黄素T染色通常需要对纤维进行纯化。相比之下，半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）可在无需纯化的条件下直接检测细胞裂解物中耐SDS的类淀粉样纤维。此外，该方法可用于比较纤维的大小差异。更重要的是，可通过蛋白质印迹（Western blotting）鉴定纤维中特定的蛋白质。该技术耗时较短，且更易于被更多实验室采用。SDD-AGE结果常显示出不同程度的异质性，这引发了一个问题：这种异质性是否部分源于SDS存在下电泳过程中蛋白复合物的解离？基于此，我们引入了二维SDD-AGE方法，以确定SDD-AGE中观察到的大小异质性是否真实反映了纤维本身的异质性。 体内 而非电泳过程中某些蛋白质发生降解或解离所致。该方法可快速进行定性验证，确认淀粉样或类淀粉样纤维在SDD-AGE过程中未发生部分解离。

引言

由于蛋白质错误折叠导致淀粉样纤维的形成，长期以来已知在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等病理状态中起重要作用¹。最近研究表明，淀粉样或类淀粉样纤维的形成也参与了人类的信号传导通路，包括抗病毒天然免疫反应²以及坏死性凋亡^3,4，并在酵母等低等生物中同样存在^5,6。因此，在实验室中检测这些纤维的能力至关重要。目前，检测淀粉样及类淀粉样纤维主要有三种方法：染料染色法、电子显微镜（EM）以及SDD-AGE。

使用染料（如刚果红或硫黄素T）的优势在于能够通过显微镜或光谱法快速且易于检测⁷。然而，在刚果红的情况下，显微镜检测无法提供关于纤维由哪些蛋白质组成或纤维尺寸的具体信息。同样，利用光谱法检测刚果红或硫黄素T与蛋白质复合物的结合，仅能给出阳性或阴性结果。

透射电子显微镜（EM）可提供纤维存在的确凿证据，并能获得关于纤维长度和直径的定量信息⁸。然而，该方法需要极为严格的纯化步骤。此外，EM 是一种专业性较强的技....

方案

1. 准备样品

1. 在10 mL含有10%胎牛血清和青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于10 cm组织培养皿中培养2 × 10⁶个产生淀粉样蛋白的HT-29结肠癌细胞。将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养过夜。
   1. 待细胞生长至80%融合度后，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。加入3 mL胰蛋白酶溶液，在37 °C下孵育3分钟。
   2. 待细胞完全从培养皿上解离后，加入10 mL培养基，用10 mL移液管将细胞转移至15 mL圆锥形离心管中。在室温下以1,000 × g离心3分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 mL培养基中，并使用细胞计数仪计数细胞。将2 × 10⁶个细胞分别接种到两个10 cm培养皿中。
   3. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜，使其贴壁并恢复。对其中一个培养皿施加处理，以诱导淀粉样蛋白形成：加入20 ng/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、100 nM Smac模拟物和20 µM泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK¹¹。该组合简称为TSZ。另一培养皿则加入等量溶剂作为对照。
2. 经过适当时间（通常为6小时）后，收集细胞裂解液。
   1. 用塑料细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并用....

结果

诱导坏死性凋亡后，RIPK1 和 RIPK3 显示出几乎相同的类淀粉样模式（第 2 和第 4 泳道，图 1）。然而，MLKL 纤维更为异质，且似乎比 RIPK1/RIPK3 纤维更小（第 6 泳道，图 1）。这促使我们开发了二维 SDD-AGE 方法，以探究 MLKL 是形成了独立于 RIPK1/RIPK3 的纤维，还是在 SDD-AGE 过程中从大型的 RIPK1/RIPK3/MLKL 纤维上解离下来。

电泳与转膜流程的总体示意图见图2。在第一维SDD-AGE中，淀粉样或类淀粉样纤维会呈现出特征性的弥散条带，如图3A所示。进行第二维SDD-AGE时，可能出现两种结果。若在凝胶电泳过程中纤维.......

讨论

二维 SDD-AGE 最关键的方面在于第一维和第二维的电泳条件必须完全相同。能否检测到一条清晰的 45° 对角线（表明未发生解离或降解）取决于纤维在两次电泳中的迁移行为是否一致。若使用不同的条件，例如改变电压或运行时间长度，将导致结果模糊不清。此外，与传统的 1D SDD-AGE 一样，应避免对样品进行煮沸，因为这会破坏淀粉样蛋白及类淀粉样纤维。与所有转膜操作一样，需注意避免滤纸、膜和凝胶各层之间产生气泡。最后，在转膜步骤中，必须确保桥接部分不发生下垂并直接接触纸巾堆。一种可靠的预防方法是使用一小块塑料膜覆盖纸巾堆的边缘。

本方案中提供的电泳条件（60 V，4 小时）可以进行调整。例如，在本方案中，琼脂糖凝胶的尺寸为 14 cm × 15 cm。如果使用较小的凝胶，则电压（4 V/cm 凝胶长度）和电泳时间应相应成比例地调整。在制备凝胶时，可通过使用两个梳子同时分析两个样品。样品应加样至每个梳子对应的最右侧加样孔中。在此情况下，电泳时间应再次缩短，以避免上方样品泳动至凝胶的下半部分。如果根据凝胶的一个维度调整了时间，则必须相应地调整另一个维度的参数，以保持匹配。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
凝胶电泳装置	Fisher	HE99XPRO	适用于凝胶电泳。
agrose	VWR	97062-250	用于琼脂糖凝胶。
纸塔	Fisher	19-120-2484	用于转移
滤纸	VWR	21427-386	用于转移
PVDF 膜	Bio-Rad	162-0177	用于转移
封闭奶粉	Bio-Rad	1706404XTU	用于封闭蛋白质印迹
MLKL 抗体	Genetex	GTX107538	兔抗 MLKL 抗体
RIPK1	BD Biosciences 610459		小鼠抗RIPK1抗体 RIPK3
来自	王晓东		兔子抗RIPK3抗体礼物。参见参考 11。
抗兔 HRP	Sigma	A6154	二抗
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western 化学发光 HRP 底物
X 射线胶片	用于 Western 印迹结果	Fisher	F-BX810
DMEM	Sigma	D6429	用于细胞培养
胎牛血清	Sigma	F4135	用于细胞培养
青霉素-链霉素	用于	细胞培养	P4333
蛋白酶溶液	用于	细胞培养	T4049
用于组织培养的 PBS	细胞培养	Sigma	D8662
TNF	在我们实验室		，用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献 11。
Xiaodong Wang		smac-mimetic	，用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献 11。
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	用于诱导坏死性凋亡。参见参考文献 11。
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	型号 TC20;用于细胞计数
Pierce™BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225	用于测量细胞裂解物中的蛋白质浓度
细胞提升器	Fisher	07-200-364	从培养皿中取出细胞
裂解缓冲液 （1 L）			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL 甘油 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 （蛋白酶和磷酸盐抑制剂根据需要）
10X TAE （1 L）			48.4 g Tris 碱 11.42 mL 冰醋酸 20 mL 0.5M EDTA pH 值 8 ddH20 至 1 L
4X SDD-AGE 上样缓冲液 （50 mL）			5 mL 10X TAE 10 mL 甘油 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% 溴酚蓝 31 mL ddH2O
TBS 转印缓冲液 （1 L）			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST 洗涤缓冲液 （1 L）			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10XPBS （10 L）			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 克 KH2PO4 添加 ddH2O 至 10 L