我们描述了一种针对转基因啮齿类动物或经特定化学/物理因素处理的相应动物的培养细胞中进行Lambda Select cII突变检测的详细方案。该方法已广泛用于哺乳动物细胞中致癌物的致突变性检测。
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本文内容
摘要
摘要
已开发出多种转基因动物模型和突变检测系统，用于在哺乳动物细胞中对致癌物进行致突变性测试。其中，转基因小鼠和λ（Lambda）Select系统 cII 突变检测系统已被全球众多研究团队用于致变性实验。本文中，我们详细介绍一种用于λ选择的详细实验方案 cII 突变检测实验，可应用于经化学/物理因子处理的转基因小鼠/大鼠的培养细胞或相应动物个体。该实验方案包括以下步骤：（1）从经处理的转基因动物的细胞或器官/组织中分离基因组DNA 体外 或 体内，分别与测试化合物作用；（2）回收携带突变报告基因的λ穿梭载体即, cII 从基因组DNA中回收转基因；(3) 将回收的载体包装成具有感染性的噬菌体；(4) 感染宿主细菌并在选择性条件下培养，以促进诱导型载体的扩增 cII 突变；以及（5）评分 cII-突变体及DNA序列分析以确定 cII 突变频率和突变谱。
引言
已开发出多种转基因动物模型和突变检测系统，用于在哺乳动物细胞中对致癌物进行致突变性测试。其中，转基因 Big Blue（以下简称 BB）小鼠及 λ Select cII 突变检测系统已被本研究组及全球众多其他研究团队广泛应用于致突变性实验1,2,3,4,5,6,7,8,9。在过去16年中，我们利用这些转基因动物或经受试化合物处理的相应胚胎成纤维细胞培养物，研究了多种化学和/或物理因素的致突变效应，并分别通过 λ Select cII 检测法和DNA测序技术对cII 转基因的表型和基因型进行了分析10,11,1....
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方案
1. 小鼠胚胎成纤维细胞基因组DNA的提取
注意：根据已发表的实验方案，从小鼠胚胎中分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，这些胚胎来源于具有C57BL/6遗传背景的BB转基因小鼠53本方案的起始材料为 1 × 106 至 1 × 107 经测试化合物处理的胚胎成纤维细胞 与 对照。使用标准方法收获和计数这些细胞的步骤详见参考文献10,54,55.
- 预先配制缓冲液 A（0.3 M 蔗糖，60 mM KCl，15 mM NaCl，60 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5 mM 精脒，0.15 mM 精胺，和 2 mM EDTA）、缓冲液 B（150 mM NaCl 和 5 mM EDTA，pH 7.8）以及缓冲液 C（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，20 mM NaCl，20 mM EDTA，和 1% SDS），并在室温（RT）下保存，最长可保存一年54,55。
- 在 15 mL 圆锥形离心管中，使用宽口 1,000 ....
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结果
根据数据分布情况，采用参数检验或非参数检验来确定差异的显著性 cII 处理组与对照组之间的突变频率即，诱导突变频率与自发突变频率）。诱导突变频率的比较 cII 通过适用的各种（成对）统计学检验方法，对不同处理组间的突变频率进行比较。通常采用Adams和Skopek提出的超几何检验法来比较总体诱导突变谱与自发突变谱57，尽管其他检测方法，例如 χ2 检验或方差分析（ANOVA）也可用于比较每种特定类型突变的发生频率（例如，诱导突变谱与对照突变谱之间，或由不同化学物质/试剂、或同一化学物质/试剂的不同剂量所诱导的各个突变谱之间的转换、颠换、插入或缺失
图3 汇总了已发表研究中的突变频率数据，我们已证明，在经不同化学物质和/或物理因素处理的小鼠胚胎成纤维细胞中.......
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讨论
λ Select cII 检测法用于检测从 BB 啮齿类动物器官/组织来源细胞的基因组 DNA 中回收的 cII 转基因中的突变3。这些转基因动物的基因组中含有多个串联重复的染色体整合型 λLIZ 穿梭载体拷贝，该载体携带 cII（294 bp）和 lacI（1,080 bp）转基因，作为突变报告基因1,2,25。λ Select cII 检测法基于从转基因动物细胞/组织的基因组 DNA 中回收 λLIZ 穿梭载体，随后将 rescued 载体包装进 λ 噬菌体头部，以感染合适的大肠杆菌（E. coli）宿主。接着，将感染的细菌在选择性条件下培养，以便对 cII 转基因中的突变进行计数和分析（见图1）
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
我们谨向所有同事和合作者致以谢意，感谢他们对我们原始研究的贡献，本文中引用了这些研究的结果（用于说明目的）。作者的研究工作得到了美国国立卫生研究院下属的国立牙科与颅面研究所基金（1R01DE026043）对AB的资助，以及加州大学烟草相关疾病研究计划对AB（TRDRP-26IR-0015）和ST（TRDRP-25IP-0001）的资助。本研究的资助方在研究设计、数据收集、数据分析、数据解释、报告撰写以及决定投稿发表等过程中均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | 细菌学级 |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | 无 |
| 酪蛋白胨 | Alfa Aesar | H26557 | 无 |
| 明胶 | J. T. Baker | 2124-01 | 粉末 |
| 甘油 | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | 无 |
| LB 琼脂 | Fisher Scientific | BP 9724-500 | 无 |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 8104 | 50 次 PCR 纯化反应 |
| 三水合乙酸钠 | Fisher Scientific | M-15756 | 无 |
| Taq5000 DNA 聚合酶 | Qiagen | 201207 | 无 |
| 盐酸硫胺素 | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | 无 |
| Transpack 包装提取物 | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 次包装反应 |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | 无 |
| 胰蛋白胨 | Biosciences | RC-110 | 无 |
参考文献
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R.
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