对含有富含腺嘌呤元件（ARE）基序的合成25核苷酸RNA寡核苷酸进行脱硫生物素标记，可实现细胞质ARE结合蛋白的特异性结合。
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本文内容
摘要
摘要
体外 RNA 拉下实验（in vitro RNA-pulldown）在鉴定识别特定 RNA 结构和基序的 RNA 结合蛋白的方案初期仍被广泛使用。在本 RNA 拉下实验方案中，商业合成的 RNA 探针在 RNA 链的 3' 末端被标记上一种生物素的修饰形式——脱硫生物素（desthiobiotin），该标记物可与链霉亲和素可逆结合，从而允许在更接近生理条件的情况下洗脱结合的蛋白质。RNA-脱硫生物素通过与磁珠上的链霉亲和素相互作用而被固定，随后用于富集特异性与目标 RNA 相互作用的蛋白质。实验所用的蛋白质来源为间皮瘤细胞胞质组分中的非变性且具有活性的蛋白质。本文所述方法可用于检测已知 RNA 结合蛋白与一段包含目标序列、长度为 25 个核苷酸（nt）的 RNA 探针之间的相互作用。该方法有助于完善通过报告载体实验鉴定出的 RNA 分子中稳定或非稳定元件的功能表征。
引言
基因表达及基因产物的最终水平可通过影响mRNA的稳定性与mRNA翻译速率而受到严密调控1这些转录后调控机制通过非编码RNA和/或RNA结合蛋白（RBPs）与靶向mRNA的相互作用来实现。通常发挥作用的是mRNA的3'非翻译区（3' UTR——属于基因组的非编码部分）2) 含有特定的 顺式-调控元件（CRE），可被识别 转录-作用因子，如miRNA或RBPs3研究最为深入的 顺式位于3'非翻译区（3' UTR）的一种富含腺嘌呤的元件（ARE）基序可被特定的AU结合蛋白（AUBP）识别，进而诱导mRNA降解/去腺苷酸化（ARE介导的衰变）或促进mRNA稳定4.
calretinin mRNA（CALB2）的3'非翻译区（3' UTR）长度为573 bp，根据生物信息学工具AREsite2的预测，其中包含一个假定的AUUUA五聚体。5与假定的ARE基序的存在一致，pmirGLO载体报告基因实验表明该元件在CALB2 mRNA中具有稳定作用6最后， 体外 采用RNA下拉实验鉴定通过ARE基序稳定calretinin mRNA的AU....
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方案
1. 细胞质与核蛋白组分的制备
- 在T150细胞培养瓶中接种4 × 106个ACC-MESO-4细胞，使用添加10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基进行培养。当细胞融合度达到80–90%（约5–5.5 × 106个细胞）时，开始提取细胞核和细胞质组分的蛋白质。
注意：ACC-MESO-4细胞系购自RIKEN生物资源中心11。 - 吸除培养基，加入15 mL 1× PBS洗涤细胞，轻轻倾斜培养瓶数次后吸除PBS。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，将培养瓶置于37 °C孵育3分钟。
注意：在显微镜下观察细胞是否脱落；若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶底部3次于手掌上。 - 加入7 mL含10% FBS、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基，将细胞收集至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，用1.5 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，转移至1.5 mL微量离心管中，在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
注意：从本步骤起，所有离心操作均需在4 °C进行，并将所有试剂置于冰上。 - 用1.5 mL预冷的1× PBS重悬细胞沉淀，在....
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结果
在本实验中，一段长度为25个核苷酸的钙视网膜蛋白3片段' UTR harboring ARE motif (CALB2 3' 使用 UTR (ARE) 25-nt 来测试其是否与已知的 mRNA 稳定因子——人抗原 R (HuR) 蛋白特异性结合。为测试 ARE 元件的特异性，使用了 25-nt RNA 探针 CALB2 3。' 含有ARE基序突变的UTR (mtARE)被使用，该突变先前已被证明可消除ARE基序的稳定化效应。6第三条 RNA 探针为阴性对照，是一种 28 个核苷酸的非相关 RNA，包含明确界定的铁反应元件（非相关 RNA (IRE)），已知可与胞质铁反应蛋白结合。13,14由于 HuR 主要定位于细胞核内，但在细胞质中发挥 mRNA 稳定剂的功能15通过核质分离提取法，从细胞质中获取活性蛋白质。
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讨论
3'非翻译区属于非编码基因组3，所有非编码RNA均可通过与蛋白质相互作用来发挥其功能7当发现哺乳动物基因组被广泛转录并产生大量长链非编码RNA时16，新出现的证据表明，这些长链非编码RNA通过与染色质重塑复合物相互作用，在调控基因表达中发挥功能17。这一知识是通过RNA下拉实验获得的。因此，要开始解析特定RNA的相互作用分子，第一步可以是 体外 生化实验（如RNA下拉实验），因其操作简便。
值得注意的是，不仅RNA的序列基序，其二级结构也在RNA功能中起着关键作用，因为这些结构会形成与蛋白质相互作用所必需的结构域。RNA二级结构在生理条件和体外（in vitro）条件下均可能发生变化，因此RNA下拉实验可能导致假阳性结果的出现。例如，RNA下拉实验曾鉴定出EZH2（多梳抑制复合物2（PRC2）的一个组分）为X染色体失活特异转录本（Xist）.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由瑞士国家科学基金会Sinergia项目（资助号：CRSII3 147697）、应用癌症研究基金会以及苏黎世癌症协会提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NE-PER 核与胞质提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 78833 | |
| Pierce蛋白酶抑制剂片剂，无EDTA | 赛默飞世尔科技 | A32965 | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 23225 | |
| Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 20164 | 包含磁珠，因此试剂盒需在4℃保存 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation 试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 20163 | 该试剂盒是 "Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒"，需在 -20 保存 °C 与下拉试剂盒不同（4 °C）。 |
| DynaMag-2 磁力架 | 赛默飞世尔科技 | 12321D | |
| 抗-HuR（小鼠）单克隆抗体 | 赛默飞世尔科技 | - | 该抗体包含在 Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒中 - 1:1000 稀释于 5% BSA 1x TTBS 中 — 兔抗小鼠二抗 1:10,000 稀释于 5% BSA 1x TTBS 中 |
| 抗- α - 微管蛋白（小鼠）单克隆抗体 | 圣克鲁斯 | 8035 | 5% BSA 1x TTBS 中 1:1000 稀释的山羊抗小鼠二抗，5% BSA 1x TTBS 中 1:10,000 稀释的兔抗小鼠二抗 |
| 抗PARP（兔）多克隆抗体 | 细胞信号传导 | 9542 | 5% BSA 1x TTBS 中 1:1000 稀释的山羊抗兔二抗，5% BSA 1x TTBS 中 1:10,000 稀释 |
| 抗-间皮素（小鼠）单克隆抗体 | Rockland | 200-301-A87 | |
| 二抗山羊抗兔抗体 | 细胞信号传导 | 7074 | |
| 二抗：兔抗小鼠抗体 | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - 过滤牛血清 | Pan Biotech | P40-37500 | |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-谷氨酰胺溶液（200 mM） | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x) | Gibco（Life Technologies 公司旗下品牌） | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 电泳槽 | 伯乐（Bio-Rad） | 1653301 | |
| Mini Protean 系统玻璃板 | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN 间隔板，带1.5 mm集成间隔器 | 伯乐（Bio-Rad） | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN 梳子，10孔，1.5 mm，66 µL | 伯乐（Bio-Rad） | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽制胶模块 | 伯乐（Bio-Rad） | 1658050 | |
| RNaseZap RNase 去污染溶液 | 赛默飞世尔科技 | AM9780 | |
| Rotiphorese 凝胶 30 - 水相 30% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺储存液，配比为 37.5:1 | 罗斯 | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF 转印膜 | Perkin Elmer | NEF1002 | 需在纯甲醇中孵育1分钟以活化，随后在水中洗涤2分钟 |
| Trans-Blot SD 半干式转印槽 | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL 底物 | 伯乐（Bio-Rad） | 1705061 | |
| FusionFX 数字成像仪 | Vilber | - | |
| RNA寡核苷酸合成 | Mycrosynth AG，瑞士 | - | 合成规模 - 0.04 µmol - HPLC 纯化 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| 6 M 盐酸（HCl） | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| 超纯 1 M Tris，pH 7.5 | 赛默飞世尔科技 | 15567027 | |
| 甘油 | 赛默飞世尔科技 | 17904 | 50% 无菌分装，保存于 -20°C |
| Pierce 链霉亲和素磁珠 | 赛默飞世尔科技 | 88817 | 请注意，这些磁珠的平均直径为1 µ米（范围为0.5 - 1.5） µm）。此外，Dynabeads-M280 Streptavidin 是一种均一粒径为 2.8 的磁珠 µm，也用于RNA下拉实验，但需注意这可能影响纯化过程。 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 考马斯亮蓝 G-250 | Applichem | A3480 | |
| 十四至十八水合硫酸铝 | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| 正磷酸 | Applichem | A0637 |
参考文献
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 ....
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