通过分次放射治疗后匹鲁卡品刺激进行小鼠唾液功能评估

摘要

我们介绍了一种详细的唾液采集方法，包括小鼠气管造口术以及三大唾液腺的分离。

摘要

口干症常在干燥综合征的自身免疫反应中或在主要唾液腺受到放射性损伤后出现。在这些情况下，关于疾病发病机制和有效干预措施的问题仍然存在。一种能够对唾液腺功能进行评估的优化技术，对于研究外分泌腺的生物学、功能障碍及治疗手段具有重要价值。本文介绍了一种逐步实施匹鲁卡品刺激唾液分泌的方法，包括气管切开术以及三种主要小鼠唾液腺的解剖步骤。我们还详细描述了在这些操作过程中所涉及的小鼠头颈部的正确解剖结构。该方法具有可扩展性，可同时处理多只小鼠，从而提高实验流程的效率。我们的目标是提高这些方法的可重复性，而每种方法在该领域内均有进一步的应用价值。除了唾液采集外，我们还讨论了用于量化和标准化这些组织功能能力的评估指标。文中提供了代表性数据，来自接受分次放射治疗（4次，每次6.85 Gy）后2周唾液腺功能受抑的下颌下腺。

引言

唾液腺疾病包括分泌调节异常或功能受损所导致的综合征，从而引起唾液分泌过多（流涎症）或分泌不足（口干症和低分泌症）¹。在这两种情况下，人们都希望进一步深入了解唾液腺生物学，以最终推动治疗策略的开发²。

唾液腺是高度放射敏感的器官，在头颈部肿瘤放射治疗过程中常受到损伤，导致永久性口干（xerostomia）^3,4。然而，与其他放射敏感组织不同，唾液腺的细胞更新速率相对较低，其分泌功能丧失的机制尚不明确^5,6。在这种特殊的损伤情况下，组织再生和放射防护策略需要对唾液功能进行评估。在实验上，小鼠唾液采集是评估唾液腺对辐射及治疗药物反应的重要工具。

本文介绍了一种利用强效毒蕈碱受体激动剂匹鲁卡品（pilocarpine）刺激并定量唾液分泌的方法⁷。匹鲁卡品可通过刺激自主神经系统诱导腺体分泌^8,9。为正确完成该检测，需进行气管切开术，以确保小鼠在实验过程中保持气道通畅，并降低因口腔内积聚分泌物导致的窒息和吸入性风险¹⁰。

这是一个终末性操作，最终切除三大唾液腺：腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）。在功能研究中，需记录腺体重量，通常用于标准化唾液量的测定^11,12,13。该数据在放射研究中尤为重要，因为腺体萎缩是预期的结果之一^14,15

关于刺激性唾液分泌的实验操作和报告方式，文献中存在较大差异¹⁶。例如，文献中毛果芸香碱（pilocarpine）的使用剂量跨度至少达到三个数量级^{17,18,19,20,21,22,23}。本文介绍一种经过优化的高剂量毛果芸香碱实验方案，旨在提高方法执行的可重复性，同时提供一个模块化的技术平台（包括气管切开术、唾液采集和腺体解剖），可根据需要进行调整应用。

除了实验方案的演示外，我们还提供了在对下颌下腺区域进行分次辐射（4次，每次6.85 Gy）后2周时唾液流量的代表性功能数据。

方案

以下所述的所有体内操作均经罗切斯特大学罗切斯特动物资源大学委员会批准。

1. 准备

1. 使用分析天平称取 20 mg 毛果芸香碱。将其溶解于微量离心管中的 2 mL 无菌生理盐水中。
   注意：由于毛果芸香碱对光敏感且会随时间失去活性，该溶液应在注射当天配制，并在给药前避光保存。
2. 使用分析天平称重并标记所有收集管和玻璃毛细管。收集管和玻璃毛细管的数量应与小鼠数量一致 。

2. 气管切开术

1. 使用分析天平称量 C57/BL6 小鼠的体重。
2. 使用带有 29G × ½" 针头的 0.5 mL 注射器，通过腹腔注射无菌生理盐水溶液，其中包含每公斤体重 100 mg 的氯胺酮和每公斤体重 10 mg 的赛拉嗪，对小鼠进行麻醉。当小鼠对刺激不再产生反应时（即i.e. 足底回缩反射 消失），通常在注射后 5 至 10 分钟内发生，即可进行下一步操作。
3. 将润滑剂涂抹于棉签上后，轻轻涂抹于小鼠眼部，并将小鼠仰卧固定于操作台上。 麻醉后的小鼠必须始终置于温暖的表面上。
   注意：所有步骤均在室温下进行。
4. 使用手术胶带将小鼠的鼻部、四肢和尾部固定在操作台上。
5. 用酒精棉片清洁并润湿颈部。
   注意：此步骤有助于防止毛发进入后续切口。
6. 用镊子提起腹侧中线部位的颈部皮肤，使用解剖剪进行一个小的浅表切口。将剪刀插入切口，并在皮下缓慢张开刀片，以分离组织层面。
7. 保持皮肤抬起状态，小心地向嘴下方剪开约 1 cm。
8. 在初次切口的上下两端各做一个横向切口。用镊子轻轻将皮肤向两侧翻折，以暴露头颈部结构。
9. 在 8 倍解剖显微镜下观察下颌下腺（中线位置：图 1）。
10. 使用精细镊子轻轻提起腺体，以暴露覆盖在气管上方的四块肩胛舌骨肌（带状肌）。操作时应避免撕裂或损伤周围血管或排泄导管。
11. 若需从多只小鼠采集唾液，应在继续下一步前对每只小鼠重复步骤 2.1 至 2.10。
    注意：本操作可同时安全地用于最多 5 只小鼠。
12. 使用小型解剖剪，尽可能靠近中线切除带状肌的内侧部分。仅切除必要量的组织以暴露气管，并在操作过程中将带状肌移开。应避免划伤任何邻近血管，因为若因明显出血导致血容量减少，匹鲁卡品将无法有效诱导分泌。
13. 将带状肌从气管表面轻轻翻折移开。
14. 观察喉部、气管和甲状腺。确保气管表面无组织覆盖。
15. 使用小型解剖剪，在甲状腺下方/后方的气管处做一水平切口。确保气道通畅且无液体阻塞。

3. 唾液采集

1. 移除靠近口腔的胶带，并将解剖台向下倾斜（45°，头侧朝下），以促进唾液流出。
2. 使用带有29G × ½"针头的0.5 mL注射器，按10 µL/g体重剂量进行腹腔注射匹罗卡品，总剂量为100 mg/kg。
3. 启动计时器。若需对多只小鼠给药，应迅速操作，并可由助手同时为其余小鼠注射，以减少等待时间。
4. 使用标准镊子打开口腔，以便毛细管进入。
5. 当观察到口腔内出现唾液液滴时，将毛细管的近端插入液体中，远端放入位于解剖台下方的收集管中（两管均预先称重）。
   注：在6至10周龄的C57/BL6雌性小鼠中，注射匹罗卡品后约2分钟内即可出现明显唾液分泌。
6. 若唾液在口腔内积聚但未通过毛细管流动，请重复上一步操作。确保毛细管未直接贴靠黏膜表面，以免堵塞进液口。
7. 自匹罗卡品刺激开始后，持续收集唾液共12分钟。确保造口保持通畅。
   注：此期间潮气量增加以及分泌物（唾液、尿液、粪便）增多属于正常现象。
8. 若小鼠唾液分泌功能低下（e.g.，因损伤或干预所致），可使用P200移液器将口腔内剩余液体转移至收集管中。若同时收集多只小鼠样本，须确保每次更换吸头。
9. 在注射匹罗卡品12分钟后，记录收集到的唾液与收集管的总重量。

4. 腺体解剖

1. 采用 CO₂ 窒息法处死小鼠 （参照《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》），随后进行胸廓切开术，注意保护头颈部结构。因此，避免使用颈椎脱位作为安乐死方法。
2. 将小鼠仰卧位固定于操作台上。将腺体复位于气管上方的原始位置（图1）。
3. 在解剖显微镜下以8倍放大倍数观察主要腺体：腮腺（PG）、下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）。为在解剖过程中区分各腺体，需注意腮腺（PG）呈弥散状，位于下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG）的外侧。
   注意：若需解剖腮腺（PG），应优先进行，因其边界最不清晰且最容易撕裂。
4. 用镊子夹住腮腺（PG）尾部，将其从下方结构轻轻牵拉，并施加轻柔张力，随后用解剖剪剪断腮腺（PG）头部。
5. 用镊子刺破包绕下颌下腺（SMG）的被膜，轻柔分离左侧与右侧下颌下腺（SMG）。
6. 用镊子将下颌下腺（SMG）背侧从附着的非腺体组织中游离出来。
7. 用镊子拉紧沃顿氏管（Wharton's duct），同时用解剖剪剪断导管，从而将下颌下腺（SMG）从颈部取出。
8. 用镊子轻柔地将舌下腺（SLG）从下颌下腺（SMG）分离。
   注意：舌下腺（SLG）位于下颌下腺（SMG）的上外侧区域。
9. 使用分析天平记录下颌下腺（SMG）的重量。

结果

进行高剂量匹鲁卡品刺激唾液采集时，必须保持气道通畅，以防止口腔分泌物引起误吸或窒息。此处提供了气管造口术的示意图（图1）气管切开后，须保持造口无组织和液体阻塞。

为增强采集唾液时的毛细作用，应将小鼠头部朝下放置 45° 角度。这些步骤可以在 >1只小鼠，尽管不建议一次超过5只小鼠（图2收集完成后，建议迅速称量试管，以避免蒸发损失。

采集唾液后，对小鼠实施安乐死。不应采用颈椎脱位法，因其可能损伤头颈部结构。将小鼠放回解剖台，腺体应复位至气管上方的原始位置。由于位置和组织疏松的特点，应首先开始剥离咽旁腺（PG）（图3）。下颌下腺（SMG）和舌下腺（SLG...

讨论

我们提出一种多步骤方法来评估唾液腺功能，可用于研究腺体损伤及治疗手段。该方法包括气管造口术、唾液采集和腺体解剖，每一项操作均有其特定的实验应用，可支持对唾液腺生物学进行综合研究。例如，小鼠气管造口术已被用于在阻塞口腔的操作过程中进行常规气道管理。

为了实现100 mg/kg剂量毛果芸香碱刺激下的唾液分泌，需要进行正确的解剖和气管切开。 alternatively，降低毛果芸香碱的剂量可避免气管造口术的需要，因此可用于唾液分泌的纵向评估¹⁶。

除了记录唾液分泌外，本方案还提供了一种准确且一致的方法来收集唾液，以用于其他分析。此类研究包括流变学、蛋白质组学、酶活性、唾液渗透压^25,26,27以及生物标志物的发现^28,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸毛果芸香碱	Sigma Aldrich	P6503	毛果芸香碱
学生用范纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	91500-9	气管切开用弹簧剪
无菌生理盐水溶液	Medline	RDI30296H	生理盐水
Dumont #7 镊子	Fine Science Tools	11274-20	弯头镊子
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10	直头镊子
标准型镊子	Fine Science Tools	11000-12	钝头镊子
精细钨碳合金剪刀	Fine Science Tools	14568-09	解剖剪刀
微量血细胞比容肝素化毛细管	Fisher Scientific	22362566	毛细管
润滑性眼膏	Refresh	N/A	Refresh Lacri-Lube
山羊多克隆抗 Nkcc1 抗体	Santa Cruz Biotech	SC-21545	Nkcc1 抗体
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI
GraphPad Prism	GraphPad	ver6.0	统计分析软件
棉签	Medline	MDS202000	眼膏涂抹用棉签
0.5 cc 胰岛素注射器，29G × 1/2"	BD	7629	腹腔注射用注射器