成像流式细胞术为在单细胞和群体水平上检测细胞的形态学和功能改变提供了理想方法。通过结合基因表达的转录组学分析与蛋白质转运的形态学示证，揭示了暴露于污染物的人树突状细胞在脂质抗原呈递中的内吞功能受损。
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摘要
摘要
由于需要在单细胞水平上进行图像采集，并在群体水平上进行统计学图像分析，因此对内吞蛋白形态和功能改变的群体分析具有挑战性。为克服这一困难，我们采用成像流式细胞术和转录组测序（RNA-seq）技术，检测人树突状细胞（DCs）中分化簇1d蛋白（CD1d）亚细胞定位的改变情况，这些细胞暴露于常见的亲脂性空气污染物苯并[a]芘（benzo[a]pyrene）。利用成像流式细胞术获取数千个细胞图像后，通过IDEAS和ImageJ-Fiji软件分析CD1d与内吞标志物Lamp1蛋白的共定位情况。在IDEAS软件中对CD1d+Lamp1+ DCs设门后，可观察到大量共染色的CD1d和Lamp1蛋白的细胞图像。进一步通过设定阈值的散点图、基于Mander系数检测共定位强度，以及使用ImageJ-Fiji软件以共定位区域百分比作图，证实了BaP暴露后CD1d与Lamp1共定位增强。我们的数据提供了一种有利的仪器与生物信息学方法，可在单细胞和群体细胞水平上定量蛋白共定位，支持污染物暴露下人DCs中转录组改变导致功能受损的结论。
引言
抗原呈递通常涉及细胞内蛋白质的转运过程，这一过程常通过对抗原呈递细胞的形态学特征和表型分析来进行研究1,2,3。为了整合成像与表型分析方法的优势，我们描述了一种在单细胞和群体水平上均可应用的成像分析平台，用于展示人树突状细胞（DCs）中蛋白质共定位的变化。在肽类抗原呈递过程中，主要组织相容性复合体（MHC）I类分子在内质网中结合短肽（8–10个氨基酸残基），从而激活传统的CD8+ T细胞；而MHC II类分子则在内吞区室中结合相对较长的肽段（约20个残基），以激活传统的CD4+ T细胞1,4。相比之下，脂质特异性T细胞则由CD1蛋白在内吞区室中加载脂质抗原后激活5,6。脂质抗原呈递需要脂质代谢过程中产生的脂质代谢物的供应7,8,9,10，以及这些功能性脂质代谢物在内吞区室中向CD1蛋白的加载过程5,6。因此，明确调控脂质抗原呈递的各种细胞因子，尤其是在亲脂性污染物暴露和免疫紊乱等环境因素影响下，具有重要意义。在本研究中，我们采用转录组分析、图像表型分析以及人单核细胞来源的DCs的细胞与群体成像分析，以确定污染物暴露条件下参与脂质抗原呈递的内吞蛋白转运机制。显然，该联合分析平台也可应用于研究不同生物学过程中亚细胞水平的蛋白质转运与共定位现象。
从技术上讲，亚细胞蛋白定位通常通过共聚焦显微镜进行展示，并在有限数量的检测细胞中进行统计分析1,2,3,11。此外，流式细胞术已广泛应用于在单细胞水平上对多种蛋白共染信号的细胞群体进行设门分析12；然而，该方法缺乏对亚细胞蛋白共定位的详细可视化。为了在细胞和群体水平上实现对蛋白共定位比例的全面且具有统计学意义的分析，我们整合了成像分析与图像特征提取方法，以确定具有生物学意义的蛋白共定位特征。具体而言，本研究采用成像流式细胞术检测CD1d与溶酶体相关膜蛋白1（Lamp1）在细胞内的共定位情况。以往在群体规模上对共定位分子进行定量分析较为困难。在本研究中，我们改进了ImageJ-Fiji程序，用于在大量共染细胞中分析蛋白共定位比例，涵盖群体和单个细胞两个层面。具体而言，我们测量了共定位区域、荧光强度以及群体大小，以支持以下结论：在暴露于亲脂性污染物苯并[a]芘（BaP）后，CD1d蛋白在人树突状细胞（DCs）的晚期胞内体区室中大量滞留13。这种结合细胞与群体水平的成像分析方法，为CD1d-Lamp1共定位提供了高度可重复、全面且具有统计学显著性的结果，该结果与脂质抗原呈递受抑制密切相关。
BaP暴露的人树突状细胞转录组结果强烈支持这一假设，即BaP暴露会损害内吞性脂质代谢以及CD1d的内吞运输。为验证该假设，我们采用成像流式细胞术对共染了多种蛋白（包括CD1d、内吞标志物和树突状细胞标志物）的树突状细胞群体进行图像分析。最后，通过统计学方法分析共染细胞，以展示CD1d与Lamp1共定位的强度百分比和面积。
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方案
本研究中的人类实验方案已获得辛辛那提大学机构审查委员会的批准，所有方法均按照相关指南和规定进行。来自健康供体的血液样本由辛辛那提大学医学中心霍克斯沃思血液中心提供。
1. 污染物暴露下人单核细胞来源树突状细胞的转录组分析
- 暴露于BaP的DCs的总RNA提取
- 使用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导人树突状细胞分化，并用BaP处理DC 4天13.
- 根据表面表达标志物（Lineage），通过流式细胞术分选经BaP暴露的DCs-HLA-DR+），其中大部分为传统树突状细胞（CD11c+CD1c+)13通常，将10,000个树突状细胞（DCs）分选至含10% FBS的培养基中，于4 °C、600 x g离心6 min，随后使用1 mL移液器吸头抽吸去除上清液。
- 吸除上清液后，加入0.4 mL RNA提取试剂盒中的裂解/结合缓冲液，裂解细胞沉淀，随后于-80 °C保存，以备RNA提取。
- 使用RNA提取试剂盒，按照总RNA提取方案提取总RNA14使用Bioanalyzer检测RNA完整性15.
- 分选DC的转录组分析（图1A)
- 使用RNA文库制备试剂盒制备用于RNA测序的文库。简而言之，将分离得到的poly-A RNA片段化至约200 bp，将RNA片段逆转录为cDNA第一链，随后以掺入dUTP的方式合成cDNA第二链。
- 将双链cDNA在磁珠纯化、末端修复和dA加尾后，连接至具有茎环结构的接头。使用USER（Uracil-Specific Excision Reagent）酶切除cDNA第二链和接头环中的尿嘧啶残基，以保持链特异性并打开接头环用于后续PCR扩增。
- 使用通用引物和特异性索引引物进行13轮PCR扩增，以富集带索引的文库。纯化文库后，使用Bioanalyzer DNA高灵敏度芯片检测文库质量及片段大小分布。
- 使用文库定量试剂盒和实时PCR系统，结合文库大小信息进行定量 计算文库浓度 通过 标准曲线法
- 按比例 将带有独立索引的兼容文库分别混合，并将最终总体浓度调整至15 pM。进行文库簇生成，并在单端测序模式下以1×50 bp的读长进行测序。 每个样本产生约 2500 万条读长。
- 测序
- 将测序和索引试剂分别加入SBS和PE试剂架中。将试剂置于实验室级水浴中孵育1小时，直至所有冰完全融化，并确保每瓶/管中的试剂充分混匀。
- 将解冻的染料和 -20 °C 的酶加入瓶中配制 ICB 混合液，并混匀。根据测序说明书配制 NaOH 溶液。将所有试剂置于 4 °C 保存，待用时取出。
- 在1小时等待期间，打开测序仪电源。等待DONOTEJECT驱动器出现后，将计算机连接至网络驱动器。
- 启动测序仪控制软件。
- 准备 2 L 维持洗涤液，其中含有 0.5% Tween 20 和 0.03% ProClin 300，溶剂为实验室级水。
- 在 SBS 试剂架中，向 8 个瓶子中的每一个加入约 100 mL 维护洗涤液，并拧上漏斗盖。在 PE 试剂架中，向十个 15 mL 圆锥形离心管中的每一个加入约 12 mL 维护洗涤液，并丢弃管盖。
- 将装有溶液的瓶子/试管放入两个架子中，并装载到测序仪上。
- 从测序仪控制软件中选择“维护清洗”；按照屏幕上的说明清洗测序仪流体系统，直至流程完成。
- 开始新运行 "序列" 从软件中选择标签；将输出数据定向至网络驱动器。选择单端读取1x 50 bp的参数，并使用带单索引的多重文库。
- 可选择登录 BaseSpace Sequence Hub，以便通过计算机或智能手机远程监控测序进度。
- 上传用于解复用的样本表，并根据软件要求提供试剂信息。
- 将SBS和PE试剂加载到测序仪中。使用已用过的流动池对系统进行引液（约15分钟）。
- 簇生成完成后（约4.5小时），取出流动池，用清水轻轻喷洒流动池表面，并用镜头纸擦干。再用95%乙醇轻轻喷洒流动池，并擦干。在光源下检查，确保表面清洁，无残留物或盐析。
- 在完成扩增步骤后，加载带有簇的流动池并启动测序。序列分析查看器软件将自动启动。
- 通过 SAV 监测测序数据质量，包括簇密度、通过过滤的读段数、通过过滤的簇百分比、≥Q30 的百分比、传统阶段/前阶段百分比、索引质量控制 等等。 这有助于了解数据质量并进行故障排查。
- 更换流动池垫圈，并在测序完成后执行维护清洗。测序仪即可准备进行下一次运行。
- 生物信息学分析
- 进行生物信息学RNA-seq数据分析13.
2. 转录组谱的通路分析（图1B）
- 使用 edgeR Bioconductor 比较来自三位供体的 BaP 暴露组与非暴露组树突状细胞（DCs）之间的基因表达强度计数，然后根据绝对倍数变化（fold change）鉴定 BaP 暴露组与非暴露组 DCs 之间的差异表达基因>2 倍）和假发现率 （FDR）校正 p值（values）<0.05).
- 为预测差异表达基因的功能聚类，使用 ToppCluster 软件包将差异基因与包括 KEGG 和 REACTOME 在内的多个数据库进行比对，生成聚类数据。ToppCluster 采用超几何检验以获得功能富集结果 通过基因列表富集分析16.
- 进一步将这些功能簇的结果输入 Cytoscape17,18 版本3.3.0，一种广泛使用的开源可视化复杂网络软件平台。因此，参与不同簇或通路（包括内吞簇和脂质代谢）的基因以网络形式展示，并以颜色标注基因表达的平均倍数变化图1B)13.
3. CD1d 与 Lamp1 共定位的成像流式细胞术
- 暴露于 BaP 的 DCs 的抗体标记
- 将 0.5 × 106 个人源 DCs 暴露于 5.94 μM BaP 中，在 37 °C 条件下用 2 mL 完全 Dulbecco 改良 Eagle 培养基培养 4 天。以 400 × g 离心 10 分钟收集 DCs。在冰上用人血清阻断剂和抗人 Fc 受体抗体（包括抗人 CD16、CD32 和 CD64 抗体）孵育细胞 10 分钟，以阻断已分化的 DCs。
- 在冰上将 Brilliant Violet 421-抗 CD1c (L161)、藻红蛋白/花青素 7 (PE/Cy7)-抗 HLA-DR 以及 PE/Cy5-抗 CD11c 与 DCs 共孵育 20 分钟。表 1 列出了这些抗体。
- 用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定 DCs，并用通透洗涤缓冲液进行通透处理。使用 PE 标记的纯化抗人 CD1d (51.1) 抗体与 Alexa Fluor 647 标记的抗 Lamp1 (CD107a) (H4A3) 抗体混合物进行细胞内染色。
- 成像流式细胞术检测（图 2）
- 使用辛辛那提儿童医院流式细胞术核心的成像流式细胞仪，以 40X 物镜分析染色样本，使直径约为 10 μm 的细胞成像为 300 像素。每个像素大小约为 0.5 μm × 0.5 μm。
- 根据制造商说明书，无偏地获取 10,000 个细胞图像。
4. 流式细胞术图像的成像分析
- 使用 IDEAS 软件进行共定位分析（图 2）
- 通过单染色与未染色样本进行补偿，将未染色样本的荧光强度设置在阈值以下，包括经 BaP 暴露后具有 BaP 自发荧光的未染色树突状细胞（DC），方法同常规流式细胞术数据分析。
- 设门选择染色细胞，获得 HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ 细胞亚群（图 2A），并在设门后的亚群中显示细胞图像（图 2B）。
- 根据两个技术性纳入标准——共染信号的明显存在以及 CD1d 与 Lamp1 蛋白的亚细胞定位，将细胞图像以 png 格式保存，用于后续 ImageJ-Fiji 软件的共定位分析（图 2B）。
- 使用 ImageJ-Fiji 软件进行共定位分析（图 3）。
- 分别合并保存的 100 张未暴露组和 BaP 暴露组人源树突状细胞的图像，准备输入图像文件（图 3A）。
- 利用散点图分析 CD1d（红色）与 Lamp1（绿色）的共定位情况。
- 运行 ImageJ-Fiji 程序，打开包含 100 张细胞图像的 .png 文件（图 3B 和 图 4A）："文件 | 打开"。
- 将红绿通道合并的图像拆分为仅含红色或绿色通道的两张图像："图像 | 颜色 | 拆分通道"。
- 使用命令 "分析 | 共定位 | 共定位阈值" 绘制散点图。使用 "PrintScreen" 键保存散点图。
- 计算每张单细胞图像（n=100）的 Mander 共定位系数（图 4B）
- 在已拆分通道的图像文件中，使用 "椭圆" 选区工具选择单个细胞图像。
- 使用命令 "分析 | 共定位 | 共定位阈值"，在兴趣区域（ROI）对话框中选择 "通道 1"，并保留所有计算选项，包括为每张细胞图像计算 "Mander 系数（使用阈值）"。
- 对全部 100 张细胞图像重复此计算。
- 使用电子表格保存并打开结果。
- 绘制“经阈值处理的 Mander 系数”的平均值与标准误（n=100，0 表示无共定位，1 表示完全共定位）。使用 Student t 检验计算 BaP 暴露组与未暴露组之间的 p 值（图 4B）。
- 计算多张细胞图像（n=100）中 CD1d 与 Lamp1 之间经阈值处理的像素强度共定位百分比（图 4C）。
- 采用与步骤 4.2.3 相同的分析流程，并额外选择结果选项 "% 强度高于阈值的共定位像素"。
- 将此项分析与 Mander 共定位系数分析同步进行。
- 类似地绘制 CD1d 与 Lamp1 之间共定位强度百分比的平均值与标准误。使用 Student t 检验计算 BaP 暴露组与未暴露组之间比较的 p 值（图 4C）。
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结果
亲脂性污染物 BaP 会改变人树突状细胞（DC）中的内吞基因簇。来自每位供体（n=3）的人单核细胞来源的树突状细胞经 BaP 处理后，分选获得传统树突状细胞，并进一步用于如文中所述的 RNA 提取和转录组分析。在对基因表达数据进行标准化后，根据差异表达基因的功能相关性，对 BaP 暴露组与非暴露组之间的差异基因进行聚类分析。我们将差异基因列表输入 Toppcluster 程序16，以分析相关细胞通路，并采用错误发现率（FDR）校正 p 值进行统计学检验（图 1B）。在 BaP 暴露的树突状细胞中，鉴定出多个显著改变的基因簇，包括脂质代谢和内吞功能相关的基因簇。本研究特别关注内吞运输功能的检测，因为 CD1 介导的抗原呈递高度依赖于内吞途径中的脂质抗原加载过程5,19,20
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讨论
功能验证基因通路的改变具有挑战性，因为基因表达受到广泛影响，涉及多条通路，且难以 整合单个细胞与群体细胞的活动。我们采用成像流式细胞术特异性检测CD1d在内吞区室中的转运。成像流式细胞术结合了细胞群体水平的定量分析与多种蛋白质亚细胞共定位的个体化示意图展示。共聚焦显微镜以往在蛋白质共定位测量方面提供了高分辨率，而流式细胞术能够对不同细胞群体进行全面的表型分析。成像流式细胞术在可接受的图像分辨率下，融合了共聚焦显微镜与流式细胞术的优势，以高通量方式分析蛋白质共定位，从而对环境污染物引起的转录组改变进行功能验证。
在群体水平上对多种蛋白质的共定位进行分析在技术上具有较高要求，原因在于：（i）对大量单个细胞进行详细分析费时费力且存在相对偏倚；（ii）基于阳性染色的强度或面积，难以确定解释重叠像素的最佳阈值；（iii）对单个细胞与群体细胞的平衡观察至关重要。在本研究中，我们致力于实现具有生物学意义的观察、统计学显著性检验以及共定位蛋白质的成像展示。为实现这一目标，我们首先利用成像流式细胞术获取了数千张人树突状细胞（DCs）的图像。对图像文件的定量分析结合了使用IDEAS软件进行的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者感谢 Robert Giulitto（Hoxworth 血液中心）提供人血液样本，以及 Liang Niu 博士在基因表达数据标准化方面的帮助。本研究还获得了美国国家环境卫生科学研究所（ES006096）、环境基因组学中心（CEG）试点项目（S.H.）、美国国家过敏与传染病研究所（AI115358）（S.H.）、辛辛那提大学大学研究委员会奖（S.H.）以及辛辛那提大学医学院核心发展基金（X. Z.）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 转录组学 | 因美纳 | HiSeq 2500 v4 | 因美纳 HiSeq 系统 |
| ImagingStream X | 默克密理博 | 100220 | 成像流式细胞术 |
| mirVana miRNA 提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 总 RNA 提取 | |
| 安捷伦 RNA 6000 Pico 试剂盒 | 安捷伦 | 总 RNA 质控分析 | |
| Veriti 96 孔快速热循环仪 | 赛默飞世尔科技 | PCR、酶反应 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA 磁珠分离模块 | 新英格兰生物实验室 | PolyA RNA 纯化 | |
| 自动化 SMARTer Apollo 系统 | 宝生物工程 | PolyA RNA 纯化 | |
| NEBNext Ultra RNA 文库构建试剂盒（适用于因美纳平台） | 新英格兰生物实验室 | 文库构建 | |
| Agencourt AMPure XP 磁珠 | 贝克曼库尔特 | DNA 纯化 | |
| 2100 生物分析仪 | 安捷伦 | 文库质控、片段大小分布分析 | |
| 安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒 | 安捷伦 | 文库质控、片段大小分布分析 | |
| QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统（赛默飞世尔科技） | 赛默飞世尔科技 | 文库定量 | |
| NEBNext 文库定量试剂盒 | 新英格兰生物实验室 | 文库定量 | |
| cBot | 因美纳 | 文库簇生成 | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | 因美纳 | 文库簇生成 | |
| HiSeq 1000 | 因美纳 | 测序 | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS（50 个循环） | 因美纳 | 测序 | |
| 藻红蛋白/花青素 7（PE/Cy7） | 生物传奇 | L243 | |
| 藻红蛋白/花青素 5（PE/Cy5） | 生物传奇 | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | 生物传奇 | L161 | |
| PE-抗小鼠 IgG2b | 生物传奇 | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647（AF647） | 生物传奇 | CD107a(H4A3) |
参考文献
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