本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。
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本文内容
摘要
摘要
GABA能中间神经元（INs）是驱动认知与行为的神经网络中的关键组分。这些最终定位于大脑皮层的中间神经元，会从端脑腹侧区域（包括内侧和尾侧神经节隆起（MGE、CGE））起源处沿切线方向迁移至背侧皮层板，此过程受到多种内在与外在信号的调控。多年来，研究人员已开发出多种方法，用于在基因水平上操控特定通路，并探究其如何调控中间神经元正常迁移所必需的动态细胞骨架变化。在体电穿孔技术已被广泛用于研究基因抑制或过表达对特定中间神经元亚型的影响，同时评估其对细胞形态及最终定位的作用。然而，尽管该方法常用于改造径向迁移的锥体细胞，但在靶向中间神经元时技术难度更高。在体电穿孔的效率较低，尤其在胚胎发育14.5天前（e14.5）进行操作时，幼鼠存活率下降，而研究MGE来源的中间神经元通常需要在此时间点之前进行电穿孔。另一种替代方法是使用MGE组织块培养，该方法便于获取MGE组织，并利于对基因修饰的中间神经元进行成像观察。然而，在此类组织块中，中间神经元迁移进入的是人工基质，缺乏内源性引导信号和丘脑输入。因此，我们致力于优化一种方法，使中间神经元能够在更接近自然的环境中迁移，同时规避在体操作的技术难题。本文中，我们描述了一种结合体外电穿孔与器官型脑片培养的技术流程，可便捷地追踪、成像并重建沿天然路径迁移的基因修饰中间神经元，这些迁移过程响应于内源性信号。该方法不仅可通过共聚焦延时成像对中间神经元迁移的动态特征进行定量分析，还可通过对固定后免疫标记组织的神经元形态重建，详细分析多种形态学参数。
引言
皮层GABA能中间神经元（INs）在生化特性、生理特性和连接方式上具有高度多样性，其在成熟神经网络中介导不同的功能1,2,3,4,5。不同亚型皮层INs的特化过程受到遗传级联机制的严格调控，该机制已被广泛研究1,2。大多数（70%）皮层GABA能INs起源于位于腹侧的胚胎结构——内侧神经节隆起（MGE）中的前体细胞，必须经过较长距离迁移才能到达皮层板1,2,6。与沿着放射状胶质支架从脑室区（VZ）向皮层板进行径向迁移的皮层锥体细胞不同，中间神经元的切向迁移并不依赖此类支架，因此需要多种内在和外在信号引导其朝向皮层板迁移，同时使其远离非皮层结构2,7,
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方案
所有涉及动物的实验均经CHU Sainte-Justine研究中心动物研究伦理实践委员会（CIBPAR）批准，并依照加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》（第2版）的规定进行。
本方案经过优化，适用于胚胎发育第13.5天（e13.5）的胚胎电穿孔，此时正处在MGE来源的中间神经元（INs）活跃生成、而CGE来源的INs尚未达到生成高峰的阶段45,46。此外，为了使电穿孔偏向于GABA能中间神经元，我们采用在中间神经元中特异性表达的启动子（例如带有最小增强子的Dlx5/6启动子）47。
1. 电穿孔与器官型脑片培养用溶液的制备
- 准备 125 mL 无菌培养基。
- 在先前经紫外线灭菌并喷洒 70% 乙醇的生物安全柜中，将 125 mL 常规神经元特异性培养基（配方见材料表）量取至无菌瓶内。加入 2.25 mL 的 50 倍无血清神经元特异性添加剂、1.75 mL 的 200 mM 谷氨酰胺（终浓度为 0.5 mM）以及 6.25 mL 已在无菌条件下分装的热灭活马血清。充分混匀后，分装至 15 mL 无菌锥形管中，4 °C 保存。
注意：配制....
- 在先前经紫外线灭菌并喷洒 70% 乙醇的生物安全柜中，将 125 mL 常规神经元特异性培养基（配方见材料表）量取至无菌瓶内。加入 2.25 mL 的 50 倍无血清神经元特异性添加剂、1.75 mL 的 200 mM 谷氨酰胺（终浓度为 0.5 mM）以及 6.25 mL 已在无菌条件下分装的热灭活马血清。充分混匀后，分装至 15 mL 无菌锥形管中，4 °C 保存。
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结果
本部分展示了在 e13.5 小鼠胚胎的 MGE 中进行 ex utero 电穿孔转染对照质粒或靶向目的基因的实验质粒后，通过器官型脑片培养在 37 °C 下孵育 48 小时（用于延时成像）或 72 小时（用于固定和免疫组织化学标记）所获得的代表性结果（实验流程示意图见图1B）。同时展示了来自 MGE 外植体的中间神经元迁移的代表性示例（实验流程示意图见图1C），以与本文所述方法进行对比。在 MGE 前体细胞中进行质粒电穿孔似乎会延迟中间神经元从 MGE 的迁移，因此需相应调整培养时间。
在成功的实验中，活体组织切片在共聚焦显微镜下呈现健康状态，即在明场模式下皮质层清晰可辨，切片表面无可见污染（通过强烈的自发荧光及表层荧光细丝的存在，在落射荧光下可识别）。在健康的慢性活体组织切片中，约20%的细胞在培养72小时后发生凋.......
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讨论
本文中，我们提供了一种可靠的执行方法 子宫外 在e13.5时期对小鼠MGE进行电穿孔并制备胚胎脑切片的器官型培养。尽管 体外 方法，如Boyden小室实验，操作相对简便，可用于评估不同基因和蛋白质的特定作用，且不受其他因素干扰，但无法用于研究IN迁移的动力学特征，包括迁移方向性和迁移路径。25MGE外植体为研究IN迁移过程中发生的动态细胞骨架变化提供了一种有效手段（如本研究所示），但其缺乏大多数内源性信号，通常需要添加导向信号以促进神经元迁移（尽管当MGE外植体培养在皮层饲养层上时，此情况可显著改善）。25,54然而，基于MGE外植体的检测方法可能无法发现参与较细微机制（如指导中间神经元特定方向性或迁移路径）的分子信号的作用29。这一问题最终通过以下方法得以解决： 在子宫内 电穿孔25，可在其原生环境中对源自MGE的迁移性中间.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。本文所表达的观点不一定代表加拿大卫生部长或加拿大政府的观点。
致谢
本工作获得了萨沃伊基金会和CURE癫痫基金会的运营资助，以及加拿大创新基金会向E.R.（共聚焦显微镜）和G.H.（转盘共聚焦显微镜）提供的设备资助。E.R. 获得了职业奖项 魁北克卫生研究基金会 （FRQ-S；临床科学家奖）以及加拿大卫生研究院（CIHR；青年研究者奖）。G.H. 是 FRQ-S 的资深学者。L.E. 获得了萨沃伊基金会颁发的斯特里亚德-萨沃伊博士后培训奖、圣心大学医院中心基金会博士后培训奖以及 FRQ-S 博士后培训奖，后一项奖项由星辰基金会合作资助。本项目由 Brain Canada 通过加拿大脑研究基金资助，并获得加拿大卫生部的资金支持，该资助授予 L.E.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 21103049 | 市售的神经元特异性培养基。完整配方请见此网站：https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 无血清添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | 50倍无血清神经元专用添加剂 |
| 15 mL 无菌离心管 | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz (1X) L-15 培养基（含 L-谷氨酰胺） | 赛默飞世尔科技 | 11415064 | 市售的神经细胞培养基，添加了氨基酸、维生素和无机盐。完整配方见于经销商网站 |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-081 | |
| 马血清，热灭活 | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| 神经细胞培养补充剂 N-2 100X | Wisent | 305-016 | 博特斯坦N-2培养基配方 |
| VWR 方形 PETG 培养基瓶 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| II类A型生物安全柜 | Nuaire | NU-540 | |
| 蔗糖 | BioShop | SUC700.1 | |
| 氯化钠 | BioShop | SOD001.1 | |
| 碳酸氢钠 | 赛默飞世尔科技 | S233-500 | |
| D+葡萄糖 | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| 氯化钾 | 赛默飞世尔科技 | P217-500 | |
| 无水磷酸二氢钠 | BioShop | SPM400.500 | |
| 二水合氯化钙 | 赛默飞世尔科技 | C79-500 | |
| 七水硫酸镁 | BiosShop | MAG522 | |
| 琼脂糖 | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL 无菌离心管 | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL 离心管 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 内径0.4 mm × 75 mm毛细管 | Drummond Scientific | 1-000-800/12 | |
| 乙醇 | VWR | E193 | |
| 5 mL 注射器 | Becton Dickinson & 公司 | 309646 | |
| 矿物油（重质） | Rougier Pharma | ||
| WPI 瑞士镊子 #5 | 世界精密仪器公司 | 504511 | 11 厘米，直型，0.06×0.07 毫米尖端，抗磁性。您需要 2 把此类工具。 |
| WPI 瑞士镊子 #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 厘米，0.18×0.2 毫米，弯曲尖端 |
| HTC 镊子 | World Precision Instruments | 504617 | 11 厘米，直形，扁平 |
| 手术剪操作 | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm，双刃锋利，直型。此类器械需准备3把。 |
| 持针器 | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm，直型，带锯齿 |
| 虹膜镊 | 世界精密仪器公司 | 504478 | 10.2 厘米，全弧形，锯齿状 |
| 德贝基组织镊 | World Precision Instruments | 501996 | 15 厘米，45° 角度，精细下颌钳，1.5 mm 宽 |
| Fisherbrand 微型刮刀，两端呈圆形 | FisherScientific | 21-401-5 | 你需要准备两个。 |
| Nanoject II 自动纳升注射仪 | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| TC培养皿 60，标准型 | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm 培养皿 |
| 组织培养皿 | Sarstedt | 83.1800 | 35 mm 培养皿 |
| 黑色石蜡 | FisherScientific | S17432 | |
| 移液管 | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL，小号球泡 |
| 体视显微镜 | Leica Biosystems | Leica M80 | 替代我们已停产的体视显微镜（FisherScientific 公司的 StereoMaster） |
| 电穿孔仪 | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| 镊子电极，铂镀层，3毫米 | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & 公司 | 305127 | |
| Leica VT1000S 振动切片机 | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM，单边剃须刀片 | 电子显微镜科学公司 | 71952-10 | 在将组织插入振动切片机的指定刀片位置之前，先切除钝端 |
| µ-滑动8孔板 | Ibidi | 80827 | 15个装 |
| Millipore细胞培养小室 | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 毫米，亲水性聚四氟乙烯，0.4 微米 µm孔，50个装 |
| Leica DMi6000 显微镜 | 徕卡显微系统 | N/A | |
| 旋转盘共聚焦显微镜头 Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 采集软件 | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell 显微镜载物台顶部培养系统 | 病理学设备 | LC30030 | 提供温度、CO2和湿度控制。 |
| SP8 共聚焦显微镜 | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Michael Davidson 惠赠 |
| 快绿 FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G 瓶，经生物染色剂委员会认证 |
参考文献
- Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325(2011).
- Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy.....
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