下颌下腺的局部药物递送在理解唾液腺生物学以及开发新型治疗手段方面具有重要意义。本文介绍了一种经过改进且更为详细的经导管逆行注射方案，旨在提高递送的准确性和实验的可重复性。本文所展示的应用为聚合物纳米颗粒的递送。
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本文内容
摘要
摘要
唾液腺治疗的两个常见目标是预防和治愈自身免疫性或放射性损伤后出现的组织功能障碍。通过将生物活性化合物局部递送至唾液腺，可安全地实现比全身给药更高的组织药物浓度。此外，还可显著减少因腺体外组织蓄积所导致的脱靶效应。在这一背景下，逆行导管注射是一种广泛用于研究唾液腺生物学及病理生理学的方法。已有研究表明，通过逆行导管途径递送生长因子、原代细胞、腺病毒载体以及小分子药物，可在损伤情况下支持唾液腺功能。我们先前已证实，通过逆行导管注射纳米颗粒-siRNA策略可在放射损伤后维持唾液腺功能。本文详细描述了一种高效且可重复的经由沃顿管（Wharton's duct）向小鼠下颌下腺递送纳米材料的方法（图1）。我们阐述了如何进入口腔，并概述了插管沃顿管所需的操作步骤，同时在操作过程中通过若干观察指标进行质量控制。
引言
唾液腺功能障碍有多种病因，包括舍格伦综合征（一种由自身免疫介导的功能性分泌组织丧失）和放射性唾液减少症（RIH），后者是头颈部肿瘤放疗后常见的后遗症1唾液功能的丧失会使个体易患口腔和全身感染、龋齿、消化和吞咽功能障碍、言语障碍以及重度抑郁症。1,2,3因此，患者生活质量显著下降，且目前的干预措施仅限于缓解症状，而非治愈疾病4. 为了研究新的治疗方法 体内因此，将生物活性化合物直接施用于唾液腺具有重要意义。
逆行导管注射是一种将生物活性化合物直接递送至唾液腺并评估其在疾病、损伤或正常组织稳态条件下功效的重要方法。三大唾液腺分别为腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG），均通过排泄导管将分泌物排入口腔。小鼠下颌下腺的解剖结构允许通过舌下口腔底部的Wharton导管进行直接插管5。插管完成后，可将溶解的药物直接注入下颌下腺。逆行导管递送后，腺体周围的组织包膜限制了药物向腺体外的扩散，该包膜可调控与周围结构之间的物质交换6。人类下颌下腺及其导管结构与小鼠相似，在下颌下腺手术和唾液腺内....
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方案
全部 体内 以下程序已获罗切斯特大学罗切斯特动物资源委员会批准， 纽约
1. 准备
- 使用带内置金属丝的32G颅内导管管路，截取3 cm长的管段，制成与管路长轴成约45°斜面的尖端。确认金属丝比管路至少长出1 cm。
- 将50 µL的PSMA纳米颗粒溶液（图1），或其他注射材料，装入汉密尔顿注射器中。为降低注射过程中发生压力性损伤的风险，将去除金属芯的导管管路连接至注射器，并排出死腔体积。
- 检查注射溶液，确保纳米颗粒完全溶解，以防止给药后导管阻塞。
- 配制浓度为0.1 mg/mL的阿托品溶液。
注意：由于阿托品对光敏感且会随时间降解，该溶液应在注射当天配制，并在使用前避光保存。
2. 胰管入口点的获取与可视化
- 使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。
- 使用 0.5 mL 注射器配合 29G × ½" 针头，通过腹腔注射无菌生理盐水配制的 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪麻醉小鼠。当小鼠对刺激无反应时，即可进行下一步操作，通常在注射后 5 至 10 分钟内发生。
注意：该操作也可在异氟烷麻醉下进行，但需要使用可让口腔通路保持开放的定制鼻罩。
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结果
通过逆行导管注射可将纳米颗粒（NPs）递送至小鼠下颌下腺（图1）。在此，我们递送了50 µg标记有Texas Red荧光染料的PSMA纳米颗粒。
正确放置小鼠可便于接触并清晰观察口腔底部（图2A-B）。下颌乳头可辨认为舌下两个肉质突起。在完成插管（图2C）和注射阿托品后，可将注射器导管插入下颌乳头（图2D）。
为便于插管，首先使用导管管路内的金属导丝在下颌下乳头处刺一个小孔（图3A）。完成此步骤后，应将导.......
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讨论
逆行导管注射对于唾液腺的局部药物递送至关重要。该技术可用于干燥综合征和放射性涎腺炎等疾病的治疗药物筛选9,10,28。通过逆行导管注射将药物直接递送至下颌下腺，相较于全身给药具有显著优势，有望减少脱靶效应，包括免疫系统激活11。在避免药物于周围组织蓄积的同时，实现局部药物递送的最大化，还可使治疗药物在更宽的剂量范围内进行测试，而这是全身给药难以达到的。
本文提供了一种详细且经过更新的方法，用于通过华通氏管将聚合物纳米材料递送至小鼠下颌下腺，并包含故障排除和质量控制步骤20。例如，正确使用导丝有助于导管的准确定位。此外，在注射过程中采用干燥吸水固定导管，而非使用氰基丙烯酸酯类胶水，可最大限度地降低黏膜损伤的风险。该方法可用于向小鼠递送多种化合物，并可在同一小鼠身上进行多次给药操作，以评估重复给药的时间进程.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国立牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI）的资助，项目编号为 R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本研究还得到了美国国家科学基金会（NSF）DMR 1206219 项目以及国际牙科研究协会（IADR）口腔护理创新奖（2016 年）的支持。
我们感谢Jayne Gavrity在进行IVIS实验中的帮助。我们感谢Karen Bentley在进行电镜实验（EM）过程中的建议和协助。我们感谢Pei-Lun Weng在免疫组织化学（IHC）方面的协助。我们感谢Matthew Ingalls在图片准备方面的帮助。我们感谢Elaine Smolock博士和Emily Wu对本文稿的审阅和宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸毛果芸香碱 | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| 学生用Vannas弹簧剪 | Fine Science Tools | 91500-9 | 气管切开用弹簧剪 |
| 无菌生理盐水溶液 | Medline | RDI30296H | 生理盐水 |
| Dumont #7 镊子 | Fine Science Tools | 11274-20 | 弯头镊子 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 直头镊子 |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools | 11000-12 | 钝头镊子 |
| 精细钨碳合金剪刀 | Fine Science Tools | 14568-09 | 解剖剪刀 |
| 微量血细胞比容肝素化毛细管 | Fisher Scientific | 22362566 | 毛细管 |
| 润滑性眼膏 | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| 山羊多克隆抗Nkcc1抗体 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 抗体 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | 统计分析软件 |
| 棉签 | Medline | MDS202000 | 眼膏涂抹用棉签 |
| 0.5cc 胰岛素注射器，29G x 1/2" | BD | 7629 | 腹腔注射用注射器 |
参考文献
- Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
- Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G.
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重印与许可
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