我们提出一种方法，该方法能够 为神经退行性变早期事件提供进一步见解，并基于已建立的 离体 脑技术，结合了以下优势 体内 和 体外 实验。此外，它还提供了在同一解剖平面上直接比较处理组与未处理组的独特机会。
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摘要
摘要
尽管 大量试图建立可靠动物模型的研究 这反映了神经退行性变背后的主要过程，但其中被广泛接受的却寥寥无几。在此，我们提出 一种新方法 改编自著名的 离体 脑片技术，可提供更接近 体内-样情景而非 体外 用于研究阿尔茨海默病（AD）中观察到的触发细胞变性的早期事件。该方法包含简单且易于重复的操作步骤，能够在一个生理环境中保持所选脑区的解剖细胞结构及其局部功能。可从同一脑组织中获取不同解剖区域，从而能够在特定部位、剂量和时间依赖的条件下，对相关处理措施开展多项实验。潜在局限性 这可能影响与该方法相关的实验结果，与组织的保存状况有关。 即， 切片和孵育步骤中其解剖完整性的维持情况以及切片厚度，均可能影响生化和免疫组织化学分析结果。该方法可应用于多种目的，例如探究生理或病理条件下涉及的分子机制、药物筛选或剂量-反应实验。最后，本方案还可减少行为学研究中所使用的动物数量。此处报道的应用方法最近才首次在 离体 包含基底前脑（BF）的大鼠脑切片，基底前脑是阿尔茨海默病（AD）主要受累的脑区之一。已有研究表明，给予源自乙酰胆碱酯酶（AChE）C末端的毒性肽可诱导出类似AD的表型，并沿BF的前后轴引发AD相关蛋白的差异表达，这些蛋白包括α7烟碱型受体（α7-nAChR）、磷酸化Tau蛋白（p-Tau）和淀粉样蛋白β（Aβ）。
引言
AD 是一种慢性病理过程，其特征是逐渐发生的神经退行性损害，可影响大脑多个区域，如内嗅皮层（EC）、基底前脑（BF）、海马（HC）和嗅球（OB）。1,2,3,4,5阿尔茨海默病（AD）发展的晚期阶段导致进行性认知功能下降，使该疾病成为最常见类型的痴呆，约占所有病例的70%6尽管人们已广泛尝试理解导致阿尔茨海默病（AD）的初始阶段，但目前尚无明确的实验证据阐明这些阶段。此外，最流行的理论——淀粉样蛋白假说 "淀粉样蛋白假说" - 由于其在解释阿尔茨海默病的病理生物学机制方面无法提供完整的图景，也未能提供已被证实有效的药物治疗靶点，正日益受到质疑7,8,9.
另一种日益受到关注的理论认为，神经退行性疾病早期发生的机制与主要在阿尔茨海默病（AD）中易感的神经元集群有关3
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方案
所有动物实验均在获得批准的方案下进行。
注意：本节提供了实验过程中主要步骤的执行顺序及建议的时间间隔（图1）。此外，实验方案的逐步说明配有示意图面板，展示了从脑组织取出到孵育结束后组织匀浆过程中的关键操作步骤（图2）。有关材料清单、装置搭建方法以及后续进行WB分析步骤的详细信息，此前已有描述22。
1. 手术工具、振动切片机设置 和处理准备
注意：在开始实验步骤之前，请执行以下操作：
- 配制两种不同的人工脑脊液（aCSF），一种用于脑切片，另一种用于孵育步骤，具体方法如前所述29。简而言之，工作浓度 （单位：mmol） 两种aCSF中的前者用于 "切片" aCSF：120 NaCl，5 KCl，20 NaHCO₃3，2.4 CaCl2，2 MgSO₄4，1.2 KH2PO4，以及10葡萄糖；6.7 HEPES盐和3.3 HEPES酸；pH：7.1。而对于 "记录"....
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结果
本文所示方案表明，毒性多肽 T30 的施用以位点依赖的方式调节含基底前脑（BF）切片中 α7-nAChR、p-Tau 和 Aβ 的表达（图 3A）。与对照侧相比，尼古丁受体在 rostral 处理的半切片中显著增加（切片 1，p = 0.0310）（图 3B），而中间切片在两种条件下未显示任何变化（切片 2，p = 0.1195）（图 3B）。在后部区域，T30 暴露部分相较于其对照侧出现显著降低（切片 3，p = 0.0476）（图 3B）。施用 T30 后，p-Tau 水平在前部区域显著高于对照对应侧（切片 1，p = 0.0158）（图 3C）。另一方面，其余两个含 BF 的切片在两种条件下均未显示显.......
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讨论
本方案的主要特点在于 成熟的 离体 脑部技术，可实现同步检测 来自同一解剖平面的两个对称半切片，在特定条件（对照或处理）施加后监测其反应；因此提供了尽可能严格控制的实验范式。能够在时间、剂量和作用位点特异的情况下，评估与神经元损伤相关的多种神经化学物质，如在神经退行性事件中所见22，代表了一个关键特征。该方法结合了以下优势： 体内 生理环境与那些 体外 制备过程，例如精确获取目标区域并构建理想的细胞外环境。本方案是对广泛用于脑切片的常规操作步骤的改进。 离体 电生理记录25,26,27 和光学成像28,29,30，或 体外.......
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披露
作者声明存在竞争性财务利益。Susan A. Greenfield 是私营公司 Neuro-Bio Limited 的创始人兼总裁，并持有该公司股份。Emanuele Brai 和 Antonella Cogoni 是 Neuro-Bio Ltd 的员工。
致谢
本工作由 Neuro-Bio Ltd. 资助。我们感谢 Neuro-Bio 的 Giovanni Ferrati 博士和 Sergio Rotondo 博士对本文稿提出的评论与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | aCSF 配制用试剂 |
| 氯化钾 (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | aCSF 配制用试剂 |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | aCSF 配制用试剂 |
| 七水合硫酸镁 (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | aCSF 配制用试剂 |
| 磷酸二氢钾 (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | aCSF 配制用试剂 |
| Hepes 盐 | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | aCSF 配制用试剂 |
| Hepes 酸 | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | aCSF 配制用试剂 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | aCSF 配制用试剂 |
| 二水合氯化钙 | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | aCSF 配制用试剂 |
| T30 肽 | Genosphere Biotechnologies, France | 测试的 AChE 来源肽 | |
| 手术解剖工具包 | World Precision Instruments, USA | 货号: MOUSEKIT | 脑组织取出步骤 |
| 手术刀片 | Swann-Morton, UK | BS 2982 | 脑组织取出步骤 |
| 滤纸 | Fisher Scientific, USA | 11566873 | 脑组织切片前处理 |
| 胶水 | 脑组织切片前处理 | ||
| 振动切片机 | Leica, Germany | VT1000 S | 切片 |
| 毛刷 | 组织操作 | ||
| 氧气罐 | 切片及孵育阶段 | ||
| 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | 匀浆步骤 |
| 磷酸酶抑制剂 | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | 匀浆步骤 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | 匀浆步骤 |
| 研磨杵 | Starlab, UK | I1415-5390 | 匀浆步骤 |
| 微量离心机 | |||
| Pierce 660 nm 蛋白质定量试剂盒 | Thermo Scientific, USA | 22660 | 蛋白质浓度测定 |
参考文献
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's diseas....
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