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方法文章

胸膜瘤细胞中通过脱硫生物素-链霉亲和素亲和介导的RNA相互作用蛋白纯化

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DOI：

10.3791/57516

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2018年4月25日

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

本文内容

摘要

对含有富含腺嘌呤元件（ARE）基序的合成25核苷酸RNA寡核苷酸进行脱硫生物素标记，可实现细胞质ARE结合蛋白的特异性结合。

摘要

体外 RNA 拉下实验（in vitro RNA-pulldown）在鉴定识别特定 RNA 结构和基序的 RNA 结合蛋白的方案初期仍被广泛使用。在本 RNA 拉下实验方案中，商业合成的 RNA 探针在 RNA 链的 3' 末端被标记上一种生物素的修饰形式——脱硫生物素（desthiobiotin），该标记物可与链霉亲和素可逆结合，从而允许在更接近生理条件的情况下洗脱结合的蛋白质。RNA-脱硫生物素通过与磁珠上的链霉亲和素相互作用而被固定，随后用于富集特异性与目标 RNA 相互作用的蛋白质。实验所用的蛋白质来源为间皮瘤细胞胞质组分中的非变性且具有活性的蛋白质。本文所述方法可用于检测已知 RNA 结合蛋白与一段包含目标序列、长度为 25 个核苷酸（nt）的 RNA 探针之间的相互作用。该方法有助于完善通过报告载体实验鉴定出的 RNA 分子中稳定或非稳定元件的功能表征。

引言

基因表达及基因产物的最终水平可通过影响mRNA的稳定性与mRNA翻译速率而受到严密调控1这些转录后调控机制通过非编码RNA和/或RNA结合蛋白（RBPs）与靶向mRNA的相互作用来实现。通常发挥作用的是mRNA的3'非翻译区（3' UTR——属于基因组的非编码部分）2) 含有特定的 顺式-调控元件（CRE），可被识别 转录-作用因子，如miRNA或RBPs3研究最为深入的 顺式位于3'非翻译区（3' UTR）的一种富含腺嘌呤的元件（ARE）基序可被特定的AU结合蛋白（AUBP）识别，进而诱导mRNA降解/去腺苷酸化（ARE介导的衰变）或促进mRNA稳定4.

calretinin mRNA（CALB2）的3'非翻译区（3' UTR）长度为573 bp，根据生物信息学工具AREsite2的预测，其中包含一个假定的AUUUA五聚体。5与假定的ARE基序的存在一致，pmirGLO载体报告基因实验表明该元件在CALB2 mRNA中具有稳定作用6最后， 体外 采用RNA下拉实验鉴定通过ARE基序稳定calretinin mRNA的AUBP。

由于所有非编码RNA均与蛋白质相互作用7， 这些 体外 RNA 拉下实验是一种优良且首选的方法，用于鉴定与 RNA 相互作用的分子，以帮助解析其分子机制。在本 RNA 拉下实验中，使用 commercially synthesized RNA 探针，这些探针在 RNA 链的 3' 末端标记了一种生物素的修饰形式（desthiobiotin）。RNA-desthiobiotin 通过与磁珠上的链霉亲和素结合而被固定，随后用于富集特异性结合目标 RNA 的蛋白质。蛋白质来源为间皮瘤细胞胞质组分中的非变性且具有活性的蛋白质。与 RNA 结合的蛋白质从磁珠上洗脱后，经 12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离，转至膜上，并用不同的抗体进行检测。 关键词：RNA 拉下实验，desthiobiotin，链霉亲和素磁珠，RNA 相互作用蛋白，SDS-PAGE，间皮瘤细胞，胞质蛋白，抗体探针

在标准的链霉亲和素-生物素亲和纯化过程中，需要使用强烈的变性条件来破坏牢固且不可逆的生物素-链霉亲和素结合，从而洗脱结合的蛋白质8，但这可能导致蛋白质复合物的解离。与生物素不同，脱硫生物素可逆地结合链霉亲和素，并可通过含生物素的缓冲溶液进行竞争性置换，从而实现温和洗脱蛋白质，同时避免天然生物素化分子的共纯化9，表明该技术非常适合在天然条件下分离天然状态的蛋白质复合物。

体外结合条件和严谨性（由盐浓度、还原剂和去垢剂百分比决定）应尽可能接近细胞内的实际情况，以鉴定真实的体内相互作用。本文所采用的结合条件此前已被证实适用于鉴定HuR作为一种AU结合蛋白10。该方法可节省时间，因为优化合适的结合条件通常耗时且具有挑战性。此外，本方法可作为任何RNA下拉实验的起始方案，并可通过调整盐和去垢剂的浓度、改变甘油百分比以及添加其他盐类逐步优化。此外，我们还证明，即使是一个仅含五聚体ARE模体的短至25个核苷酸的RNA探针，也可用于验证其与特定AUBP的相互作用。

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方案

1. 细胞质与核蛋白组分的制备

  1. 在T150细胞培养瓶中接种4 × 106个ACC-MESO-4细胞，使用添加10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基进行培养。当细胞融合度达到80–90%（约5–5.5 × 106个细胞）时，开始提取细胞核和细胞质组分的蛋白质。
    注意：ACC-MESO-4细胞系购自RIKEN生物资源中心11。
  2. 吸除培养基，加入15 mL 1× PBS洗涤细胞，轻轻倾斜培养瓶数次后吸除PBS。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，将培养瓶置于37 °C孵育3分钟。
    注意：在显微镜下观察细胞是否脱落；若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶底部3次于手掌上。
  3. 加入7 mL含10% FBS、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基，将细胞收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
  4. 吸除上清液，用1.5 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，转移至1.5 mL微量离心管中，在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
    注意：从本步骤起，所有离心操作均需在4 °C进行，并将所有试剂置于冰上。
  5. 用1.5 mL预冷的1× PBS重悬细胞沉淀，在500 × g、4 °C条件下离心3分钟，弃去上清液。
    注意：细胞核提取所需CER I、CER II和NER试剂的体积分别为细胞沉淀压实体积的10倍、0.55倍和5倍；以下方案按细胞沉淀体积20 µL计算。建议仅配制所需量的CER I试剂。
  6. 加入200 µL预冷的细胞质提取试剂（CER I），并添加2 µL 1×蛋白酶抑制剂，例如，将1片蛋白酶抑制剂（无EDTA型）溶于500 µL水中，配制成100×储存液。该体积的CER I试剂足以裂解20 µL细胞沉淀。
    1. 为估算细胞沉淀的压实体积，可将含有细胞沉淀的离心管与装有10、20、50或100 µL 1× PBS的1.5 mL离心管进行对比。
  7. 剧烈涡旋振荡15秒以重悬细胞沉淀，冰上孵育10分钟。向管中加入11 µL预冷的细胞质提取试剂II（CER II），剧烈涡旋5秒，再于冰上孵育1分钟。
  8. 剧烈涡旋5秒后，在16,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。将上清液转移至预冷的洁净离心管中。此上清液即为细胞质蛋白组分，用于后续RNA pull-down实验。
  9. 用100 µL预冷的核提取试剂（NER）重悬剩余沉淀，并加入1 µL蛋白酶抑制剂（100×），剧烈涡旋15秒。建议仅配制所需量的含蛋白酶抑制剂的NER试剂。
  10. 冰上孵育40分钟，期间每隔10分钟短暂涡旋15秒。
  11. 在16,000 × g条件下离心10分钟，将上清液（即核蛋白组分）转移至洁净的预冷离心管中。
  12. 立即采用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度（见材料表）。为控制各组分蛋白纯度，应进行免疫印迹分析（图1），检测α-微管蛋白（仅在细胞质组分中阳性）和聚ADP-核糖聚合酶（PARP，仅在核组分中阳性）。蛋白检测方法参见第4节。
  13. 为保持蛋白活性及其天然状态，将细胞质和核提取物分别分装为25 µL每份。将分装样品置于液氮中速冻5秒，直接储存于-80 °C。

2. 使用脱硫生物素标记RNA

  1. 将RNA探针进行商业合成并经HPLC纯化。用无核酸酶水重悬至10 µM。
    注意：探针序列列于 表1.
  2. 每次RNA pulldown反应使用50 pmol RNA。除用于标记RNA寡核苷酸3'末端的30% PEG外，所有试剂均需解冻后置于冰上保存。
  3. 将5 µL浓度为10 µM的RNA探针（标记为CALB2 3' UTR (ARE)、CALB2 3' UTR (mtARE)和Unrelated-RNA (IRE)）转移至0.5 mL薄壁微量离心管中，放入PCR仪于85 °C孵育5分钟。随后立即将离心管置于冰上。
    注意：此步骤非常重要，因为它有助于RNA探针的松弛，使其更易于标记。
  4. 对于一个30 µL的反应体系，向含有RNA的离心管中加入以下10 µL混合液：3 µL无核酸酶水、3 µL 10x RNA连接酶反应缓冲液、1 µL RNase抑制剂（40 U/µL）、1 µL去硫代生物素化胞苷双磷酸（1 mM）和2 µL T4 RNA连接酶（20 U/µL）。
    注意：为准备3个样本外加3.2个余量的主混合液A，将9.6 µL无核酸酶水、9.6 µL 10× RNA连接酶反应缓冲液、3.2 µL RNase抑制剂（40 U/µL）、3.2 µL脱硫生物素标记的胞苷双磷酸（1 mM）和6.4 µL T4 RNA连接酶（20 U/µL）混合。
  5. 加入15 µL 30% PEG至反应体系中，小心操作。使用另一枪头混匀反应液。于16 °C孵育过夜。
  6. 第二天，准备以下试剂：5 M NaCl（新鲜/无核酸酶），氯仿:异戊醇按24:1比例混合例如每反应 - 96 µL 氯仿和 4 µL 异戊醇、预冷的100%乙醇以及预冷的70%乙醇。
  7. 向RNA标记反应管中加入70 µL无核酸酶水。加入100 µL氯仿：异戊醇，短暂涡旋振荡。在13,000 x g离心3分钟。小心移取上层相并转移至新的无核酸酶1.5 mL离心管中；避免接触下层相。
  8. 加入10 µL 5 M NaCl、1 µL糖原和300 µL预冷的100%乙醇。将离心管置于-20 °C环境中2小时。
    注意：此步骤完成后，实验可于次日继续进行。
  9. 在 13,000 x g、4 °C 条件下离心 15 分钟。小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀。加入 300 µL 冰冷的 70% 乙醇，再次在 13,000 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟。
  10. 完全弃去上清液，将沉淀在空气中干燥（15 分钟）。用 20 µL 无核酸酶水重悬沉淀。
    注意：应在同一天进行RNA下拉实验。
  11. 将RNA在90 °C孵育2分钟，然后置于冰上。在链霉亲和素磁珠预清洗的下一步操作期间，将标记的RNA置于冰上。
    注意：较长的孵育时间可能会损伤RNA探针。

3. RNA-蛋白质下拉实验

  1. 链霉亲和素磁珠的预清洗及与脱硫生物素标记RNA的孵育
    1. 每50 pmol RNA使用50 µL链霉亲和素磁珠。但应根据具体实验条件进行优化。
    2. 将链霉亲和素磁珠管涡旋振荡15秒，使用剪口移液枪头迅速吸取200 µL（主混合液；足够用于3+1个反应）至洁净的1.5 mL防脱管中。将管子置于磁力架上，使磁珠吸附于管壁一侧，静置1分钟，吸除重悬液。
    3. 清洗磁珠：从磁力架上取下管子，加入400 µL 0.1 M NaOH、0.05 M NaCl溶液，轻轻吹打数次。再将管子放回磁力架，静置1分钟，吸除上清液。重复此步骤一次。
    4. 用200 µL 100 mM NaCl溶液清洗磁珠，弃去上清液。
    5. 从磁力架上取下管子，加入200 µL 20 mM Tris（pH 7.5），通过移液吹打重悬磁珠，再将管子放回磁力架，静置1分钟，吸除上清液。重复此步骤一次。
    6. 从磁力架上取下管子，加入200 µL 1× RNA捕获缓冲液，短暂涡旋振荡使链霉亲和素磁珠重悬。用剪口移液枪头取50 µL磁珠悬液，分别加入各标记好的RNA管中。在室温下于滚轴混合仪上孵育30分钟。
  2. 蛋白质与RNA的结合
    1. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，吸除上清液。
    2. 向磁珠中加入50 µL 20 mM Tris（pH 7.5），通过移液吹打重悬磁珠。将管子置于磁力架上，静置1分钟，吸除上清液。重复此步骤一次。
    3. 向磁珠中加入100 µL 1× 蛋白质-RNA结合缓冲液，通过移液吹打重悬磁珠。
    4. 同时，配制以下混合液：10 µL 10× 蛋白质-RNA结合缓冲液、30 µL 50%甘油、50 µg胞质蛋白，加无核酸酶水至总体积100 µL。
      注：为3个样本额外准备一份主混合液B（按3.3份量）：33 µL 10× 蛋白质-RNA结合缓冲液、99 µL 50%甘油、165 µg胞质蛋白，加无核酸酶水至总体积330 µL。将主混合液B管置于冰上保存。
    5. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，吸除上清液。加入100 µL主混合液B，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。将反应管在4 °C下于滚轴混合仪上孵育60分钟。
  3. 清洗与洗脱
    1. 将管子置于磁力架上，收集上清液（即流穿液，FT），转移至新管中。
      注：将此流穿液（FT）置于冰上保存，用于后续分析。
    2. 向磁珠中加入100 µL 1× 洗涤缓冲液，轻轻吹打重悬，再放回磁力架，静置1分钟，弃去上清液。重复此步骤两次。
    3. 向磁珠中加入40 µL洗脱缓冲液，通过移液吹打混匀，在37 °C下于管式振荡器（950 rpm）中孵育30分钟。
    4. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，收集洗脱液（即洗脱组分，E）。置于冰上，用于后续分析。
      注：在此步骤中，每个检测的RNA探针均包含一份流穿液（FT）和一份洗脱液（E）样本。

4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析

注意：本节所用缓冲液的配方见表2。按照Laemmli方法进行Western印迹实验12。

  1. 手工制备12% SDS-PAGE凝胶（10孔，1.5 mm间隔器，66 µL）。配制分离胶混合液：30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺储备液4 mL，下层Tris缓冲液2.4 mL，dH2O 3.2 mL，TEMED 9.6 µL，10%过硫酸铵溶液（APS）96 µL。配制浓缩胶混合液：dH2O 3.25 mL，30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺储备液0.5 mL，上层Tris缓冲液1.3 mL，TEMED 10 µL，10% APS 20 µL。
  2. 向FT样品中加入16.6 µL 6x Laemmli缓冲液（例如，14 mL Tris/HCl/SDS pH 6.8（上层Tris缓冲液），2 g SDS，1.86 g DTT，6 mL甘油，0.012%溴酚蓝；-20 °C保存），向E样品中加入6.6 µL 6x Laemmli缓冲液。将样品在95 °C孵育5 min。
  3. 上样（FT样品20 µL，整个洗脱液约40 µL），先以60 V电泳30 min，随后以20 V过夜继续电泳。
  4. 使用半干转印系统，在15 V条件下将蛋白转印至PVDF膜上，持续80 min。
    注意：在进行蛋白转印前，必须对PVDF膜进行活化。将膜在100%甲醇中孵育1 min，随后在超纯水中孵育2 min。
  5. 蛋白转印完成后，将SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝染色液染色3 h，随后用超纯水洗涤三次，每次30 min。
  6. 蛋白转印结束后，将PVDF膜室温干燥1 h。按照步骤4.5所述方法重新活化膜。用含5% BSA的1x TTBS封闭膜1 h。
  7. 将膜与一抗孵育：HuR或间皮素，均以含5% BSA的1x TTBS按1:1000稀释，室温孵育4 h或4 °C过夜。
  8. 用1x TTBS洗涤膜三次，每次7 min，然后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠二抗孵育，二抗按1:10,000比例用含5% BSA的1x TTBS稀释。
  9. 采用增强型化学发光法并结合数字成像系统检测蛋白信号。

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结果

在本实验中，一段长度为25个核苷酸的钙视网膜蛋白3片段' UTR harboring ARE motif (CALB2 3' 使用 UTR (ARE) 25-nt 来测试其是否与已知的 mRNA 稳定因子——人抗原 R (HuR) 蛋白特异性结合。为测试 ARE 元件的特异性，使用了 25-nt RNA 探针 CALB2 3。' 含有ARE基序突变的UTR (mtARE)被使用，该突变先前已被证明可消除ARE基序的稳定化效应。6第三条 RNA 探针为阴性对照，是一种 28 个核苷酸的非相关 RNA，包含明确界定的铁反应元件（非相关 RNA (IRE)），已知可与胞质铁反应蛋白结合。13,14由于 HuR 主要定位于细胞核内，但在细胞质中发挥 mRNA 稳定剂的功能15通过核质分离提取法，从细胞质中获取活性蛋白质。

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讨论

3'非翻译区属于非编码基因组3，所有非编码RNA均可通过与蛋白质相互作用来发挥其功能7当发现哺乳动物基因组被广泛转录并产生大量长链非编码RNA时16，新出现的证据表明，这些长链非编码RNA通过与染色质重塑复合物相互作用，在调控基因表达中发挥功能17。这一知识是通过RNA下拉实验获得的。因此，要开始解析特定RNA的相互作用分子，第一步可以是 体外 生化实验（如RNA下拉实验），因其操作简便。

值得注意的是，不仅RNA的序列基序，其二级结构也在RNA功能中起着关键作用，因为这些结构会形成与蛋白质相互作用所必需的结构域。RNA二级结构在生理条件和体外（in vitro）条件下均可能发生变化，因此RNA下拉实验可能导致假阳性结果的出现。例如，RNA下拉实验曾鉴定出EZH2（多梳抑制复合物2（PRC2）的一个组分）为X染色体失活特异转录本（Xist）...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由瑞士国家科学基金会Sinergia项目（资助号：CRSII3 147697）、应用癌症研究基金会以及苏黎世癌症协会提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NE-PER 核与胞质提取试剂盒赛默飞世尔科技 78833
Pierce蛋白酶抑制剂片剂，无EDTA赛默飞世尔科技A32965
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒赛默飞世尔科技23225
Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒 赛默飞世尔科技20164包含磁珠，因此试剂盒需在4℃保存 °C
Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation 试剂盒 赛默飞世尔科技20163该试剂盒是 "Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒"，需在 -20 保存 °C 与下拉试剂盒不同（4 °C）。
DynaMag-2  磁力架赛默飞世尔科技12321D
抗-HuR（小鼠）单克隆抗体赛默飞世尔科技-该抗体包含在 Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒中  - 1:1000 稀释于 5% BSA 1x TTBS 中 — 兔抗小鼠二抗 1:10,000 稀释于 5% BSA 1x TTBS 中
抗- α - 微管蛋白（小鼠）单克隆抗体圣克鲁斯80355% BSA 1x TTBS 中 1:1000 稀释的山羊抗小鼠二抗，5% BSA 1x TTBS 中 1:10,000 稀释的兔抗小鼠二抗
抗PARP（兔）多克隆抗体细胞信号传导95425% BSA 1x TTBS 中 1:1000 稀释的山羊抗兔二抗，5% BSA 1x TTBS 中 1:10,000 稀释
抗-间皮素（小鼠）单克隆抗体 Rockland200-301-A87
二抗山羊抗兔抗体细胞信号传导7074
二抗：兔抗小鼠抗体Sigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 培养基Sigma-AldrichR8758
FBS - 过滤牛血清Pan Biotech P40-37500
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）Sigma-Aldrich P4333
L-谷氨酰胺溶液（200 mM）Sigma-Aldrich G7513
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)Gibco（Life Technologies 公司旗下品牌） 25200-056
Mini-PROTEAN 3 电泳槽伯乐（Bio-Rad）1653301
Mini Protean 系统玻璃板 Bio-Rad1653308
Mini-PROTEAN 间隔板，带1.5 mm集成间隔器伯乐（Bio-Rad）1653312
Mini-PROTEAN 梳子，10孔，1.5 mm，66 µL伯乐（Bio-Rad）1653365
Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽制胶模块伯乐（Bio-Rad）1658050
RNaseZap RNase 去污染溶液赛默飞世尔科技AM9780
Rotiphorese 凝胶 30 - 水相 30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺储存液，配比为 37.5:1罗斯3029
20% SDS PanReac AppliChemA3942
PVDF 转印膜 Perkin ElmerNEF1002需在纯甲醇中孵育1分钟以活化，随后在水中洗涤2分钟 
Trans-Blot SD 半干式转印槽 Bio-Rad1703940
Clarity Western ECL 底物伯乐（Bio-Rad）1705061
FusionFX  数字成像仪Vilber-
RNA寡核苷酸合成Mycrosynth AG，瑞士-合成规模 - 0.04 µmol - HPLC 纯化
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7030
6 M 盐酸（HCl）PanReac AppliChem182883.1211
超纯 1 M Tris，pH 7.5 赛默飞世尔科技15567027
甘油 赛默飞世尔科技1790450% 无菌分装，保存于 -20°C
Pierce 链霉亲和素磁珠 赛默飞世尔科技88817请注意，这些磁珠的平均直径为1 µ米（范围为0.5 - 1.5） µm）。此外，Dynabeads-M280 Streptavidin 是一种均一粒径为 2.8 的磁珠 µm，也用于RNA下拉实验，但需注意这可能影响纯化过程。
TEMEDSigma-AldrichT9281
过硫酸铵 Sigma-AldrichA3678
考马斯亮蓝 G-250ApplichemA3480
十四至十八水合硫酸铝 Sigma-Aldrich368458
正磷酸 ApplichemA0637

参考文献

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胸膜瘤细胞中通过脱硫生物素-链霉亲和素亲和介导的RNA相互作用蛋白纯化
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