逆行导管纳米颗粒注射至小鼠下颌下腺

摘要

下颌下腺的局部药物递送在理解唾液腺生物学以及开发新型治疗手段方面具有重要意义。本文介绍了一种经过改进且更为详细的经导管逆行注射方案，旨在提高递送的准确性和实验的可重复性。本文所展示的应用为聚合物纳米颗粒的递送。

摘要

唾液腺治疗的两个常见目标是预防和治愈自身免疫性或放射性损伤后出现的组织功能障碍。通过将生物活性化合物局部递送至唾液腺，可安全地实现比全身给药更高的组织药物浓度。此外，还可显著减少因腺体外组织蓄积所导致的脱靶效应。在这一背景下，逆行导管注射是一种广泛用于研究唾液腺生物学及病理生理学的方法。已有研究表明，通过逆行导管途径递送生长因子、原代细胞、腺病毒载体以及小分子药物，可在损伤情况下支持唾液腺功能。我们先前已证实，通过逆行导管注射纳米颗粒-siRNA策略可在放射损伤后维持唾液腺功能。本文详细描述了一种高效且可重复的经由沃顿管（Wharton's duct）向小鼠下颌下腺递送纳米材料的方法（图1）。我们阐述了如何进入口腔，并概述了插管沃顿管所需的操作步骤，同时在操作过程中通过若干观察指标进行质量控制。

引言

唾液腺功能障碍有多种病因，包括舍格伦综合征（一种由自身免疫介导的功能性分泌组织丧失）和放射性唾液减少症（RIH），后者是头颈部肿瘤放疗后常见的后遗症¹唾液功能的丧失会使个体易患口腔和全身感染、龋齿、消化和吞咽功能障碍、言语障碍以及重度抑郁症。^1,2,3因此，患者生活质量显著下降，且目前的干预措施仅限于缓解症状，而非治愈疾病⁴. 为了研究新的治疗方法 体内因此，将生物活性化合物直接施用于唾液腺具有重要意义。

逆行导管注射是一种将生物活性化合物直接递送至唾液腺并评估其在疾病、损伤或正常组织稳态条件下功效的重要方法。三大唾液腺分别为腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG），均通过排泄导管将分泌物排入口腔。小鼠下颌下腺的解剖结构允许通过舌下口腔底部的Wharton导管进行直接插管⁵。插管完成后，可将溶解的药物直接注入下颌下腺。逆行导管递送后，腺体周围的组织包膜限制了药物向腺体外的扩散，该包膜可调控与周围结构之间的物质交换⁶。人类下颌下腺及其导管结构与小鼠相似，在下颌下腺手术和唾液腺内镜检查中通常需要对其进行操作⁷。在人类和小鼠中，腮腺亦可通过颊黏膜上的Stensen导管进行通路获取⁸。

在辐射诱导的涎腺损伤（RIH）小鼠模型中，经导管逆行注射（SMG retroductal injection）已被用于递送多种治疗剂，包括生长因子、原代细胞、腺病毒载体、细胞因子以及抗氧化化合物，以调控细胞对损伤的反应，并减轻继发性组织损伤^{5,9,10,11,12,13,14,15,16}。逆行导管注射在临床上最显著的成功案例是：在头颈部癌症患者接受放疗后，通过该方法递送腺病毒载体，以定向表达水通道蛋白（Aquaporin 1；AQP1）¹⁷。

此前，我们已开发出一种经逆行导管注射的聚合物纳米颗粒-siRNA 系统，并证实其可有效保护唾液腺功能免受放射性损伤^11,18,19,20。作为前期工作的延伸，本文中我们展示了利用可负载并递送原本难溶性药物的荧光标记纳米颗粒（NP）进行逆行导管下颌下腺（SMG）注射的实验方案^21,22,23。

我们通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合方法合成了由苯乙烯-马来酸酐共聚物-嵌段-聚苯乙烯（PSMA）组成的两亲性嵌段共聚物纳米颗粒（NP），具体方法如前所述²¹。通过溶剂交换，这些聚合物可自发组装成具有疏水内核和亲水外壳的胶束型纳米颗粒结构²¹。纳米颗粒被标记了Texas-Red荧光染料，以便在不处死动物的情况下验证其向腺体的递送情况。活体动物成像及颌下腺免疫组织化学结果展示了注射后1小时和1天的情况。

这一经过改进且可重复的插管方案应能使其他研究者成功实现逆行导管注射。我们预计，这一优化的技术将在未来成为 体内 研究与治疗开发^24,25.

方案

全部 体内 以下程序已获罗切斯特大学罗切斯特动物资源委员会批准， 纽约

1. 准备

1. 使用带内置金属丝的32G颅内导管管路，截取3 cm长的管段，制成与管路长轴成约45°斜面的尖端。确认金属丝比管路至少长出1 cm。
2. 将50 µL的PSMA纳米颗粒溶液（图1），或其他注射材料，装入汉密尔顿注射器中。为降低注射过程中发生压力性损伤的风险，将去除金属芯的导管管路连接至注射器，并排出死腔体积。
3. 检查注射溶液，确保纳米颗粒完全溶解，以防止给药后导管阻塞。
4. 配制浓度为0.1 mg/mL的阿托品溶液。
   注意：由于阿托品对光敏感且会随时间降解，该溶液应在注射当天配制，并在使用前避光保存。

2. 胰管入口点的获取与可视化

1. 使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。
2. 使用 0.5 mL 注射器配合 29G × ½" 针头，通过腹腔注射无菌生理盐水配制的 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪麻醉小鼠。当小鼠对刺激无反应时，即可进行下一步操作，通常在注射后 5 至 10 分钟内发生。
   注意：该操作也可在异氟烷麻醉下进行，但需要使用可让口腔通路保持开放的定制鼻罩。
3. 为防止操作过程中眼睛干燥，应在眼部涂抹润滑剂，并将小鼠以俯卧位固定于定制平台上。
   注意：为维持口内操作的适当条件，所有工具在每次使用前均应进行消毒或灭菌。
4. 将上颌门齿固定在金属横梁上方以打开口腔，并使用弹性带在下颌门齿后方施加向下的张力（图 2A）。
5. 将小鼠置于体视显微镜下方并调整位置，以便观察下颌底部。
6. 使用定制的弧形钢制牵开器对颊黏膜双侧施加牵拉力，以扩大口腔开口。
7. 用钝头镊子夹住舌头并轻轻上提，以暴露口底，从而观察下颌下乳头。
   注意：乳头表现为舌下两侧的两个浅色突起（图 2B）。
8. 为便于观察及进一步在口腔内进行操作，可在舌头与颊黏膜之间放置棉球。

3. 导管插管与导管置入

1. 使用精细的弯镊夹住带导丝的导管管路。为在插管过程中获得最佳手动控制，应将管路与镊子的弯曲弧度对齐（图3A）。
2. 在解剖显微镜下，将镊子和导丝移入视野。
   注意：导丝应从管路末端伸出。
3. 使用导丝末端轻柔地对一侧下颌下乳头基部施加压力，造成一个微小的浅表黏膜穿刺（直径0.076 mm），以利于后续插入导管管路（直径0.25 mm）。若遇到阻力，应使用锋利的解剖剪为管路和导丝末端剪出新的斜面。
4. 穿刺完成后，撤出导丝，并在解剖显微镜下确认穿刺部位有唾液渗出。避免对导丝进行剧烈或突然的移动（无论是撤出还是插入），以防引起出血或破坏导管完整性。
5. 将导丝回撤至管路内部（图3B）。
6. 为确保注射管路能够顺利进入Wharton管开口，将带有导丝作为刚性引导的管路插入先前制作的穿刺孔中（图2C）。
   注意：若操作不够迅速，局部肿胀可能阻碍再次插入。
7. 为防止因长时间阻塞导管而产生反压，需暂时撤出管路。检查并确认在显微镜下可见下颌下乳头处存在开放的穿刺孔。若出现明显出血，应取出导丝，并在对侧下颌下乳头从步骤3.2重新开始尝试。
8. 在不移动小鼠的情况下，给予1 mg/kg阿托品溶液腹腔注射，以减少操作过程中的唾液分泌。等待5–10分钟。
9. 握住注射器管路末端，在解剖显微镜下将其插入开口处（图3C）。若遇到阻力，应剪出新的斜面末端并重新尝试。
10. 当管路就位进入下颌下乳头后，缓慢向前推进3–5 mm进入导管。随后松开镊子夹持的管路。
11. 为增强管路与下颌下乳头之间的密封性，用纱布轻轻按压界面处1分钟以吸干液体。
12. 检查确认在干燥过程中管路位置未发生移动。

4. 注射

1. 以 10 µL/min 的速率注射材料。观察以确认小鼠仍处于镇静状态，且无痛苦迹象（图 2D）。
   注意：注射 15–50 µL 的体积耐受性良好。注射较大体积可能导致气压性损伤。
2. 注射完成后，保持注射器压力 5 分钟，以提高材料在华通氏管和下颌下腺（SMG）内的滞留效果（图 4）。定期检查下颌下乳头，确保导管未从导管开口脱出。
3. 使用精细镊子夹住导管，轻柔地从下颌下乳头处撤出导管。
   注意：观察到少量液体从乳头流出属于正常现象。
4. 在将小鼠移离操作台前，取出口腔内的牵开器和棉球。
   注意：动物必须在恢复足够意识、能够维持胸卧位之前不得无人看管。此外，应确保小鼠在完全恢复前不与其他小鼠同笼饲养。

5. 验证与分析

注意：一个 体内 成像系统（IVIS）可用于评估注射后荧光标记纳米颗粒的滞留情况（如注射后1 h和24 h所示） 图5).

1. 为了更清晰地通过皮肤观察下颌下腺（SMG）内的荧光信号，可使用剃毛或化学脱毛剂去除覆盖在下颌下腺区域的腹部毛发。
   注意：在动物安乐死后，也可取出下颌下腺组织，用4%多聚甲醛固定过夜，并通过免疫组织化学染色，以确认荧光标记的纳米颗粒（NP）在注射后一天仍存在于组织中（图6）。

结果

通过逆行导管注射可将纳米颗粒（NPs）递送至小鼠下颌下腺（图1）。在此，我们递送了50 µg标记有Texas Red荧光染料的PSMA纳米颗粒。

正确放置小鼠可便于接触并清晰观察口腔底部（图2A-B）。下颌乳头可辨认为舌下两个肉质突起。在完成插管（图2C）和注射阿托品后，可将注射器导管插入下颌乳头（图2D）。

为便于插管，首先使用导管管路内的金属导丝在下颌下乳头处刺一个小孔（图3A）。完成此步骤后，应将导...

讨论

逆行导管注射对于唾液腺的局部药物递送至关重要。该技术可用于干燥综合征和放射性涎腺炎等疾病的治疗药物筛选^9,10,28。通过逆行导管注射将药物直接递送至下颌下腺，相较于全身给药具有显著优势，有望减少脱靶效应，包括免疫系统激活¹¹。在避免药物于周围组织蓄积的同时，实现局部药物递送的最大化，还可使治疗药物在更宽的剂量范围内进行测试，而这是全身给药难以达到的。

本文提供了一种详细且经过更新的方法，用于通过华通氏管将聚合物纳米材料递送至小鼠下颌下腺，并包含故障排除和质量控制步骤²⁰。例如，正确使用导丝有助于导管的准确定位。此外，在注射过程中采用干燥吸水固定导管，而非使用氰基丙烯酸酯类胶水，可最大限度地降低黏膜损伤的风险。该方法可用于向小鼠递送多种化合物，并可在同一小鼠身上进行多次给药操作，以评估重复给药的时间进程...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸毛果芸香碱	Sigma Aldrich	P6503	Pilocarpine
学生用Vannas弹簧剪	Fine Science Tools	91500-9	气管切开用弹簧剪
无菌生理盐水溶液	Medline	RDI30296H	生理盐水
Dumont #7 镊子	Fine Science Tools	11274-20	弯头镊子
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10	直头镊子
标准型镊子	Fine Science Tools	11000-12	钝头镊子
精细钨碳合金剪刀	Fine Science Tools	14568-09	解剖剪刀
微量血细胞比容肝素化毛细管	Fisher Scientific	22362566	毛细管
润滑性眼膏	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
山羊多克隆抗Nkcc1抗体	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 抗体
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	统计分析软件
棉签	Medline	MDS202000	眼膏涂抹用棉签
0.5cc 胰岛素注射器，29G x 1/2"	BD	7629	腹腔注射用注射器