我们介绍了一种详细的唾液采集方法，包括小鼠气管造口术以及三大唾液腺的分离。
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本文内容
摘要
摘要
口干症常在干燥综合征的自身免疫反应中或在主要唾液腺受到放射性损伤后出现。在这些情况下，关于疾病发病机制和有效干预措施的问题仍然存在。一种能够对唾液腺功能进行评估的优化技术，对于研究外分泌腺的生物学、功能障碍及治疗手段具有重要价值。本文介绍了一种逐步实施匹鲁卡品刺激唾液分泌的方法，包括气管切开术以及三种主要小鼠唾液腺的解剖步骤。我们还详细描述了在这些操作过程中所涉及的小鼠头颈部的正确解剖结构。该方法具有可扩展性，可同时处理多只小鼠，从而提高实验流程的效率。我们的目标是提高这些方法的可重复性，而每种方法在该领域内均有进一步的应用价值。除了唾液采集外，我们还讨论了用于量化和标准化这些组织功能能力的评估指标。文中提供了代表性数据，来自接受分次放射治疗（4次，每次6.85 Gy）后2周唾液腺功能受抑的下颌下腺。
引言
唾液腺疾病包括分泌调节异常或功能受损所导致的综合征，从而引起唾液分泌过多（流涎症）或分泌不足（口干症和低分泌症）1。在这两种情况下，人们都希望进一步深入了解唾液腺生物学，以最终推动治疗策略的开发2。
唾液腺是高度放射敏感的器官，在头颈部肿瘤放射治疗过程中常受到损伤，导致永久性口干（xerostomia）3,4。然而，与其他放射敏感组织不同，唾液腺的细胞更新速率相对较低，其分泌功能丧失的机制尚不明确5,6。在这种特殊的损伤情况下，组织再生和放射防护策略需要对唾液功能进行评估。在实验上，小鼠唾液采集是评估唾液腺对辐射及治疗药物反应的重要工具。
本文介绍了一种利用强效毒蕈碱受体激动剂匹鲁卡品（pilocarpine）刺激并定量唾液分泌的方法7。匹鲁卡品可通过刺激自主神经系统诱导腺体分泌8,9。为正确完成该检测，需进行气管切开术，以确保小鼠....
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方案
以下所述的所有体内操作均经罗切斯特大学罗切斯特动物资源大学委员会批准。
1. 准备
- 使用分析天平称取 20 mg 毛果芸香碱。将其溶解于微量离心管中的 2 mL 无菌生理盐水中。
注意：由于毛果芸香碱对光敏感且会随时间失去活性，该溶液应在注射当天配制，并在给药前避光保存。 - 使用分析天平称重并标记所有收集管和玻璃毛细管。收集管和玻璃毛细管的数量应与小鼠数量一致 。
2. 气管切开术
- 使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。
- 使用带有 29G × ½" 针头的 0.5 mL 注射器，通过腹腔注射无菌生理盐水溶液，其中包含每公斤体重 100 mg 的氯胺酮和每公斤体重 10 mg 的赛拉嗪，对小鼠进行麻醉。当小鼠对刺激不再产生反应时（即i.e. 足底回缩反射 消失），通常在注射后 5 至 10 分钟内发生，即可进行下一步操作。
- 将润滑剂涂抹于棉签上后，轻轻涂抹于小鼠眼部，并将小鼠仰卧固定于操作台上。 麻醉后的小鼠必须始终置于温暖的表面上。
注意：所有步骤均在室温下进行。 - 使用手术胶带将小鼠的鼻部、四肢和尾部固定在操作台上。
- 用酒精棉片清洁并润湿颈部。
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结果
进行高剂量匹鲁卡品刺激唾液采集时，必须保持气道通畅，以防止口腔分泌物引起误吸或窒息。此处提供了气管造口术的示意图（图1）气管切开后，须保持造口无组织和液体阻塞。
为增强采集唾液时的毛细作用，应将小鼠头部朝下放置 45° 角度。这些步骤可以在 >1只小鼠，尽管不建议一次超过5只小鼠（图2收集完成后，建议迅速称量试管，以避免蒸发损失。
采集唾液后，对小鼠实施安乐死。不应采用颈椎脱位法，因其可能损伤头颈部结构。将小鼠放回解剖台，腺体应复位至气管上方的原始位置。由于位置和组织疏松的特点，应首先开始剥离咽旁腺（PG）（图3）。下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG.......
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讨论
我们提出一种多步骤方法来评估唾液腺功能，可用于研究腺体损伤及治疗手段。该方法包括气管造口术、唾液采集和腺体解剖，每一项操作均有其特定的实验应用，可支持对唾液腺生物学进行综合研究。例如，小鼠气管造口术已被用于在阻塞口腔的操作过程中进行常规气道管理。
为了实现100 mg/kg剂量毛果芸香碱刺激下的唾液分泌，需要进行正确的解剖和气管切开。 alternatively，降低毛果芸香碱的剂量可避免气管造口术的需要，因此可用于唾液分泌的纵向评估16。
除了记录唾液分泌外，本方案还提供了一种准确且一致的方法来收集唾液，以用于其他分析。此类研究包括流变学、蛋白质组学、酶活性、唾液渗透压25,26,27以及生物标志物的发现28,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了美国国立牙科与颅面研究所（NIDCR）和美国国立卫生研究院国家癌症研究所（NCI）的资助，项目编号为 R56 DE025098、UG3 DE027695 和 F30 CA206296。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。本研究还得到了美国国家科学基金会（NSF）DMR 1206219 项目以及国际牙科研究协会（IADR）口腔护理创新奖（2016 年）的支持。
我们感谢 Eri Maruyama 博士和 Andrew Hollomon 在唾液采集方面的帮助。我们感谢 Pei-Lun Weng 在腺体解剖方面的协助。我们感谢 Matthew Ingalls 在图片准备方面的帮助。我们感谢 Elaine Smolock 博士和 Emily Wu 对本手稿的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 盐酸毛果芸香碱 | Sigma Aldrich | P6503 | 毛果芸香碱 |
| 学生用范纳斯弹簧剪 | Fine Science Tools | 91500-9 | 气管切开用弹簧剪 |
| 无菌生理盐水溶液 | Medline | RDI30296H | 生理盐水 |
| Dumont #7 镊子 | Fine Science Tools | 11274-20 | 弯头镊子 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 直头镊子 |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools | 11000-12 | 钝头镊子 |
| 精细钨碳合金剪刀 | Fine Science Tools | 14568-09 | 解剖剪刀 |
| 微量血细胞比容肝素化毛细管 | Fisher Scientific | 22362566 | 毛细管 |
| 润滑性眼膏 | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| 山羊多克隆抗 Nkcc1 抗体 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 抗体 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | 统计分析软件 |
| 棉签 | Medline | MDS202000 | 眼膏涂抹用棉签 |
| 0.5 cc 胰岛素注射器，29G × 1/2" | BD | 7629 | 腹腔注射用注射器 |
参考文献
- Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A.
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