我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外 实验。此外，它还提供了在同一解剖平面上直接比较处理组与未处理组的独特机会。
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摘要
摘要
尽管 大量试图建立可靠动物模型的研究 这反映了神经退行性变背后的主要过程，但其中被广泛接受的却寥寥无几。在此，我们提出 一种新方法 改编自著名的 离体 脑片技术，可提供更接近 体内-样情景而非 体外 用于研究阿尔茨海默病（AD）中观察到的触发细胞变性的早期事件。该方法包含简单且易于重复的操作步骤，能够在一个生理环境中保持所选脑区的解剖细胞结构及其局部功能。可从同一脑组织中获取不同解剖区域，从而能够在特定部位、剂量和时间依赖的条件下，对相关处理措施开展多项实验。潜在局限性 这可能影响与该方法相关的实验结果，与组织的保存状况有关。 即， 切片和孵育步骤中其解剖完整性的维持情况以及切片厚度，均可能影响生化和免疫组织化学分析结果。该方法可应用于多种目的，例如探究生理或病理条件下涉及的分子机制、药物筛选或剂量-反应实验。最后，本方案还可减少行为学研究中所使用的动物数量。此处报道的应用方法最近才首次在 离体 包含基底前脑（BF）的大鼠脑切片，基底前脑是阿尔茨海默病（AD）主要受累的脑区之一。已有研究表明，给予源自乙酰胆碱酯酶（AChE）C末端的毒性肽可诱导出类似AD的表型，并沿BF的前后轴引发AD相关蛋白的差异表达，这些蛋白包括α7烟碱型受体（α7-nAChR）、磷酸化Tau蛋白（p-Tau）和淀粉样蛋白β（Aβ）。
引言
AD 是一种慢性病理过程，其特征是逐渐发生的神经退行性损害，可影响大脑多个区域，如内嗅皮层（EC）、基底前脑（BF）、海马（HC）和嗅球（OB）。1,2,3,4,5阿尔茨海默病（AD）发展的晚期阶段导致进行性认知功能下降，使该疾病成为最常见类型的痴呆，约占所有病例的70%6尽管人们已广泛尝试理解导致阿尔茨海默病（AD）的初始阶段，但目前尚无明确的实验证据阐明这些阶段。此外，最流行的理论——淀粉样蛋白假说 "淀粉样蛋白假说" - 由于其在解释阿尔茨海默病的病理生物学机制方面无法提供完整的图景，也未能提供已被证实有效的药物治疗靶点，正日益受到质疑7,8,9.
另一种日益受到关注的理论认为，神经退行性疾病早期发生的机制与主要在阿尔茨海默病（AD）中易感的神经元集群有关3,10,11,12,13,14。这一位于基底前脑（BF）、中脑和脑干内的异质性细胞枢纽，向多个脑区投射，例如内嗅皮层（EC）、海马（HC）和嗅球（OB）15,16。尽管这些神经元在形态和神经递质合成方面具有多样性，但它们共同表达乙酰胆碱酯酶（AChE），而AChE也可能具有非酶功能17,18。作为新型信号分子的这一非经典作用，可介导 钙离子（Ca2+）流入神经元，进而根据Ca2+的剂量、可利用性及神经元年龄，引发营养性或毒性事件17,18,19。
在神经退行过程中，所观察到的细胞丢失可能因此与这种非酶学功能相关17,18,20，该功能归因于从乙酰胆碱酯酶（AChE）C末端切割产生的30个氨基酸肽段（T30）20。与先前在细胞培养和光学成像18,21实验体系中获得的结果一致，我们通过一种基于包含基底前脑（BF）结构的大鼠脑片离体（ex vivo）的新方法证明， T30可诱导 类似阿尔茨海默病（AD）的表型22。具体而言，该新方法相较于细胞培养提供了更接近生理状态的实验环境，因其在数小时的时间窗口内保留了组织的多种特性，包括解剖结构和神经环路的完整性。我们应用此方案探究神经退行早期阶段发生的事件，监测T30施加后的急性反应。
尽管已有大量文献报道利用脑切片研究与神经元损伤或神经发生相关的分子通路23,24，但本方案首次提供了一种比常用的器官型脑切片更为直接且灵敏的检测方法。然而，与器官型脑切片类似，这种急性脑切片技术也可用于多种用途，例如评估神经保护性或神经毒性分子、发现特定过程中发生的原发性分子变化、免疫组织化学分析，以及针对中枢神经系统相关疾病的药理学检测。
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方案
所有动物实验均在获得批准的方案下进行。
注意：本节提供了实验过程中主要步骤的执行顺序及建议的时间间隔（图1）。此外，实验方案的逐步说明配有示意图面板，展示了从脑组织取出到孵育结束后组织匀浆过程中的关键操作步骤（图2）。有关材料清单、装置搭建方法以及后续进行WB分析步骤的详细信息，此前已有描述22。
1. 手术工具、振动切片机设置 和处理准备
注意：在开始实验步骤之前，请执行以下操作：
- 配制两种不同的人工脑脊液（aCSF），一种用于脑切片，另一种用于孵育步骤，具体方法如前所述29。简而言之，工作浓度 （单位：mmol） 两种aCSF中的前者用于 "切片" aCSF：120 NaCl，5 KCl，20 NaHCO₃3，2.4 CaCl2，2 MgSO₄4，1.2 KH2PO4，以及10葡萄糖；6.7 HEPES盐和3.3 HEPES酸；pH：7.1。而对于 "记录" aCSF：124 NaCl，3.7 KCl，26 NaHCO₃3，2 CaCl2，1.3 MgSO₄4，1.3 KH2PO4，以及10葡萄糖；pH：7.1。
- 充分混匀溶液 然后放入 将切片用 aCSF 冷却并充氧，以确保在取出脑组织及后续切片过程中保持低温。记录用 aCSF 保持室温（RT），并持续供氧。
- 将器械置于解剖罩下，用于断头和脑组织取出。 即，剪刀，外科解剖器械套装（剪刀、镊子、刀片）和刮勺。
- 设置振动切片机参数，选择切片厚度（本实验为300 µm）、频率为7、速度为6。将振动切片机的切片腔置于相应位置，并在其周围放置冰块。
- 打开碳酰气（95% O₂，5% CO₂）气源2, 5% CO₂2）阀门以供氧 "切片" 在脑组织切片过程中使用人工脑脊液（aCSF），选择最低流速，约为2 mL/min。
- 取两支15 mL离心管用于准备待测条件。在其中一支试管中加入10 mL的 "记录" 仅 aCSF（对照组）以及另一组中 10 mL 的 "记录" 含 2 µM T30 的 aCSF（处理组）。将两支试管涡旋混匀后置于冰上，待后续用于实验装置准备阶段（第 3 节）。
2. 麻醉、脑组织提取 和切片
注意：本研究使用了9只野生型P14雄性Wistar大鼠。脑组织的提取及其后续切片是该实验方案的关键步骤，必须在10分钟内快速完成，以防止或至少减缓组织退化过程。
- 在诱导室内的棉层上加入1.5 mL 100% w/w异氟烷，将动物放入其中并盖上盖子。等待动物深度麻醉，确认足底反射消失后，使用断头器将动物断头。
- 在取出脑组织的过程中，将动物头部置于盛有冰冻切片用aCSF的容器中（图2A - C）。
- 使用手术刀切开颅骨表面的皮肤，然后沿中线用剪刀从后部开始向前剪开颅骨，直至到达嗅球（OBs）上方的骨骼（图2A）。
- 用一对镊子将颅骨两侧向外拉开，以暴露脑组织（图2B）。将刮勺插入脑腹侧，轻柔地将脑组织取出，并将其保持在冰冻的"slicing" aCSF中约5分钟以保持湿润（图2C）。
- 将脑组织置于滤纸上，用刀片切除小脑（图2D）。将脑组织垂直粘附于振动切片机的切片盘上，放入切片室中，加入冰冻的"slicing" aCSF，并通入氧气（图2E）。
- 调整切片间隔，开始进行脑组织切片（图2F）。收集包含目标区域的切片，如内侧隔核（MS）、Broca斜角带（DBB）和无名质（SI），具体方法如前所述22。从上到下，这三片切片分别包含基底前脑（BF）的头侧（R）、中间（I）和尾侧（C）部分（图2G）。
- 使用小剪刀沿中线将每一片切片分为两半，得到两个对称的半切片（图2H），在同一解剖平面上分别用于对照组和处理组。
- 将半切片保留在振动切片机室中5 - 10分钟，然后用玻璃移液管将其转移至盛有灌流记录用aCSF的鼓泡容器中，在室温（RT）下静置约30分钟以恢复。
- 在此期间，准备三个玻璃瓶，每瓶加入3 mL仅含记录用aCSF的溶液（按步骤1.6预先配制），用于对照组；另准备三个玻璃瓶，每瓶加入3 mL富含T30的aCSF溶液（按步骤1.6预先配制），用于处理组。
3. 实验准备
- 将半切样本转移至对应的玻璃小瓶中（图 2I以获得三段连续的半切片（包括前部、中部和后部基底前脑区域）作为对照组（绿色框， 图 2J）以及处理组对应的匹配样本（红色框， 图2J).
- 转移 使用两把不同的刷子分别处理对照半脑切片和处理组半脑切片，以避免不同条件之间的任何污染。
- 用相应的盖子密封每个玻璃小瓶，并插入供氧针头（21G）图 2J）。将装置的主管连接至碳氧混合气源（图 2K）。在整个孵育期间以不低于2 mL/min的最低流速向脑片灌注氧气，以避免脑组织移动及实验过程中可能发生的机械损伤。开始5小时的孵育，并在5分钟内完成步骤3.1至3.3。
注意：需频繁检查（每15–20分钟）所有小瓶是否均有氧气供应，并确认氧气流速不会将组织从瓶底吹起。
4. 样品匀浆
- 孵育结束后停止供氧，取下所有小瓶的盖子。使用适当的毛刷将半脑切片转移至含有250 µL裂解缓冲液的1.5 mL离心管中，并将离心管保持在冰上（图2L）。配制裂解缓冲液时，将1× PBS与磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合液按1:100稀释后混合，并使用不同的研磨杵匀浆组织，以防止样品间交叉污染 。整个操作过程应在10至15分钟内完成 。
- 将脑组织裂解液在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟。将上清液转移至新的离心管中，并将样品保存于-80 °C。
5. 蛋白质浓度测定与蛋白质印迹分析
- 测定每个样品的蛋白浓度，随后按照先前所述方法准备用于 Western blot 分析的等分试样22。
- 进行统计分析，以评估处理对蛋白表达的影响。
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结果
本文所示方案表明，毒性多肽 T30 的施用以位点依赖的方式调节含基底前脑（BF）切片中 α7-nAChR、p-Tau 和 Aβ 的表达（图 3A）。与对照侧相比，尼古丁受体在 rostral 处理的半切片中显著增加（切片 1，p = 0.0310）（图 3B），而中间切片在两种条件下未显示任何变化（切片 2，p = 0.1195）（图 3B）。在后部区域，T30 暴露部分相较于其对照侧出现显著降低（切片 3，p = 0.0476）（图 3B）。施用 T30 后，p-Tau 水平在前部区域显著高于对照对应侧（切片 1，p = 0.0158）（图 3C）。另一方面，其余两个含 BF 的切片在两种条件下均未显示显...
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讨论
本方案的主要特点在于 成熟的 离体 脑部技术，可实现同步检测 来自同一解剖平面的两个对称半切片，在特定条件（对照或处理）施加后监测其反应；因此提供了尽可能严格控制的实验范式。能够在时间、剂量和作用位点特异的情况下，评估与神经元损伤相关的多种神经化学物质，如在神经退行性事件中所见22，代表了一个关键特征。该方法结合了以下优势： 体内 生理环境与那些 体外 制备过程，例如精确获取目标区域并构建理想的细胞外环境。本方案是对广泛用于脑切片的常规操作步骤的改进。 离体 电生理记录25,26,27 和光学成像28,29,30，或 体外...
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披露
作者声明存在竞争性财务利益。Susan A. Greenfield 是私营公司 Neuro-Bio Limited 的创始人兼总裁，并持有该公司股份。Emanuele Brai 和 Antonella Cogoni 是 Neuro-Bio Ltd 的员工。
致谢
本工作由 Neuro-Bio Ltd. 资助。我们感谢 Neuro-Bio 的 Giovanni Ferrati 博士和 Sergio Rotondo 博士对本文稿提出的评论与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | aCSF 配制用试剂 |
| 氯化钾 (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | aCSF 配制用试剂 |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | aCSF 配制用试剂 |
| 七水合硫酸镁 (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | aCSF 配制用试剂 |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | aCSF 配制用试剂 |
| Hepes 盐 | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | aCSF 配制用试剂 |
| Hepes 酸 | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | aCSF 配制用试剂 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | aCSF 配制用试剂 |
| 二水合氯化钙 | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | aCSF 配制用试剂 |
| T30 肽 | Genosphere Biotechnologies, France | 测试的 AChE 来源肽 | |
| 手术解剖工具包 | World Precision Instruments, USA | 货号: MOUSEKIT | 脑组织取出步骤 |
| 手术刀片 | Swann-Morton, UK | BS 2982 | 脑组织取出步骤 |
| 滤纸 | Fisher Scientific, USA | 11566873 | 脑组织切片前处理 |
| 胶水 | 脑组织切片前处理 | ||
| 振动切片机 | Leica, Germany | VT1000 S | 切片 |
| 毛刷 | 组织操作 | ||
| 氧气罐 | 切片及孵育阶段 | ||
| 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | 匀浆步骤 |
| 磷酸酶抑制剂 | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | 匀浆步骤 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | 匀浆步骤 |
| 研磨杵 | Starlab, UK | I1415-5390 | 匀浆步骤 |
| 微量离心机 | |||
| Pierce 660 nm 蛋白质定量试剂盒 | Thermo Scientific, USA | 22660 | 蛋白质浓度测定 |
参考文献
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