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方法文章

通过基因靶向随机诱变筛选裂殖酵母中破坏异染色质稳定的蛋白酶体突变体

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DOI：

10.3791/57499

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2018年5月15日

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种在裂殖酵母中对目标基因进行随机突变的详细方法。以rpt4+基因为例，该基因编码19S蛋白酶体的一个亚基，我们筛选能够破坏异染色质稳定性的突变。

摘要

对目的基因进行随机突变是鉴定产生特定表型突变的常用方法。在可用于实现随机突变的方法中，易错PCR是一种便捷且高效的技术，可用于构建多样性丰富的突变体文库（即，一个突变文库）。当研究人员希望对特定预定义区域（如基因的编码区）进行突变，同时保持基因组其他区域不受影响时，易错PCR是首选方法。在通过易错PCR扩增突变文库后，必须将其克隆至合适的质粒中。易错PCR生成的文库规模受限于克隆步骤的效率。然而，在裂殖酵母中， 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），克隆步骤可用高效的一步融合PCR替代，以生成用于转化的构建体。随后可利用适当的报告基因筛选具有目标表型的突变体。本文以着丝粒异染色质处插入的报告基因为例，详细描述该策略。

引言

正向遗传学是一种经典方法，研究人员通过该方法寻找表现出特定表型的天然突变体，并进行遗传分析。在反向遗传学中，则是对目标基因引入突变，并观察其表型变化。在后一种情况下，通常采用对目标基因进行随机诱变的方法，以产生突变体库，随后根据特定表型（如温度敏感性或酶活性改变）筛选所需突变体。实现随机诱变的方法有多种，包括易错PCR1；紫外线照射2；化学诱变剂，如甲基磺酸乙酯（EMS）或亚硝酸3；使用临时的诱变菌株，例如过表达mutD5的菌株4；以及DNA改组技术5。

本文描述了一种反向遗传学策略，该策略利用易错PCR（error-prone PCR）在裂殖酵母中为目标基因构建突变体文库。顾名思义，该方法通过在PCR过程中有意引入错误来产生突变。与其他诱变方法不同，易错PCR允许使用者自定义需要诱变的区域，因此在研究特定蛋白或功能结构域的功能时尤为有用。

为了演示这种随机诱变方法，本文以编码19S蛋白酶体亚基的rpt4+基因为例。已有研究表明，Rpt4在裂殖酵母以外的生物中具有不依赖蛋白水解的功能6,7,8,9，而蛋白水解功能的缺陷可能通过改变蛋白质水平产生间接效应。因此，我们筛选能够引发不依赖蛋白水解变化的突变体，旨在研究蛋白酶体在异染色质中的功能。

通过调整引物的结合位置，易错PCR可应用于任意基因区域。利用合适的报告基因系统可鉴定出表现出目标表型变化的突变体。本研究中，我们采用了一种将ade6+报告基因插入着丝粒1区外重复（otr）区域的系统10。该区域可形成组成型异染色质11，因此在野生型条件下，ade6+报告基因被沉默，表现为红色菌落10。若发生破坏着丝粒区组成型异染色质稳定性的突变，则会导致ade6+报告基因表达，表现为白色菌落。

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方案

1. 培养基的制备

  1. 按照表1所述配制补充了营养成分的酵母提取物培养基（YES）、不含腺嘌呤的YES培养基（YES Low Ade）、粟酒裂殖酵母谷氨酸培养基（PMG12）以及不含腺嘌呤的PMG培养基（PMG-Ade）。YES-Ade（Low Ade）和PMG-Ade平板含有完全相同的组分，但后者不添加腺嘌呤。
    1. 使用以下盐类（50倍浓缩）储备液：在蒸馏水中溶解52.5 g/L MgCl2·6H2O、2 g/L CaCl2·2H2O、50 g/L KCl、2 g/L Na2SO4。用0.22 µm孔径滤膜过滤除菌，4 °C保存。
    2. 使用以下维生素（1,000倍浓缩）储备液：在蒸馏水中溶解1 g/L泛酸钙、10 g/L烟酸、10 g/L肌醇、10 mg/L生物素。用0.22 µm孔径滤膜过滤除菌，4 °C保存。
    3. 使用以下矿物盐（10,000倍浓缩）储备液：在蒸馏水中溶解5 g/L硼酸、4 g/L MnSO4、4 g/L ZnSO4·7H2O、2 g/L FeCl2·4H2O、0.4 g/L MoO3、1 g/L KI、0.4 g/L CuSO4·5H2O、10 g/L柠檬酸。用0.22 µm孔径滤膜过滤除菌，4 °C保存。
      注：通过省略琼脂可制备液态YES培养基。
  2. 将培养基高压灭菌后，在200 rpm转速下用磁力搅拌器搅拌冷却至60 °C以下。
  3. 对于添加G418（遗传霉素）的YES平板，向YES培养基中加入1 mL/L的G418储备液。
    1. 使用以下G418（1,000倍浓缩）储备液：在蒸馏水中溶解100 mg/mL G418。用0.22 µm孔径滤膜过滤除菌，分装至1.5 mL离心管中，-20 °C保存。
  4. 继续搅拌5–10分钟，然后将培养基分装至90 mm培养皿中（每升培养基约可分装40个培养皿）。4 °C保存平板。

2. rpt4+ 及其 5'/3' 非翻译区的克隆

  1. 以裂殖酵母基因组DNA（gDNA）为模板，使用引物p1和p2（图1A）进行PCR反应，总体积为50 µL（约1 µg DNA，20 U酶，1×反应缓冲液），按照表2所述的循环条件扩增包含rpt4+及其5'/3'非翻译区（UTR）的3,315个碱基对（bp）片段。按照制造商说明，使用纯化试剂盒13纯化PCR产物（图1A）。
  2. 将pBlueScript KS(-)载体14和含有rpt4+及其5'/3' UTR的扩增DNA片段用BamH1和Xho1在总体积20 µL（约1 µg DNA，20 U酶，1×消化缓冲液）中于37 °C水浴中酶切16–18小时（图1B）。
  3. 通过TAE琼脂糖凝胶电泳（1.2%琼脂糖凝胶，100 V，1小时）对酶切后的载体和DNA插入片段进行凝胶纯化，切下目标大小的DNA条带，并使用凝胶回收试剂盒15回收DNA。
  4. 使用T4 DNA连接酶进行20 µL连接反应，反应体系包含50–100 ng载体DNA、约3倍摩尔过量的插入片段DNA、400 U T4 DNA连接酶和1×连接缓冲液，将载体与DNA插入片段连接。将反应混合物在18 °C孵育16–18小时。
  5. 将连接产物转化至100 µL E. coli DH5α感受态细胞中，于42 °C热激70秒。加入1 mL LB培养基，在37 °C恢复培养1小时。离心（13,800 x g），弃上清，将全部转化后的E. coli细胞涂布于LB-氨苄青霉素（LA）平板，37 °C孵育16小时。
  6. 用牙签挑取4–8个单菌落，于3 mL LA培养基中37 °C过夜培养。
  7. 按照制造商说明书，使用质粒纯化试剂盒16提取质粒DNA，并取5 µL提取质粒进行分析性限制性酶切反应，加入每种限制性内切酶（BamH1和Xho1）各5 U及1×限制性缓冲液。将反应体系置于37 °C水浴中孵育3小时。通过测序验证候选质粒的克隆正确性。

3. 沉默突变的引入（Xho1 限制性酶切位点）

  1. 设计一对33 bp的引物（p3和p4），其序列中除包含所需突变外，其余部分应相互互补。
  2. 使用高保真聚合酶17（图1C），在总体积为25 µL的反应体系（含10 ng克隆质粒、2 µL 10 pmol引物混合物、2 U酶、1×反应缓冲液）中进行PCR扩增，扩增程序参数见表3。
  3. 用DpnI在20 µL总反应体系（含20 U酶、1×消化缓冲液）中于37 °C水浴中消化模板质粒1小时。
  4. 转化、扩增、提取并测序含有沉默突变的质粒，操作步骤如2.5–2.7所述。
    注意： 沉默突变也可通过允许在单个反应中连接多个DNA片段的克隆方法引入18。

4. 通过易错PCR对rpt4+进行随机突变

  1. 以含有同义突变（Xho1 位点）的质粒为模板，使用引物 p5 和 p6，总体积为 50 µL（模板量按步骤 4.1.1 定义，10 pmol 引物混合物 2 µL，2.5 U 酶，1× 反应缓冲液），并采用一种专为产生高错误率而设计的特殊聚合酶进行易错 PCR19（图 1D）。PCR 操作步骤见表 2。
    1. 使用 4 - 5 µg 模板质粒，以将突变频率控制在 1 bp/kb（千碱基对）。
      注意：需使用高浓度质粒（>500 ng/µL），可通过 Mini-prep 试剂盒获得20。
  2. 通过凝胶电泳确认获得大小为 2670 bp 的 PCR 产物（1.2% 琼脂糖凝胶）。按照步骤 2.5 所述方法对该 PCR 产物进行凝胶纯化。

5. 融合PCR片段的制备（KAN，3'非翻译区）

  1. 以 pFA6a-KANMX621 为模板，使用引物 p7 和 p8，并按照表 4 中列出的条件进行 PCR，以获得标记基因（KAN）片段。按照步骤 2.5 所述方法对所得的 1,480-bp 片段进行凝胶纯化（图 1E）。
    1. 检查目标突变基因的终止密码子与其相邻基因编码区之间是否相隔超过 500 bp。当该区域小于 500 bp 时，不能使用内源性终止子；此时应使用 ADH 终止子替代内源性终止子。使用 ADH 终止子所需调整的实验步骤见 表 5。
      注意： 此项调整仅适用于使用 pFA6a-3HA-KANMX6 质粒中提供的 ADH 终止子替代内源性终止子的情况。
  2. 以克隆有 rpt4+ 的载体为模板，使用引物 p9 和 p10 进行 PCR 反应，总体积为 50 µL（含 20 ng 克隆质粒、2 µL 10 pmol 引物混合物、2 U 酶、1× 反应缓冲液），反应条件见 Table 6。对获得的 506-bp 3'UTR 片段进行凝胶纯化（图 1E）。

6. 通过融合PCR生成转化载体（图1E）

  1. 制备3个片段（突变片段） rpt4+，KAN 和 3'UTR）在 50 ng/µL。
  2. 使用引物p11和p12对三个片段进行融合PCR，具体如表7所述。（融合PCR的实验方案是对原始方案的改进）22纯化主要的4,398-bp PCR产物。
    1. 使用 rpt4+：KAN：3'UTR 片段以 1:3:1 的比例获得最佳结果。
      注意： 插入DNA的总量不应超过500 ng。建议使用的量为 rpt4+:KAN:3'UTR 为 50 ng:150 ng:50 ng。突变区域约为 1.6 kb，因此为涵盖每个碱基突变为其余三种碱基的所有可能组合，至少需要 1,600 × 3 = 4,800 个酵母克隆。由于一次转化反应通常产生 400–500 个克隆，因此至少需要相当于 10 次反应量的融合 PCR 产物。这一需求可通过简单增加反应体系的总量来满足。即， PCR管的数量）减少十倍。

7. 通过电穿孔法转化裂殖酵母（图1F）

  1. 将酵母接种于10 mL YES培养基中，于30 °C振荡培养超过16小时至饱和状态。
  2. 将细胞稀释至200 mL YES培养基中，使600 nm处的光密度（OD600）为0.2，于30 °C振荡培养5–6小时，直至OD600达到0.6–0.8。
  3. 将细胞浓缩至OD600 = 30，分装至四个50 mL锥形管中，冰上预冷10分钟。
  4. 在4 °C条件下以1,050 × g离心3分钟收集细胞。将锥形管和10个电穿孔杯置于冰上。步骤7.3至7.8均需在冰上操作。
  5. 弃去上清液，每管加入15 mL 1.2 M山梨醇溶液，轻轻振荡使细胞重悬。
  6. 在4 °C条件下以1,050 × g离心3分钟。
  7. 重复步骤7.4和7.5。弃去上清液，每管加入500 µL 1.2 M山梨醇溶液，重悬细胞后将所有细胞合并至一个15 mL锥形管中。
  8. 用1.2 M山梨醇溶液定容至2.4 mL（每0.2 mL含OD600 = 10），保持管子置于冰上。
  9. 取200 µL山梨醇悬浮的细胞（确保充分悬浮），加入含有融合PCR构建物的EP管中，充分混匀后转移至电穿孔杯中。
  10. 使用以下参数对细胞进行电穿孔：Fungi程序，ShS（2.00 kV，1次脉冲）。
  11. 每电穿孔杯中加入600 µL 1.2 M山梨醇溶液，终体积为800 µL，然后将细胞均匀涂布于四块YES平板（每板200 µL）。十个电穿孔杯共可涂布40块YES平板。
  12. 将平板于30 °C培养24小时。
  13. 进行影印平板接种至YES+G418平板，并于30 °C培养3天。

8. 异染色质去稳定突变体的筛选及假阳性检测

  1. 针对每个 YES+G418 平板，进行复制平板接种至 YES-Ade（低腺嘌呤）和 PMG-Ade（无腺嘌呤）平板。将复制平板在 30 °C 下孵育 1–2 天，直至 YES-Ade 平板上部分菌落呈现红色（图 1G）。
  2. 比较 YES-Ade 与 PMG-Ade 平板，选择在 YES-Ade 平板上呈粉红色或白色、且能在 PMG-Ade 平板上生长的细胞。不要选择在 PMG-Ade 上无生长的菌落，因其为假阳性（例如，表明 KAN 筛选盒已整合至基因组其他非靶位点）。
  3. 从每个菌落中挑取约 1 × 105 个细胞，加入含 2.5 mg/mL Zymolyase 100T 的 10 µL SPZ 溶液中，在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。取 1 µL 该溶液作为起始模板进行菌落 PCR（图 1H）。
    1. 通过混合 30 mL 2 M 山梨醇、4.05 mL 1 M Na2HPO4、0.95 mL NaH2PO4 和 15 mL 蒸馏水配制 SPZ 溶液（50 mL，终 pH 7.5）。可向样品（5 mL）中添加 Zymolyase，并分装为 500 µL 份量，于 -20 °C 保存备用。
  4. 进行凝胶电泳（1.2% 琼脂糖凝胶，180 V，20 分钟）以观察菌落 PCR 结果。选择产生正确大小 PCR 条带的反应，并将各反应产物取 5 µL 用 XhoI 酶（4 U 酶，1× 酶切缓冲液，37 °C 水浴，1 小时）消化，以排除假阳性结果（图 1H）。
  5. 进行凝胶电泳以观察 XhoI 酶切产物（1.2% 琼脂糖凝胶，180 V，20 分钟）。标记其 PCR 产物被 XhoI 切割的菌落，并将其转接到 YES+G418 平板上（图 1I）。
  6. 从裂殖酵母细胞中提取基因组 DNA，并对 PCR 产物进行测序23。将获得的序列与野生型序列比对，以鉴定突变（图 1I）。
  7. 通过将突变体细胞中经 PCR 扩增的融合构建体转化至野生型细胞中，直接重新引入突变23。采用点种法验证新构建突变细胞的表型（图 1J）。
    1. 以突变体基因组 DNA 为模板，使用引物 p1 和 p10，通过 PCR（总反应体积 50 µL，约 1 µg DNA，20 U 酶，1× 反应缓冲液）可轻松扩增融合转化构建体，并采用 表 2 中描述的循环条件。该构建体的转化可依照步骤 7.1–7.13 进行。

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结果

通过遵循图1中所述步骤获得的 Rpt4 突变体，可通过观察菌落颜色进行分析。图2展示了按细胞数量递减顺序点种到相应平板上的菌落颜色。插入异染色质区域的ade6+报告基因在野生型中处于沉默状态，在 YES-Ade 平板上形成红色菌落。当异染色质结构失稳，ade6+报告基因得以表达时，则在 YES-Ade 平板上可观察到白色菌落，如clr4Δ突变体所示。筛选出的 Rpt4 突变体如图所示，其中rpt4-1突变体表现出最严重的异染色质失稳表型。

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讨论

通过易错PCR进行随机突变是在特定区域内产生多样化突变体库的一种强大工具。该技术特别适用于旨在评估蛋白质在特定条件下功能的研究。例如，本文中我们利用易错PCR评估了19S蛋白酶体亚基Rpt4在异染色质维持中的功能。通过改变易错PCR所靶向的区域并调整筛选条件，我们能够在基因组目标区域对细胞进行突变，并筛选出期望的表型。最近，类似的方法已被用于分离含有纺锤极体组分突变的裂殖酵母细胞25。

随机诱变的关键优势在于其可应用于非必需基因和必需基因。对必需基因进行随机诱变可能产生多种突变体，例如具有轻微和/或部分功能缺陷但仍能维持细胞存活的突变体，或仅在特定条件下功能受到影响的突变体。后者的例子是温度敏感型突变体。此类突变体可通过使用5 mg/L的焰红染料（phloxine B）进行筛选，该染料可将死亡细胞染成红色，从而能够区分生长缓慢的细胞与正在死亡的细胞26。

本方案的关键步骤是易错PCR步骤。在此步骤中，控制突变频率至关重要，突变频率可...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过科学技术信息通信部资助的基础科学研究中心项目（2016R1A2B2006354）的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 培养基
葡萄糖Sigma-AldrichG8270-10KG
酵母提取物BD Biosciences212720
L-亮氨酸JUNSEI87070-0310
腺嘌呤硫酸盐ACR16363-0250
尿嘧啶 Sigma-AldrichU0750
L-组氨酸Sigma-AldrichH8125
KH2PO4Sigma-Aldrich1.05108.0050
NaClJUNSEI19015-0350
MgSO4•7H2OSigma-Aldrich63140
CaCl2Sigma-Aldrich12095
邻苯二甲酸钾Sigma-AldrichP6758-500g
肌醇Sigma-AldrichI7508-50G
生物素Sigma-AldrichB4501-100MG
硼酸Sigma-AldrichB6768-1KG
MnSO4Sigma-AldrichM7634-500G
ZnSO4•7H2O JUNSEI83060-031
FeCl2•4H2OKANTOCB8943686
二水合钼酸钠YAKURI31621
KIJUNSEI80090-0301
CuSO4•5H2OYAKURI09605
D-肌-肌醇MP biomedicals102052
泛酸盐YAKURI26003
烟酸Sigma-AldrichN4126-500G
(NH4)2SO4 Sigma-AldrichA4418-100G
琼脂糖BiobasicD0012
G418，遗传霉素LPSG41805
2. 酶反应
PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶Aglient600380用于定点突变
GeneMorphII 随机突变试剂盒Aglient200500用于易错 PCR
Phusion 高保真 DNA 聚合酶Thermo FisherF-530L用于融合 PCR
Ex Taq DNA 聚合酶TakaraRR001b用于常规 PCR
BamH1New England BioLabsR0136S
Xho1New England BioLabsR0146S
Dpn1New England BioLabsR0176S
3. 仪器
黑色丝绒方块VWR89033-116用于复制接种
复制接种工具VWR25395-380用于复制接种
MicroPulser 电穿孔仪Biorad1652100 用于裂殖酵母转化
电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙Biorad1652086 用于裂殖酵母转化
热循环仪BioerBYQ6078用于融合 PCR 梯度反应 

参考文献

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  13. QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
  14. pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
  15. QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
  16. QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
  17. PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
  18. Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
  19. GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
  20. Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
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