Lambda Select cII 突变检测系统

摘要

我们描述了一种针对转基因啮齿类动物或经特定化学/物理因素处理的相应动物的培养细胞中进行Lambda Select cII突变检测的详细方案。该方法已广泛用于哺乳动物细胞中致癌物的致突变性检测。

摘要

已开发出多种转基因动物模型和突变检测系统，用于在哺乳动物细胞中对致癌物进行致突变性测试。其中，转基因小鼠和λ（Lambda）Select系统 cII 突变检测系统已被全球众多研究团队用于致变性实验。本文中，我们详细介绍一种用于λ选择的详细实验方案 cII 突变检测实验，可应用于经化学/物理因子处理的转基因小鼠/大鼠的培养细胞或相应动物个体。该实验方案包括以下步骤：（1）从经处理的转基因动物的细胞或器官/组织中分离基因组DNA 体外 或 体内，分别与测试化合物作用；（2）回收携带突变报告基因的λ穿梭载体即, cII 从基因组DNA中回收转基因；(3) 将回收的载体包装成具有感染性的噬菌体；(4) 感染宿主细菌并在选择性条件下培养，以促进诱导型载体的扩增 cII 突变；以及（5）评分 cII-突变体及DNA序列分析以确定 cII 突变频率和突变谱。

引言

已开发出多种转基因动物模型和突变检测系统，用于在哺乳动物细胞中对致癌物进行致突变性测试。其中，转基因 Big Blue（以下简称 BB）小鼠及 λ Select cII 突变检测系统已被本研究组及全球众多其他研究团队广泛应用于致突变性实验^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。在过去16年中，我们利用这些转基因动物或经受试化合物处理的相应胚胎成纤维细胞培养物，研究了多种化学和/或物理因素的致突变效应，并分别通过 λ Select cII 检测法和DNA测序技术对cII 转基因的表型和基因型进行了分析^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}。这些转基因动物的基因组中含有一种噬菌体λ穿梭载体（λLIZ），以多拷贝头尾串联的形式整合于第4号染色体上^1,2,25。该λLIZ穿梭载体携带两个突变报告基因，即lacI 和 cII 转基因^{1,2,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47}。λ Select cII 检测法基于从转基因动物器官/组织来源细胞的基因组DNA中回收λLIZ穿梭载体^1,2,25。回收后的λLIZ穿梭载体被包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒，可感染指示宿主Escherichia coli。随后，将感染的细菌在选择性条件下培养，以便对cII 转基因中的突变进行计数和分析^1,3。

此处，我们介绍一种用于λ选择的详细方案 cII 检测，包括从经处理的转基因动物的细胞/器官中分离基因组DNA 体外/体内 加入测试化合物，从基因组DNA中回收λLIZ穿梭载体，将载体包装为具有感染性的λ噬菌体，感染宿主 大肠杆菌 与噬菌体一起，鉴定 cII-在选择性条件下对突变体进行测定以确定 cII 突变频率，以及通过DNA序列分析来建立 cII 突变谱。该方案可应用于经处理的转基因小鼠/大鼠细胞培养物 体外 用感兴趣的化学/物理试剂处理，或用经相应动物处理的组织/器官 体内 与待测化学品/试剂^{1,2,4,48,49,50,51,52}λ选择的示意图 cII 检测结果如图所示 图1.

方案

1. 小鼠胚胎成纤维细胞基因组DNA的提取

注意：根据已发表的实验方案，从小鼠胚胎中分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，这些胚胎来源于具有C57BL/6遗传背景的BB转基因小鼠⁵³本方案的起始材料为 1 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 经测试化合物处理的胚胎成纤维细胞 与 对照。使用标准方法收获和计数这些细胞的步骤详见参考文献^10,54,55.

1. 预先配制缓冲液 A（0.3 M 蔗糖，60 mM KCl，15 mM NaCl，60 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5 mM 精脒，0.15 mM 精胺，和 2 mM EDTA）、缓冲液 B（150 mM NaCl 和 5 mM EDTA，pH 7.8）以及缓冲液 C（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，20 mM NaCl，20 mM EDTA，和 1% SDS），并在室温（RT）下保存，最长可保存一年^54,55。
2. 在 15 mL 圆锥形离心管中，使用宽口 1,000 µL 移液器吸头反复吹打，将细胞重悬于 2–4 mL 缓冲液 A 中。
3. 使用玻璃刻度移液管加入一倍体积（2–4 mL）含有 1% 辛基苯基聚氧乙烯醚（例如，Nonidet P40）的缓冲液 A。
4. 将离心管置于冰上孵育 5 分钟。
5. 在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟。
6. 弃去上清液，并使用玻璃刻度移液管用 10–15 mL 缓冲液 A 洗涤沉淀。
7. 将沉淀重悬于 2–4 mL 缓冲液 B 中。
8. 加入一倍体积（2–4 mL）含有 600 µg/mL 蛋白酶 K 的缓冲液 C。
9. 在 37 °C 下孵育 3 小时。
10. 加入 RNase A 至终浓度为 100 µg/mL。
11. 继续在 37 °C 下孵育 1 小时。
12. 加入一倍体积（2–4 mL）苯酚（用 0.1 M Tris-HCl，pH 8.0 饱和）:氯仿:异戊醇（25:24:1 体积比）。
    注意：苯酚可能对健康造成严重危害，必须极其小心操作。苯酚对皮肤具有强腐蚀性，易经皮肤吸收，并具有其他毒性效应。操作苯酚时，务必佩戴双层手套，使用护目镜，并在化学通风橱中进行操作。
13. 在 4 °C 下，将离心管置于旋转仪上倒置混合 5 分钟，充分混匀。
14. 在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟。
15. 使用玻璃刻度移液管将水相（上层）转移至新离心管中。
16. 重复苯酚:氯仿:异戊醇抽提 1 至 3 次，直至水相澄清且界面无浑浊。
17. 加入 1/10 体积（200–400 µL）3 M 醋酸钠，pH 5.2。
18. 加入 2.5 倍体积（5–10 mL）预冷的 100% 乙醇，用手轻轻倒置混匀 2–3 分钟。
19. 用玻璃钩缠绕析出的 DNA，将其转移至含有 1–5 mL 70% 乙醇的新离心管中，充分洗涤。或者，在 4 °C 下高速（3,500 x g）离心收集 DNA 沉淀，并用 1–5 mL 70% 乙醇充分洗涤。
20. 在室温下高速（3,500 x g）离心，弃去上清液，将 DNA 空气干燥 10–15 分钟。
21. 将 DNA 溶解于 10–100 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.5）中，于 4 °C 保存（短期保存，最长一个月）或 -20 °C 保存（长期保存）。λ Select cII 检测中 DNA 的最佳浓度为 0.5–1.0 µg/µL（溶于 TE 缓冲液）⁵⁶。

2. 体外 包装反应

1. 每次包装反应中，加入约 5 µg 基因组 DNA（终体积：8–12 µL，基因组 DNA 的提取方法为 第1节 来自经处理的小鼠胚胎成纤维细胞 体外 将待测化合物或对照物加入含有第一反应混合液（约10 µL）的微量离心管中。
   注意：不同实验室使用自行制备或商业来源的λ包装提取物。本实验所用为商业化的包装提取物试剂盒⁵⁶ （参见 材料表红色管中含有第一反应混合液（约10 µL），蓝色管中含有第二反应混合液（至少5个反应，每份约70 µL）。
2. 将试管在 30 °C 下孵育 90 分钟。
3. 加入所需体积（约12 µL）的第二反应混合液至离心管中。
4. 将试管在 30 °C 下继续孵育 90 分钟。
5. 加入 1.1 mL SM 缓冲液至离心管中。
   注意：该溶液1 mL（即，包装反应混合物）将用于λ的筛选 cII-突变体。其余部分将用于滴定。
   1. 准备 SM 缓冲液 通过混合5.8 g NaCl和2.0 g MgSO₄.7H₂O，50 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）和 5 mL 2%（w/v）明胶。加入 dH₂定容至1升，121℃高压灭菌30分钟。室温保存，可稳定存放长达1年。
6. 将含有包装后DNA样品的离心管在室温下剧烈涡旋振荡10秒。
7. 用微量离心机短时离心，然后置于冰上保存，直至使用。若样品在包装后当天不立即使用，需向每毫升包装好的DNA样品中加入50 µL氯仿，轻轻涡旋混匀，并于4 °C保存，最长可保存2周。

3. 准备 E. coli G1250 细菌培养

1. 至少在铺板前两天，从菌种中制备若干细菌划线平板 大肠杆菌 (E. coli) TB1-卡那霉素琼脂平板上的G1250。
   1. 制备TB1-卡那霉素琼脂平板，步骤如下：称取5.0 g NaCl、10.0 g 酪蛋白胨和12.0 g 琼脂，加入800 mL dH₂O₂O. 加入1 mL 0.1%盐酸硫胺素，用NaOH或HCl调节pH至7.0，加入dH₂O₂加水至终体积为1升。
   2. 充分混匀后高压灭菌30分钟。冷却至55 °C，加入50.0 mg卡那霉素并混匀。分装至无菌100 mm培养皿中（每皿20–25 mL）。4 °C保存，最多两周。
2. 将细菌划线平板置于30 °C恒温培养箱中静置培养至少24 h。
3. 铺板前一天，将10 mL TB1液体培养基与100 µL 20% (w/v) 麦芽糖-1 M MgSO₄混合₄ 在无菌的50 mL螺口锥形管中配制溶液。
   1. 按如下方法制备TB1液体培养基。混合5.0 g NaCl和10.0 g酪蛋白胨，加入800 mL dH₂O₂O，1 mL 0.1% 盐酸硫胺素，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.0。然后加入 dH₂定容至1升，充分混匀，121°C高压灭菌30分钟。培养基于室温保存，可使用长达三个月。
   2. 配制20% (w/v) 麦芽糖-1 M MgSO₄₄ 如下所述：将 20.0 g 麦芽糖和 24.6 g MgSO₄ 混合₄. 7H₂O，然后加入 dH₂O₂加水至终体积为100 mL。过滤除菌，4 °C保存，可保存长达6个月。
4. 用无菌接种环挑取细菌划线平板上的数个菌落，接种于液体培养基中⁵⁶.
5. 在30 °C摇床培养箱中剧烈振荡（250–300 rpm）培养液体培养物过夜。
6. 铺板当天，将含有 G1250 液体培养物的锥形管在 1,500 x g 在室温下离心10分钟以沉淀细菌细胞。
7. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 10 mM MgSO₄ 中₄.
8. 使用紫外-可见分光光度计在波长600 nm处测定细胞悬液1:10稀释液的吸光度例如，100 µL 细胞悬液 + 900 µL 10 mM MgSO₄₄)⁵⁶.
9. 将细胞悬液稀释至终浓度OD₆₀₀ 0.5，含10 mM MgSO₄₄G1250 悬液的制备 E. coli OD值₆₀₀ = 0.5 被称为“G1250 铺板培养”。
10. 将G1250涂布培养物置于冰上保存，并在1-2小时内使用。

4. 接种包装好的DNA样品

1. 每份包装好的DNA样品，准备十六个无菌的14 x 100 mm试管² 圆底管和十六个TB1琼脂平板。每组中十个用于筛选，六个用于滴定（三个用于Titer 20，三个用于Titer 100）。
   1. 制备 TB1 琼脂平板，步骤如下：称取 5.0 g NaCl、10.0 g 酪蛋白胨和 12.0 g 琼脂，加入 800 mL 去离子水₂O，并加入1 mL 0.1%盐酸硫胺素。用NaOH或HCl调节pH至7.0，并加入dH₂定容至 1 L。
   2. 充分混匀后，121 °C高压灭菌30分钟。待混合物冷却至55 °C，倒入无菌的100 mm培养皿中（每皿20–25 mL）。将平板置于4 °C保存，最多可保存两周。
      注意：TB1 琼脂平板至少应在使用前 24 小时制备。
2. 将200 µL G1250涂布培养物分装至各圆底管中。
3. 用于滴定，取包装好的DNA样品进行1:100稀释，并通过涡旋充分混匀（即10 µL 包装的 DNA 样品 + 990 µL SM 缓冲液
4. 向每支 Titer 20 管中加入 20 µL 1:100 稀释液。
5. 向每支 Titer 100 管中加入 100 µL 1:100 稀释液。
6. 用于筛选，加入100 µL的“未稀释 将包装好的DNA样本分别加入十个筛选管中。
7. 处理所有滴定和筛选试管（2 × 3 + 10 = 16 支试管），操作如下：涡旋振荡约 10 秒使充分混匀，然后于室温孵育 30 分钟，以允许宿主 E. coli 以吸附噬菌体。
8. 向每个滴定或筛选管中加入2.5 mL微波加热熔化的TB1顶层琼脂（冷却至55 °C），立即轻轻涡旋混匀，并倾注至相应的滴定或筛选TB1琼脂平板中。
   1. 按如下方法制备TB1顶层琼脂：称取5.0 g NaCl、10.0 g酪蛋白胨和7.0 g琼脂，加入800 mL dH₂O₂O. 加入1 mL 0.1%盐酸硫胺素，然后用NaOH或HCl调节pH至7.0。最后加入dH₂O₂O至终体积1升。
   2. 充分混匀，121°C高压灭菌20–25分钟。室温保存，可稳定存放长达三个月。
   3. 使用前，将制备好的TB1顶层琼脂在微波炉中融化，充分混匀，然后在水浴中冷却至55 °C。
      注意：将熔化并冷却的TB1顶层培养基加入每个滴定或筛选管的内容物中，混匀后，倒入相应的滴定或筛选TB1琼脂平板中。
9. 将培养皿在室温下静置15–30分钟，皿盖稍打开以防止冷凝。
10. 倒置平板，将十个筛选平板放入恒温24 °C的培养箱中，静置培养46–48 h。即，选择性条件）以及六个滴定板置于37 °C恒温摇床中，培养24小时/过夜（即，非选择性条件）。
    注意：为了确保结果的质量控制和标准化，可使用市售的对照噬菌体溶液，其中含有野生型和突变型的混合物 cII 已知突变频率的样品与包装后的DNA样本一同铺板，并纳入所有检测运行中⁵⁶.

5. 检测滴度并筛选平板以确定 cII 突变频率

1. 在37 °C孵育24小时/过夜后，计数三块Titer 20平板和三块Titer 100平板中各自形成的噬斑数量。为更易于识别噬斑，可取下平板盖，将平板置于白色光源箱旁，并以深色背景为衬底（参见 图2).
2. 对每组 Titer 20 平板和 Titer 100 平板（每组三个重复）中计数的噬斑数量取平均值（均值）。
3. 选择最接近每板组50–200个蚀斑范围的滴度板组中的平均数值。
4. 按下述方法计算十块筛选平板中筛选的噬菌斑总数：
   总筛选噬斑数 =（所选滴定平板中平均噬斑数 ÷ 每块所选滴定平板使用的稀释液体积（µL））× 稀释倍数 × 每块筛选平板所用包装DNA样本体积（µL）[100 µL/板] × 筛选平板数量 [10]
   注意：例如，如果 Titer 20 平板组中每板平均噬斑数为 128，而 Titer 100 平板组中对应的噬斑数为 478，则计算筛选的总噬斑数时将使用 128 进行计算，如下所示：
   (128 ÷ 20) × 100 [稀释倍数] × 100 [µL/板] × 10 [板] = 640,000
   这相当于将平均噬斑数乘以5,000或1,000，具体取决于平均数是基于Titer 20平板还是Titer 100平板的计数结果。
5. 在24 °C下孵育46–48小时后，计数十块筛选平板中形成的噬菌斑总数（按照第5.1节提供的说明进行操作）。
   注意： cII 突变频率通过将筛选平板中形成的噬斑总数除以筛选的噬斑总数来计算。以上述示例为例，如果在十个筛选平板中计数的噬斑总数为112， cII 该DNA样本的突变频率为112 ÷ 640,000 = 17.5 × 10⁻⁶^-5.

6. 假定λ cII 突变体的验证、PCR扩增及DNA测序

1. 使用无菌宽口移液器吸头对目标噬菌斑进行打孔，并通过反复吹打将其排入含有 500 µL 无菌 SM 缓冲液的无菌微量离心管中。
2. 在室温下孵育至少 2 小时，或在 4 °C 过夜孵育，以使噬菌体颗粒从琼脂块中洗脱出来。
3. 在无菌的 14 x 100 mm² 圆底试管中，将 200 µL G1250 铺板培养物与 1 µL 打孔获得的噬菌体溶液混合，并在室温下孵育 30 分钟。
4. 使用 2.5 mL 55 °C 熔化的 TB1 上层琼脂对样品进行铺板，并在 24 °C 下孵育 46–48 小时（选择性条件），具体操作如第 4.8–4.10 节所述。
5. 当次级噬菌斑形成后，使用移液器吸头小心挑取一个孤立良好的已验证 λ cII-突变噬菌斑（避免触碰下层琼脂）。
   注意：对疑似 cII 突变噬菌斑进行再次铺板具有两个目的：(i) 有时会将铺板过程中的人工假象误认为是小尺寸噬菌斑；(ii) 从筛选平板上获取的琼脂糖芯可能同时含有非突变噬菌体和突变噬菌体。通过低密度重铺获得的次级噬菌斑可为 PCR 及后续 DNA 测序分析提供无污染的突变模板。
6. 通过反复吹打，将噬菌斑转移至含有 25 µL 双蒸水的微量离心管中。
7. 将试管置于沸水中加热 5 分钟。
8. 在室温下以最大速度（18,000 x g）离心 3 分钟。
9. 立即取 10 µL 上清液转移至新的微量离心管中，该管中预先加入 40 µL PCR 主混合液，其中各试剂终浓度为 1 x Taq PCR 缓冲液、正向和反向引物各 10 pmol、每种 dNTP 12.5 nmol 以及 2.5 U Taq DNA 聚合酶。
   注意：正向引物和反向引物序列如下：5'-CCACACCTATGGTGTATG-3'（相对于 cII 起始密码子的位置为 -68 至 -50）和 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3'（相对于 cII 起始密码子的位置为 +345 至 +365）。
10. 采用以下循环参数扩增模板：95 °C 变性 3 分钟，随后进行 30 个循环（每个循环包括 95 °C 30 秒、60 °C 1 分钟、72 °C 1 分钟），最后在 72 °C 延伸 10 分钟。
11. 使用 commercially available PCR 纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化包含 cII 基因及其侧翼区域的 432 bp PCR 产物。
12. 使用适当的测序平台进行 DNA 测序，并分析所得 DNA 序列以检测 cII 转基因中的突变（见下文注释）。
    注意：最好使用软件（例如基于网络的 T-Coffee 序列比对服务器）将测序结果与参考 cII 序列进行比对。有关程序使用说明，请访问：http://tcoffee.crg.cat/

结果

根据数据分布情况，采用参数检验或非参数检验来确定差异的显著性 cII 处理组与对照组之间的突变频率即，诱导突变频率与自发突变频率的比较。诱导突变频率的比较 cII 通过适用的各种（成对）统计学检验方法，对不同处理组间的突变频率进行比较。通常采用Adams和Skopek的超几何检验法来比较总体诱导突变谱与自发突变谱⁵⁷，尽管其他检测方法，例如 χ² 检验或方差分析（ANOVA）也可用于比较每种特定类型突变的发生频率（例如，诱导突变谱与对照突变谱之间，或不同化学物质/试剂诱导的多种突变谱之间，以及同一种化学物质/试剂不同剂量诱导的突变谱之间的转换、颠换、插入或缺失

图3汇总了已发表研究中的突变频率数据，这些研究表明，在经不同化学物质和/或物理因素处理的小鼠胚...

讨论

λ Select cII 检测法用于检测从 BB 啮齿类动物器官/组织来源细胞的基因组 DNA 中回收的 cII 转基因中的突变³。这些转基因动物的基因组中含有多个串联重复的染色体整合型 λLIZ 穿梭载体拷贝，该载体携带 cII（294 bp）和 lacI（1,080 bp）转基因，作为突变报告基因^1,2,25。λ Select cII 检测法基于从转基因动物细胞/组织的基因组 DNA 中回收 λLIZ 穿梭载体，随后将 rescued 载体包装进 λ 噬菌体头部，以感染合适的大肠杆菌（E. coli）宿主。接着，将感染的细菌在选择性条件下培养，以便对 cII 转基因中的突变进行计数和分析（见图1）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	MO Bio Laboratories, Inc.	12112-05	细菌学级
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific	4337455	无
酪蛋白胨	Alfa Aesar	H26557	无
明胶	J. T. Baker	2124-01	粉末
甘油	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	无
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP 9724-500	无
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	8104	50 次 PCR 纯化反应
三水合乙酸钠	Fisher Scientific	M-15756	无
Taq5000 DNA 聚合酶	Qiagen	201207	无
盐酸硫胺素	Macron Fine Chemicals	2722-57	无
Transpack 包装提取物	Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 次包装反应
Tris 碱	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	无
胰蛋白胨	Biosciences	RC-110	无