一种用于研究的麻醉无特定病原体鸡结扎肠段模型 产气荚膜梭菌 毒力

摘要

本文介绍一种在鸡小肠中手术创建“肠结扎环”的实验方案。该方法可用于比较多个 产气荚膜梭菌 菌株的毒力 原位 在单个宿主中。该方法显著减少了通常进行类似实验所需鸡只的数量 体内 实验。

摘要

本研究利用多种体内感染模型在鸡中研究坏死性肠炎。大多数模型结合了球虫病和饮食等诱发因素，并通过灌胃或饲料途径给予产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）。在这些模型中，为比较多种C. perfringens菌株的毒力，通常需要大量宿主动物才能获得具有统计学意义的结果。根据实验模型的不同，研究过程中的死亡率可能较高，从而引发有关动物福利的伦理问题。因此，开发新的感染模型以减少动物使用数量，同时仍能提供具有统计学显著性和有效性的结果，对于降低科研中动物的使用具有重要意义。结扎肠段模型已被用于研究小鼠、兔和犊牛等多种物种的梭菌感染。通过外科手术创建结扎肠段后，将C. perfringens菌株直接注射入肠段，以实现细菌与肠黏膜之间的密切接触。在手术后数小时内终止实验，采集小肠组织及管腔内容物样本。每只动物可同时接种多种细菌菌株，从而显著减少实验所需的动物数量。此外，所有操作均在全身麻醉下进行，以减轻动物疼痛。在鸡的研究中，相较于口服接种，结扎肠段模型更适合用于比较C. perfringens菌株的致病性，因其所需动物数量更少，无需依赖诱发因素即可引发疾病，且可通过镇痛药物有效控制疼痛。然而，目前在鸡中应用的结扎肠段模型描述较少，标准化操作对其有效应用至关重要。本文详细提供了在鸡中建立多个结扎肠段的全部必要步骤，并阐述了获得可靠结果的关键技术要点。

引言

利用动物模型研究影响人类和动物的传染病，是评估特定疾病发病机制中调节毒力因子的核心工具，同时也是制定疾病预防和治疗策略的重要手段¹尽管使用动物模型研究各种疾病具有诸多优势，但有关该做法的伦理问题也日益受到关注。研究人员需要在获得显著且有效结果的同时，尽量减少动物的使用。为此提出了“3R原则”（替代、减少和优化）的概念，以确保此类试验中的动物福利问题得到妥善解决。在鸡坏死性肠炎的研究中， 体内 鸡模型被用于研究该疾病的病因、预防和治疗方法^2,3,4,5致病性菌株 C. perfringens 携带特定的毒力因子，例如NetB毒素⁶，用于在鸡中诱发坏死性肠炎⁷因此，在这种情况下，替代原则难以实现，因为这些毒力因子在其他动物物种中可能并非同样关键。大多数鸡坏死性肠炎模型采用多种风险因素组合，例如球虫病和饮食改变，以诱导坏死性肠炎，随后通过灌胃给予含有大量细菌的肉汤培养物 C. perfringens². 这些模型可在大量鸡只中诱导疾病，且此类试验中的死亡率可能较高⁸因此引发了人们对动物实验中减少和优化原则的担忧。

结扎肠段模型是研究肠道病原体所致疾病的一种理想替代方法，符合动物实验的“减少、替代、优化”原则。在该模型中，通过在肠道上施加结扎线形成称为“肠段”的独立且密闭的腔室，可在其中单独注射病原体⁹，或与其他分子（如候选疫苗）共同注射^10,11。目标病原体可与肠上皮细胞直接接触，感染数小时后即可采集肠组织样本用于后续分析。该方法可在同一只动物体内设置多个处理组和对照组，采用重复测量模型进行统计分析，从而提高组间判别能力，并较口服灌胃实验显著减少所需鸡只数量。此外，手术操作及后续感染过程均在持续全身麻醉和镇痛条件下进行，最大限度减轻动物痛苦。闭合式肠段结扎为减少实验动物使用数量、建立更人道的动物研究体系提供了理想范式。

结扎肠段模型在多种动物中已有详细描述，例如犊牛、兔子和小鼠^2,9，但在鸡中描述较少⁷。为了充分有效地使用该手术模型，必须掌握正确的技术和操作方法，以建立结扎肠段，避免对肠道完整性造成损伤。本文旨在详细描述在鸡模型中建立多个结扎肠段的逐步操作方法。该技术的成功在很大程度上依赖于术者的技能和经验，准确的操作步骤对于项目的成功至关重要。

方案

所有涉及活体动物的操作均经蒙特利尔大学兽医学院伦理委员会（CÉUA，“动物使用伦理委员会”）批准。

1. 手术前的注意事项

1. 选择10周龄的SPF（无特定病原体）来航鸡进行手术。
   注意：其体重必须在1.0至1.2 kg之间。
2. 在手术前12小时撤除饲料，以排空肠道。
3. 手术前，根据经麻醉科医师验证的方案，使鸡只接受全身麻醉。在手术前15分钟，对每只鸡进行肌内（IM）注射咪达唑仑1 mg/kg和布托啡诺4 mg/kg作为术前给药。在麻醉过程中，若呼吸模式改变或呼吸频率增加，则每4小时重复一次肌内注射布托啡诺4 mg/kg，或根据需要给药。在所有操作过程中，通过气管内插管给予异氟烷，浓度维持在1.5%至2.5%之间。
   注意：建议使用术前给药以实现镇静和镇痛，因为这 将显著加深麻醉深度，减少整个操作过程中所需的麻醉剂用量，并使研究人员能够有效控制疼痛水平。
4. 通过监测体温、心率和心电图（ECG）、呼吸频率与节律、血氧饱和度、呼出二氧化碳（CO₂）以及神经反射来评估麻醉状态。
   注意：必须指定专人全程监控上述各项参数。
5. 在整个手术过程中遵循无菌原则。确保主刀医师和助手按照机构术前规程穿戴无菌手术衣、手套、口罩和防护护目镜。主刀医师需使用浸有氯己定葡萄糖酸盐的无菌刷，刷洗双手至肘部，重点清洁指甲及每个手指表面。
6. 使用灭菌器对手术器械进行灭菌处理。

2. 手术部位准备

1. 首先，用轻柔的牵拉方式手动去除腹部的羽毛。
2. 使用浸有葡萄糖酸氯己定清洁剂的无菌刷子擦洗手术部位。从中心向外周轻柔刷洗皮肤，总接触时间为5分钟，过程中不得再次返回中心区域。
3. 使用浸有葡萄糖酸氯己定溶液和异丙醇的无菌纱布，在手术部位进行3次交替擦拭。
   注意：擦拭必须从手术区域中央开始，向边缘移动，以避免未消毒区域污染手术部位。
4. 将无菌手术巾覆盖在鸡体上。

3. 从小肠腹腔中取出小肠

1. 用剪刀切开手术巾，仅暴露手术部位的皮肤。
2. 使用3号手术刀片沿腹中线下段做“L”形切口，切开皮肤。
   1. 第一刀从胸骨后方1 cm处开始，至泄殖腔前方1 cm处结束。
   2. 第二刀垂直于第一刀切口，从第一刀的尾端开始，沿骨盆边缘向左侧腹部延伸5 cm。
      注意：此切口将形成一个皮瓣，便于更轻松地外翻肠道。
3. 使用手术剪沿相同的“L”形路径剪开腹膜和腹壁肌肉，以打开腹腔。
   注意：此操作将暴露气囊。肠道位于这些结构下方。在整个手术过程中，必须使用浸有0.85%无菌生理盐水的纱布保持气囊湿润，以防干燥和可能的破裂。
4. 沿左侧腹壁将Snook绝育钩插入腹腔，并绕行于腹部气囊周围进行操作。
5. 轻柔地将肠道外翻并铺展于手术区域。
   注意：在整个手术过程中，应频繁喷洒0.9%无菌生理盐水以保持肠道湿润。也可将浸有无菌生理盐水的纱布覆盖在肠道上，防止干燥。
6. 使用干燥的无菌纱布抓持肠道，通过手动牵引轻柔拉出小肠，以暴露空肠。
   注意：肠系膜血管较为脆弱，过度牵拉可能导致其破裂，从而引起肠道缺血性损伤，并严重影响手术预后。

4. 肠道环的制备

1. 环1的构建。
   1. 在近端空肠处使用聚乙醇酸多股合成可吸收材料进行单纯结扎，注意避免结扎主要的肠系膜血管。
   2. 在距近端结扎处 2 cm 的位置放置远端结扎。
      注意：使用多股缝合材料沿肠道放置简单的缝合线，以形成封闭的节段。示意图（图1) 描述了所有结扎线的位置。每个环由近端和远端结扎线组成，两者相距 2 cm。
2. 环间结1号的制作。
   1. 在第1个环的远端结扎处远侧0.5 cm处放置一个简单的结扎。
      注意：在连续的环路之间，存在1 cm的间隔环段。 即 在环段之间设置物理分隔的节段。为降低污染物从一个环段扩散至另一环段的潜在风险，可在相邻两环段之间的间隔区域中央（距相邻环段远端和近端结扎处各0.5 cm）放置一个简单的结扎。此举可减少泄漏的污染物到达相邻环段结扎处的可能性。这些分隔节段并非必需，但有助于降低交叉污染的风险。
3. 后续环状结构及环间连接的构建。
   1. 重复步骤 4.1 和 4.2，以获得所需数量的环状结构。
      注意：本实验中创建了9个环和8个环间区域，总长度为26 cm。环的数量可根据研究需要进行调整。

5. 注射 产气荚膜梭菌 将菌株引入环状结构

1. 使用无菌注射器和26 G针头，在1号肠段中注入病原体。将针头以45°角轻轻插入肠管对系膜侧。
   注意：本实验中，每个肠段注射0.2 mL含1 × 10⁶ CFU（菌落形成单位）处于对数生长中期的C. perfringens的脑心浸出液（BHI）。5个不同菌株分别注射至5个不同的肠段，其余4个肠段交替注射不含细菌的阴性对照（无菌BHI），即病原体肠段与无菌BHI肠段交替排列。
2. 重复步骤5.1，完成所有肠段的注射。
3. 轻柔地将肠道复位至腹腔背侧区域，置于气囊下方。

6. 腹腔关闭

1. 腹膜和腹肌的缝合。
   1. 使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin）多股合成可吸收缝线，采用单纯连续缝合法，沿骨盆方向（步骤3.3中切开处）缝合腹膜和腹肌。
   2. 使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin）多股合成可吸收缝线，采用单纯连续缝合法，从胸骨至泄殖腔方向（步骤3.3中切开处）缝合腹膜和腹肌。
2. 皮肤的缝合。
   1. 使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin）多股合成缝线，采用单纯连续缝合法，闭合沿骨盆方向的皮肤切口（步骤3.2中切开处）。
   2. 使用相同的多股缝合材料，采用单纯连续缝合法，闭合从胸骨至泄殖腔方向的皮肤切口（步骤3.2中切开处）。

7. 结论

1. 手术操作后，使用适当的镇痛剂维持鸡的全身麻醉状态，以尽量减少感染期间动物的疼痛。持续进行麻醉监测，确保麻醉深度适宜。
2. 在达到预期感染时间后，在全身麻醉下通过颈椎脱位人道处死鸡。
   注意：对于这些操作，致病性产气荚膜梭菌（C. perfringens）菌株诱导显微病变所需时间为7小时。
3. 使用3号手术刀片切取一段0.5 cm至1 cm长的肠段，置于10%福尔马林中固定过夜，用于后续组织病理学分析。
4. 使用同一把手术刀片切取剩余的肠段，放入无菌微量离心管中，用于从各肠段分离产气荚膜梭菌（C. perfringens）菌株，并进行后续细菌学分析以完成其遗传特征鉴定。
5. 对所有肠段重复步骤7.2和7.3，每次处理不同肠段时更换手术刀片。

结果

9个肠段及8个肠段间区域的示意图如图所示 图1在此模型中，使用简单的结扎线共形成9个环段和8个环间段。每个环段由近端结扎线和远端结扎线构成，两者间距为2 cm（从近端结扎线开始测量）。两个相邻环段之间由1 cm的环间段隔开。为降低因结扎处渗漏导致环段间交叉污染的潜在风险，在两个相邻环段的远端结扎线与近端结扎线之间的中点处放置一条环间结扎线。环段的数量可根据研究需求进行调整。

图1：结扎肠段的示意图。

讨论

已有多种动物模型被用于研究宿主与病原体的相互作用以及由不同肠道病原体（如Clostridium perfringens、Clostridium difficile和Salmonella enterica）引起的疾病发病机制^7,9,13,14,15。该模型还被用于分析黏膜免疫反应¹⁶、抗体中和肠道病原体分泌的细菌毒素的效果¹¹，以及评估预防肠道疾病的疫苗候选物¹⁰。然而，在单个动物体内使用多个结扎肠段的模型在鸡中的描述尚不充分，为获得可靠结果，该技术的标准化至关重要，因为不当的操作可能导致错误结果和误判。本论文展示了在鸡胃...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EZ-Scrub 747	贝克顿·迪金森公司		4% 葡萄糖酸氯己定消毒液浸渍的无菌刷。无目录号。网址：https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
70% 异丙醇 USP 4 L	商用异丙醇	P016IP70	网址：http://www.comalc.com/products/
氯己定	Sigma-Aldrich	282227-1G	氯己定葡萄糖酸盐溶液，必须稀释至4%。网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx/D/BwE
小型手术铺巾（27 英寸 × 24 英寸），带 3 英寸 × 6 英寸开口	兽医专用产品	32724	网址：http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog 细节&productgroup_id=15
手术刀片 #3	Swann-Morton	301	网址：https://www.swann-morton.com/product/16.php
无菌生理盐水 NaCl 0.9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	聚乳酸-羟基乙酸共聚物多股可吸收缝合线材料。网址：http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
1 ml 注射器配 26G 针头	贝克顿·迪金森公司	329652	网址：https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
脑心浸液	Sigma-Aldrich	1104930500	网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&区域=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf管	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	微型离心管。网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	组织与甲醛的固定比例为 1:10。网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
产气荚膜梭菌 菌株	Université de Montréal，家禽研究讲席	N/A	具体信息因实验室而异，可向通讯作者索取