整合影像流式细胞仪和转录组分析, 评估改变的内吞 CD1d 贩运

Manju Sharma; Xiang Zhang; Shouxiong Huang

doi:10.3791/57528

Method Article

整合影像流式细胞仪和转录组分析, 评估改变的内吞 CD1d 贩运

DOI:

10.3791/57528

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October 29th, 2018

Manju Sharma¹ , Xiang Zhang¹ , Shouxiong Huang¹

¹Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

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成像流式细胞术提供了一种理想的方法来检测细胞在个体和种群水平的形态学和功能改变。对污染物暴露的人树突状细胞中脂质抗原表达的破坏内吞功能进行了转录组基因表达和蛋白质贩运形态表现的综合分析。

Abstract

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种群分析内吞蛋白的形态和功能变化, 是由于单细胞水平的图像采集需求和种群水平的统计图像分析所带来的挑战。为了克服这一困难, 我们使用了成像流式细胞仪和转录组分析 (RNA 序列) 来确定分化1d 蛋白 (CD1d) 与人内吞基因表达受损相关的亚细胞定位树突状细胞 (DCs), 暴露于常见的亲油性空气污染物苯并 (a) 芘。用想法和 ImageJ-斐济方案分析了数以千计的细胞图像采集的 CD1d 和内吞标记 Lamp1 蛋白的共定位。在 CD1d⁺Lamp1⁺ DCs 的控制下, 使用 CD1d 和 Lamp1 蛋白的多种蜂窝图像进行了可视化处理。在 BaP 曝光时增强的 CD1d 和 Lamp1 共定位进一步证明使用阈值散点图, 用 Mander 的系数进行共局部强度测试, 并根据使用 ImageJ-斐济的共同本地化区域的百分比进行绘制。我们的数据提供了一种有利的工具和生物信息学方法, 用于测量单个和种群细胞水平的蛋白质共定位, 支持在污染物暴露的人类中转录组变化的功能性结果受损。Dcs。

Introduction

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抗原呈现通常涉及细胞内蛋白的贩运, 这是经常调查使用的形态学表征和表型分析的抗原呈现细胞¹^,²^,³.为了整合成像和分型方法的优点, 我们描述了在单细胞和种群水平的成像分析平台, 以演示在人类树突状细胞 (DCs) 中改变的蛋白质共定位。在多肽抗原表达中, 主要的组织相容复合物 (MHC) I 类分子结合在内质网中的短肽 (8-10 残留物) 激活传统的 CD8⁺ T 细胞, 而 MHC II 类分子结合一个相对较长的内吞中的肽 (约20个残留物) 激活常规 CD4⁺ T 细胞¹^,⁴。相比之下, 脂质特异性 T 细胞是由 CD1 蛋白激活的, 脂质抗原主要载于内吞夹层⁵^,⁶。脂质抗原的表现需要提供脂代谢产物在脂质新陈代谢⁷^,⁸^,⁹^,^....

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Protocol

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这项研究中的人类协议得到了辛辛那提大学机构审查委员会的批准, 所有方法都按照相关的指导方针和条例进行。来自辛辛那提大学医疗中心远见卓识血液中心的健康捐献者的血液样本获得。

1. 污染物暴露的人单核细胞源 DCs 的转录组分析

BaP 暴露 DCs 的总 RNA 提取
1. 使用细胞因子 GM 脑脊液和 IL-4 区分人 dcs, 并将 dcs 暴露在 BaP 中4天¹³。
2. 使用流式细胞仪对 BaP 公开的 DCs 进行排序基于表面表达的标记 (谱系^-HLA-DR⁺), 其中大部分由常规 DCs (CD11c⁺CD1c⁺)¹³组成。通常情况下, 将1万个 DCs 分类为包含 10% FBS 的培养基, 离心 dc 在 600 x g 和4摄氏度6分钟, 并使用1毫升移液头立即去除吸液。
3. 一旦通过吸入去除上清液, 在 rna 提取前, 从 rna 分离试剂盒中加入0.4 毫升裂解/结合缓冲液以储存-80 摄氏度, 裂解细胞颗粒。
4. 使用 rna 分离试剂盒与总 rna 提取协议提取总 rna¹⁴。使用 Bioanalyzer^....

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Results

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脂溶性污染物 BaP 改变了人类 DCs 中的内吞基因簇. 从每个捐献者 (n=3) 的人单核细胞衍生的 dcs 被孵化和排序为常规 DCs, 进一步用于 RNA 提取和转录组分析, 如所述.在基因表达正常化的基础上, 根据差异表达基因的功能相关性, 对 BaP 暴露和非暴露群体之间的改变基因进行聚类。我们将更改后的基因列表输入 Toppcluster 计划¹⁶ , 用于分析相关的细胞通路, 并使用错误发现率 (FDR) 校正p值进行统计测试 (图 1B)。在 BaP 暴露的 DCs 中, 发现了几种主要改变的基因簇, 包括脂代谢和内吞功能。在本研究中, 我们特别关注内吞的功能测试, 因为 CD1-mediated 抗原的表达高度依赖于内吞通路⁵^、¹⁹中的脂质抗原加载^, ^20.......

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Discussion

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改变基因通路的功能确认是有挑战性的, 因为广泛影响的基因表达涉及多个途径和困难, 以整合个人和种群细胞活动。我们使用影像流式细胞仪专门测试 CD1d 在内吞隔间的贩运。影像流式细胞仪集成了细胞的种群测量和多蛋白亚细胞共定位的个体演示。共聚焦显微镜在测量蛋白质共定位时提供了高分辨率, 流式细胞仪能够为不同的细胞群提供全面的分型。成像流式细胞仪将共聚焦显微镜和流式细胞术的优势与可接受的图像分辨率相结合, 以高姿态分析蛋白质共定位, 从而转录组环境变化的功能确认。污染物。

对多蛋白的共定位的分析在种群的规模是技术上要求, 因为 (i) 详细分析多个体细胞是劳动密集型和相对偏倚;(ii) 根据阳性染色的强度或面积, 很难确定解释重叠像素的最佳阈值;和 (iii) 对个体和种群细胞的平衡观察至关重要。在这项研究中, 我们专注于执行生物有意义的观察, 统计学意义测试, 和共同本地化的蛋白质的成像演示。为了实现这一目标, 我们首先使用成像流式细胞仪获得了数以千计的人 DCs 图像。图像文件的定量分析结合了一个明亮的细节相似性分析使用的软件思想和一个统计测试共定位分析使用斐济-ImageJ。该方案.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的

Acknowledgements

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作者感谢罗伯特 Giulitto (远见卓识血液中心) 的人血液样本和良牛医生的基因表达的规范化读。我们还感谢国家环境健康科学研究所 (ES006096)、环境遗传学中心 (CEG) 试点项目 (史绍熙)、国家过敏和传染性疾病研究所 (AI115358) (史绍熙) 的赠款支持, 大学辛辛那提大学研究委员会奖 (史绍熙) 和辛辛那提大学医学院核心增强资金 (x.z.)。

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
转录组学	Illumina	HiSeq 2500 v4	Illumina HiSeq 系统 ImagingStream
X	Millipore	100220	成像流式细胞术
mirVana miRNA 分离试剂盒	Thermo Fisher		总 RNA 提取
Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒	安捷伦		总 RNA QC 分析
Veriti 96 孔快速热循环仪	ThermoFisher		PCR、酶反应
NEBNext Poly（A） mRNA 磁性分离模块	New England Biolab		PolyA RNA 纯化
自动化 SMARTer Apollo 系统	Takara		PolyA RNA 纯化
NEBNext Ultra RNA 文库 Illumina	制备试剂盒 New England Biolab		文库制备
Agencourt AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter		DNA 纯化
2100 生物分析仪	安捷伦		文库 QC，大小分布分析
安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒	安捷伦		文库 QC，大小分布分析
QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统（Thermo Fisher）	Thermo Fisher		文库定量
NEBNext 文库定量试剂盒	New England Biolab		文库定量
cBot	Illumina		文库簇生成
TruSeq SR 簇试剂盒 v3 - cBot –HS	Illumina		文库簇生成
HiSeq 1000	Illumina		测序
TruSeq SBS 试剂盒 v3 - HS（50 个循环）	Illumina		测序
藻红蛋白/花青素 7 （PE/Cy7）	Bio Legend	L243
藻红蛋白/花青素 5 （PE/Cy5）	Bio Legend	3.9
亮紫 421	BioLegend	L161
PE 抗小鼠 IgG2b	生物 Legend	51.1
Alexa Fluor 647 （AF647）	Bio Legend	CD107a（H4A3）查看原文查看译文

References

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Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....

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