Method Article

Lambda 选择cII突变检测系统

DOI:

10.3791/57510

⸱

April 26th, 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In This Article

Summary

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我们描述了一个详细的协议, 为 Lambda 选择cII突变试验的培养细胞的转基因啮齿动物或相应的动物处理的化学/物理剂的利益。该方法已广泛用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。

Abstract

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开发了多种转基因动物模型和突变检测系统, 用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。其中, 转基因小鼠和 Lambda (λ) 选择cII突变检测系统已被全球许多研究团体用于致突变实验。在这里, 我们描述了 Lambda 选择cII突变检测的详细协议, 该方法可应用于转基因小鼠/大鼠的培养细胞或与化学/物理制剂相关的动物。该协议包括以下步骤: (1) 从转基因动物的细胞或器官/组织中分离出基因组 DNA, 分别处理体外或体内, 并用一个测试化合物;(2) 从基因组 DNA 中回收携带突变报告基因 (即、 cII转基因) 的 lambda 梭载体;(3) 将获救的载体包装成传染性噬菌体;(4) 感染宿主细菌并在选择性条件下培养, 以允许传播诱导的cII突变;(5) 评分的cII突变体和 DNA 序列分析, 以确定cII突变频率和变异谱, 分别。

Introduction

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开发了多种转基因动物模型和突变检测系统, 用于哺乳动物细胞致癌物质的诱变检测。其中, 转基因大蓝 (简称 BB) 小鼠和λ选择cII突变检测系统是由该组和许多其他研究组在世界范围内的致突变实验所使用的1,2, 3,4,5,6,7,8,9。在过去的16年中, 我们研究了各种化学和/或物理剂的诱变效应, 这些转基因动物或其相应的胚胎成纤维细胞培养的试验化合物处理, 并随后分析了cII转基因的表型和基因型由λ选择cII化验和 DNA 测序, 分别为10,11,12,

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Protocol

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1. 小鼠胚胎成纤维细胞的基因组 DNA 分离

注意: 根据发布的协议53, 原代小鼠胚胎成纤维细胞与 C57BL/6 遗传背景的 BB 转基因小鼠胚胎分离。此协议的起始材料由 1 x 106到 1 x 107胚胎成纤维细胞, 由测试复合与控制处理。使用标准方法收集和计数这些单元格在引用10、54、55中描述。

  1. 准备缓冲 A (0.3 米蔗糖, 60 毫米氯化钾, 15 毫米氯化钠, 60 毫米三盐酸, ph 值 8.0, 0.5 毫米胺, 0.15 毫米胺, 和2毫米 edta), 缓冲 B (150 毫米氯化钠和5毫米 edta, ph 7.8) 和缓冲 C (20 毫米三盐酸, ph 8。0, 20 毫米氯化钠, 20 毫米 EDTA, 1% SDS), 并保持室温 (RT), 长达一年54,55。
  2. 并用重悬细胞在2–4毫升缓冲区 a 在15毫升锥形离心管通过反复吹打上和下使用宽口径1000µL 吸管提示。
    3. <....

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Results

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根据数据分布情况, 参数化或非参数测试用于确定治疗和控制组之间的cII突变频率差异的意义 (即、诱导与自发突变频率).不同治疗组诱导的cII突变频率的比较是由各种 (配对的) 统计试验 (如适用) 进行的。Adams 和 Skopek 的超几何测试通常用于比较整个诱导和自发突变谱57, 尽管其他测试 (如χ2测试或方差分析) 也可用于比较频率在诱导-和控制突变谱之间, 或在不同的化学物质/药剂引起的各种突变光谱中, 或在相同的剂量变化中, 每种特定类型的突变 (例如、过渡、颠换、插入或删除)化学/代理。

图 3是对已发表的研究中的变种人频率数据的汇编, 我们已经表明, 用各种化学物质治疗小鼠胚胎成纤维细胞的相对cII突变频率增加的程度和.......

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Discussion

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λ选择cII检测用于检测从 BB 啮齿动物的器官/组织中提取的细胞基因组 DNA 中回收的cII转基因中的突变 (3)。这些转基因动物的基因组包含多个串联拷贝的染色体集成λLIZ 穿梭载体, 运载cII (294 bp) 和lacI (1080 bp) 转基因, 作为突变的报告基因1,2,25. λ选择cII检测的基础是从转基因动物细胞/组织的基因组 DNA 中检索λLIZ 梭载体, 然后将被解救的载体包装成λ噬菌体头, 从而感染合适的宿主。大肠杆菌。随后, 受感染的细菌在选择性条件下生长, 以便在cII转基因中评分和分析突变 (见图 1)1,

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Disclosures

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所有的作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢所有同事和合作者对我们最初的研究所作的贡献, 这份手稿中的结果已经在本稿中提到 (为了说明目的)。作者的工作得到了国家卫生研究院牙科和颅面研究研究所 (1R01DE026043) 和加州大学烟草相关疾病研究计划 (ab) 的资助 (TRDRP-26IR-0015) 和 ST (TRDRP-25IP-0001)。研究的发起者在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释、报告撰写或提交出版物的决定中都没有作用。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
琼脂MO 生物实验室公司12112-05细菌级
BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒Thermo Fisher Scientific4337455无
酪蛋白蛋白胨Alfa AesarH26557无
明胶J. T. Baker2124-01甘
油Fisher ScientificBP 229-1 / M-13750无
LB 琼脂Fisher ScientificBP 9724-500无
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen810450 次 PCR 纯化反应
乙酸钠三水合Fisher ScientificM-15756无
Taq5000 DNA 聚合酶 Qiagen201207none
盐酸硫胺素Macron Fine Chemicals2722-57none
Transpack 包装提取物Stratagene Corp.，被 BioReliance 收购 |Sigma-Aldrich 公司20022350 次包装反应
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4无
TryptonBiosciencesRC-110无
粉 物

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.

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Lambda Select cII Mutation AssayGenomic DNA IsolationLambda Shuttle Vector RecoveryBacteriophage PackagingHost Bacteria InfectionSelective CulturingcII Mutant ScoringDNA Sequence AnalysisMutagenicity TestingTransgenic Rodent Cells

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