麻醉特异性病原体游离鸡结扎肠环模型研究荚梭菌毒力

Summary

在这里, 我们提出了一个在鸡小肠中手术创建 ' 肠结扎循环 ' 的协议。本程序允许在单个宿主中对多个荚菌株的毒力进行原位比较。这种方法明显地减少了通常需要的鸡的数量在类似的体内实验。

Abstract

采用各种体内感染模型对鸡进行坏死肠炎的研究。大多数这些使用的诱发因素的组合, 如球虫病和饮食, 与灌胃或管理通过饲料使用荚梭菌。在这些模型中, 多荚菌株对毒力研究的比较需要大量的主机来获得显著的结果。在研究过程中, 死亡率可能会很高, 这取决于实验模型, 因此在研究中提高了对动物福利的伦理关注。新的感染模型的开发需要较少的动物来研究发病机制, 但提供统计学上的显著和有效的结果, 在减少动物在研究中的使用是重要的。肠道结扎环模型已被用于研究梭菌感染的各种物种, 如小鼠, 兔和小牛。在手术过程中创建结扎环段, C. 荚菌株直接注入循环中, 在细菌和肠道粘膜之间建立密切接触。小肠和管腔的样本在程序终止后几个小时后采取。可以在每种动物中接种多个细菌菌株, 从而减少实验中所需的受试者数量。同时, 在全身麻醉下进行手术以减少动物疼痛。在鸡中, 这种模式比口服施用更适合荚菌株致病性, 因为需要较少的动物, 不需要诱发因素诱发疾病, 疼痛由止痛药控制。.鸡小肠结扎环模型的描述不充分, 标准化是其最佳使用的必要条件。这份手稿提供了所有必要的步骤, 以创建大量的肠道结扎循环在鸡和带来的关键点信息, 以获得有效的结果。

Introduction

使用动物模型来研究影响人类和动物的传染性疾病, 是评估控制特定疾病发病机制的毒力因素以及制定预防或治疗疾病的策略的中心工具¹。尽管使用动物模型来研究各种疾病有许多优点, 但对这种做法的伦理关注却是产生的。研究人员需要尽量减少动物的使用, 同时获得显著和有效的结果。制定了3《 Rs 原则 (替换、减少和改进) 的概念, 以确保在这种审判中处理福利问题。在鸡坏死性肠炎研究中,体内鸡模型用于调查这种情况的病因、预防和治疗^{2、3、4、5}。荚携带特定毒力因子, 如 NetB 毒素⁶的致病菌株, 被管理导致鸡坏死性肠炎⁷。因此, 替换原则在这种情况下很难实现, 因为这些毒力因子在其他动物物种中可能不那么重要。大多数鸡坏死性肠炎模型使用的危险因素的组合, 如球虫病和改变的饮食诱导坏死肠炎后, 灌胃的肉汤培养含有大量的C. 荚².这些模型将导致大量的鸡的疾病, 死亡率可以是重要的在这种试验⁸, 从而引起关注的减少和细化原则在动物研究。

肠道结扎循环模型是研究肠道病原体引起的疾病的一种可取的替代方法, 以减少其原理和细化。在这些模型中, 被称为 ' 循环 ' 的肠道片段通过在肠道上放置连字来形成独立和密闭的隔间, 在这种情况下, 病原体可以单独注射⁹或与其他分子, 如疫苗候选^10,11. 有兴趣的病原体与肠道细胞密切接触, 经过几个小时的感染时间, 可以恢复肠道样本以作进一步分析。这允许使用在同一动物的多个治疗和控制组。统计分析可以通过重复测量模型进行, 这增加了群体之间的歧视的力量, 减少了必要的鸡的数量相比口服灌胃试验。此外, 手术过程和随后的感染时间在持续全身麻醉和镇痛下进行, 从而尽量减少动物疼痛。闭环结扎是减少主机数量和创建更人性化的动物研究系统的理想模板。

肠道结扎循环模型在不同的物种, 如小牛, 兔子和小鼠^2,9, 但在鸡⁷描述很差的描述。为了最有效地使用这个手术模型, 正确的技术和执行对于建立结扎的肠道循环, 以避免损害肠道完整性是必不可少的。本手稿的目的是描述一步一步的方法在创建在鸡模型的多个肠道循环。这种技术受外科医生的技能和经验的限制, 因为准确的程序对于项目的成功至关重要。

Protocol

所有使用活体动物的程序均由蒙特利尔大学兽医学院道德委员会 (CÉUA, éthique ' Animaux ') 授权。

1. 手术前的注意事项

1. 选择10周老特定病原体免费 (SPF) 里窝那鸡进行手术。
   注: 重量必须介于1.0 到1.2 公斤之间。
2. 取出饲料12小时前的程序清空肠道。
3. 手术前, 按照麻醉师验证的协议将鸡置于全身麻醉下。Premedicate 每只鸡15分钟手术前与肌内 (IM) 注射咪唑安定1毫克/千克和布托啡诺4毫克/公斤。重复, 每4小时, 注射布托啡诺4毫克/千克 IM 或当呼吸模式改变和频率增加在麻醉期间。对于全身麻醉, 在所有的过程中, 使用气管管在1.5 和2.5% 之间的浓度下管理异氟醚。
   注意: 建议使用术前用药进行镇静和镇痛, 因为它们将显著提高麻醉深度, 减少所有手术过程中必要的麻醉剂数量, 并使研究人员能够控制疼痛水平。
4. 通过记录体温、心率和心电图 (ECG)、呼吸速率和节律、氧饱和度、过期二氧化碳 (CO₂) 和神经系统反射来监测麻醉。
   注意: 必须指派人员在所有过程中监视这些参数。
5. 在整个手术过程中遵循无菌原则。根据机构术前协议, 确保外科医生和助理外科医生穿着无菌长袍、手套、口罩和防护护目镜。确保外科医生用葡萄糖酸己定浸渍无菌刷到肘部, 重点放在指甲和每个手指表面上擦洗手。
6. 用灭菌器消毒手术器械。

2. 手术现场准备

1. 首先, 用轻柔的牵引手动去除腹部的羽毛。
2. 用葡萄糖酸己定洗涤剂浸渍无菌刷擦洗手术部位。轻轻擦洗皮肤从中心到外面的总接触时间5分钟, 而不返回到中心。
3. 使用无菌纱布, 用葡萄糖酸盐溶液和异丙醇在手术部位执行3个备选通道。
   注意: 该通道必须从手术部位的中间开始到边界, 以避免未经消毒的区域到手术部位的污染。
4. 将无菌手术悬垂在鸡肉上。

3. 从腹腔提取小肠

1. 用剪刀切割手术的悬垂, 只露出手术部位的皮肤。
2. 通过使用手术刀刀片 #3 执行 "L" 型低中线切口, 切割皮肤。
   1. 开始第一切口1厘米的尾部到胸骨和结束它在1厘米颅骨到泄殖腔。
   2. 执行垂直于第一切口的第二个切口。从第一切口的尾端开始, 然后按照骨盆线继续5厘米到腹部左侧。
      注意: 这个开口将创建一个皮瓣, 将允许更容易提取肠道。
3. 用手术剪刀, 用相同的 "L" 形模式切割腹膜和腹部肌肉, 打开腹腔。
   注意: 这将暴露气囊。肠道位于这些结构下面。气囊必须加湿纱布饱和与无菌盐水 0.85%, 以避免干燥和可能破裂整个过程。
4. 在腹腔插入一个绝育钩, 通过跟随左腹壁和工作的方式围绕腹部气囊。
5. 轻轻取出肠道, 然后在手术场上传播这些。
   注意: 经常喷洒无菌盐水0.9% 在整个过程中保持肠道湿润。此外, 纱布加湿与无菌盐水可以放在肠道, 以避免脱水。
6. 使用干燥的无菌纱布抓住肠道, 通过手动牵引轻轻拉出小肠, 以暴露空肠。
   注意: 肠系膜血管是脆弱的, 过度紧张可能会导致肠道缺血性病变, 并极大地损害手术的结果。

4. 肠道循环的制备

1. 创建环路1。
   1. 通过避免主要肠系膜血管的结扎, 在近端空肠放置一个 polyglactin 复丝合成可吸收材料的简单结扎。
   2. 将远端结扎距离近端结扎2厘米。
      注意: 使用复丝缝合材料制成的简单连字沿肠道放置, 以创建密封段。架构 (图 1) 描述了所有连字的位置。循环由近端和远端连字隔开, 由2厘米分隔。
2. 创建 interloop 号1。
   1. 将一个简单的连字0.5 厘米 aborally 到1号环路的远端结扎。
      注意: 在连续循环之间, 有1厘米的 interloops,即在循环之间进行物理分离的线段。为了可能降低交叉污染的可能风险从一个循环到另一个, 一个简单的连字被放置在中间的 interloop (0.5 厘米从远端和近端结扎2相邻的环路)。这样可以减少循环中可能泄漏的污染物的风险, 从而达到相邻环路的连字。这些段不是强制性的, 但会降低交叉污染的风险。
3. 创建后续循环和 interloops。
   1. 重复步骤4.1 和4.2 以获取所需的循环数。
      注意: 在本实验中, 创建了9循环和 8 interloops。总长度达26厘米。根据研究, 可以调整循环数。

5.荚梭菌注射到循环中

1. 注射与无菌注射器和针 26 G 的病原体在环路 no. 1。用45°的角度轻轻地将针头插入肠道的 antimesenteric 侧。
   注: 在本实验中, 在每个循环中注射了0.2 毫升脑心脏输液 (BHI), 其中含有 1 x 10⁶的荚在中对数生长阶段的菌落形成单元。5种不同菌株注射在5个不同的循环和4剩余的循环被注射了阴性控制不含细菌 (无菌 BHI), 交替病原体和无菌 BHI 循环。
2. 重复步骤5.1 以注入所有循环。
3. 在腹腔的背区, 在气囊下面轻轻地替换肠道。

6. 腹腔闭合

1. 腹膜和腹部肌肉的缝合。
   1. 缝合腹膜和腹部肌肉沿骨盆 (步骤 3.3) 与一个简单的连续缝合模式使用 polyglactin 复丝合成可吸收材料。
   2. 将腹膜和腹部肌肉从胸骨缝合到泄殖腔 (在步骤3.3 中进行. 使用 polyglactin 复丝合成可吸收材料的简单连续缝合模式。
2. 皮肤的缝合。
   1. 使用 polyglactin 复丝合成材料和简单的连续缝合图案, 在步骤3.2 中的骨盆上闭合皮肤切口。
   2. 使用相同的复丝结扎材料和简单的连续缝合模式, 关闭皮肤切口从胸骨到在步骤3.2 中所做的泄殖腔。

7. 结论

1. 手术后, 保持鸡在全身麻醉下适当使用止痛药, 以尽量减少在感染时间的动物疼痛。继续麻醉监测, 以确保足够的麻醉水平。
2. 在所需的感染时间后, 在全身麻醉下, 人道安乐死鸡颈脱位。
   注意: 对于这些过程, 所需的时间诱导显微病变与C. 荚致病菌株是7小时。
3. 用手术刀刀片 #3, 切0.5 厘米到1厘米长的循环部分, 并将其放置在10% 福尔马林, 用于固定过夜和进一步的病理组织学分析。
4. 使用相同的手术刀刀片, 剪切剩余的循环部分并将其放置在无菌微量离心管中, 以便在每个循环中分离荚菌株, 进一步细菌学分析其基因表征。
5. 通过在每个循环之间更改手术刀刀片, 对所有循环重复步骤7.2 和7.3。

Results

图 1显示了9肠道循环和 8 interloops 的示意图。在此模型中, 使用简单连字创建总共9个循环和 8 interloops。一个循环由近端和远端连字间隔2厘米测量从近距离结扎。两个相邻的环路由1厘米的 interloop 隔开。为了减少交叉污染循环之间的可能的风险从一个连字的泄漏, interloop 连字被放置在中间的方式从远端结扎和近端结扎2相邻环路。循环的数量可以根据研究的要求进行调整。

图 1: 结扎肠循环的示意图表示.请点击这里查看这个数字...

Discussion

肠道循环模型已被描述在许多物种, 以研究寄主病原体相互作用和疾病的发病机制, 如梭菌荚, 梭杆菌和沙门氏菌起因^7,9,13,14,15。它也被用来分析黏膜免疫反应¹⁶, 抗体的效果, 以消除肠道病原体排泄的细菌毒素¹¹和评估疫苗候选者预防肠道疾病¹⁰.然而, 这个模型使用大量的结扎循环在单个单独的动物是不太描述在鸡和标准化这项技术是强制性的, 以获得有效的结果, 因为不当的操作可能会导致错误的结果和误解.这份手稿显示了9个连续结扎环位于鸡胃肠道的空肠和回肠。本研究使用了特定的病原体免费 (SPF) 里窝那雄性鸡, 体重介...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% 葡萄糖酸氯己定洗涤剂浸渍无菌刷。无可用的目录号。网址：https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
异丙醇 70% USP 4 L	商业异丙醇	P016IP70	： http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine	Sigma-Aldrich	282227-1G	葡萄糖酸氯己定溶液，必须稀释至 4%。网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
单小（27 英寸 x 24 英寸），带 3 x 6 英寸门窗	兽医特色产品	32724	网址：http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
手术刀刀片 #3	Swann-Morton	301	网址：https://www.swann-morton.com/product/16.php
无菌盐水 NaCl 0.9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Polyglactin 复丝可吸收缝合材料。网址：http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
注射器 1 ml，带 26G 针头	Becton Dickinson and Company	329652	：https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf 管	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	微量离心管。网址：http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
福尔马林溶液，缓冲中性，10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	比例组织：福尔马林为 1：10，用于充分固定。网址： http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
产气荚膜梭菌菌株	Université de Montréal， Chaire en recherche avicole	N/A	特定于每个实验室，可应要求提供给相应的作者