脊髓性肌萎缩症患者成纤维细胞中剪接转换反义寡核苷酸诱导外显子包含的评估

摘要

多种反义寡核苷酸（AONs）已被证明可诱导外显子包含（剪接调控），并恢复脊髓性肌萎缩症（SMA）中SMN蛋白的表达。本文描述了一种通过AON脂质转染诱导SMN2基因外显子包含的实验方案，以及用于评估SMA患者成纤维细胞中该干预效果的检测方法。

摘要

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种由于运动神经元存活基因1（SMN1）缺失或突变导致SMN蛋白缺乏而引起的致命性神经系统疾病 SMN1，为反义寡核苷酸（AON）介导治疗领域提供了一个独特的案例。尽管 SMN1 突变是导致该疾病的原因，靶向内含子剪接沉默子（ISS）位点的AONs SMN2，包括美国食品药品监督管理局（FDA）批准的诺西那生钠（nusinersen），已被证明可恢复SMN表达并改善症状。目前，许多针对脊髓性肌萎缩症（SMA）的反义寡核苷酸（AON）疗法研究集中在探索靶向新型AON化学结构 SMN2 可能比诺西那生更有效且毒性更低。本文中，我们描述了一种实验方案 体外 使用反义寡核苷酸脂质转染结合逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、定量聚合酶链式反应（qPCR）和蛋白质印迹法评估外显子包含情况。该方法适用于多种类型的反义寡核苷酸化学修饰。通过该方法，我们证明由交替的锁核酸（LNA）与DNA核苷酸（LNA/DNA混聚体）组成的反义寡核苷酸可有效促进外显子包含 SMN2 外显子包含及SMN蛋白在极低浓度下的恢复，因此，基于LNA/DNA混合体的反义寡核苷酸可能是治疗由遗传性疾病引起的剪接缺陷的一种有前景的治疗策略。 体外 此处描述的评估方法快速、简便，且具有足够的灵敏度，可用于测试多种新型反义寡核苷酸（AONs）。

引言

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种以常染色体隐性方式遗传的致命性神经肌肉疾病，其特征是运动神经元退化以及躯干和四肢肌肉进行性瘫痪^1,2。大多数SMA病例是由于运动神经元存活基因1（SMN1）发生纯合突变所致³。运动神经元存活基因2（SMN2）是SMN1的一个反向重复拷贝，其序列几乎完全相同，仅存在五个碱基的差异^4,5。位于外显子7内的SMN2基因发生C-to-T转换，导致该基因功能几乎丧失，因为该突变使得在近90%的SMN2转录本中关键的外显子7被跳过（图1a）。缺失外显子7的SMN2 mRNA无法弥补SMN1的功能缺陷，因其编码的蛋白质产物不稳定且迅速被降解。

反义寡核苷酸疗法最近已成为治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的一种非常有前景的策略⁶美国食品药品监督管理局（FDA）最近批准了诺西那生钠（nusinersen），使其成为首个可用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物⁷Nusinersen 是一种18聚体反义寡核苷酸（AON），具有2′-O-甲氧乙基修饰（MOE）和硫代磷酸酯骨架。该药物靶向位于SMN2基因第7内含子内的内含子剪接沉默子N1（ISS-N1）。 SMN2 基因。诺西那生与ISS-N1结合可促进内源性全长功能性SMN蛋白表达的恢复 SMN2 通过诱导外显子7包含来调控基因（图1a)^8,9,10目前，许多涉及脊髓性肌萎缩症（SMA）反义寡核苷酸（AON）治疗的研究，正致力于探索可能比诺西那生（nusinersen）更有效且毒性更低的新型AON化学修饰。已有研究表明，采用其他化学修饰的AON同样能高效诱导外显子包含 SMN2 外显子7两者 体外 和 体内^11,12,13.

锁核酸（Locked nucleic acids, LNAs）是一类化学修饰的RNA类似物，其结构中含有连接2′-氧和4′-碳的亚甲基桥碳 with the 2′-氧气 在呋喃糖结构内（图1b)^14,15与DNA或RNA相比，LNA与互补RNA序列结合的亲和力更高，并且具有高度抵抗内源性核酸酶降解的额外优势。LNA化学已被应用于荧光探针的开发与使用 原位 荧光原位杂交（FISH）和qPCR^16,17。此外，它也被用于调控基因表达，包括转录和转录后水平 体外 和 体内GapmeR 反义寡核苷酸（AONs）是由单链DNA分子构成，其5′和3′端侧翼连接多个锁核酸（LNA）。它们通过与靶向mRNA互补结合，激活RNase H，导致mRNA降解，从而实现基因表达的敲低。¹⁸LNA/DNA混合寡核苷酸是由DNA核苷酸插入锁核酸（LNA）之间组成的反义寡核苷酸。以这种排列方式，它们可结合miRNA并抑制其功能（LNA-antimiR）。¹⁹一些LNA-antimiR已进入临床开发阶段。例如，miravirsen（AntimiR-122）是一种抑制miR-122的LNA-antimiR，用于治疗丙型肝炎病毒感染，目前正在进行多项II期临床试验^19,20最近有研究表明，LNA/DNA混合物也能调控RNA剪接²¹。它可结合特定序列的mRNA，诱导抗肌萎缩蛋白mRNA的外显子跳跃以及外显子包含 SMN2 mRNA 体外^13,22.

本文概述了一种利用反义寡核苷酸（AONs）诱导外显子包含，并在RNA和蛋白质水平上评估其效果的方法。为示范该方法，我们采用了靶向SMN2基因第7内含子中ISS-N1位点的LNA/DNA混合体。通过脂质转染将AONs导入脊髓性肌萎缩症（SMA）患者细胞后，可诱导SMN2终末转录本中外显子7的包含，并上调SMN蛋白的表达。使用LNA/DNA混合体诱导外显子包含的优势之一在于，其有效转染浓度显著低于其他化学修饰的寡核苷酸¹³。该方法适用于多种其他AONs，但不适用于磷酸二酰胺吗啉代寡聚体（PMOs），由于PMOs呈电中性，必须依赖Endo-Porter共转染试剂诱导的内吞作用进入细胞。

方案

1. 细胞培养

1. 在37 °C、CO₂ 培养箱中，使用生长培养基（DMEM/F12 1:1 混合培养基，含10%胎牛血清（FBS）和0.5%青霉素/链霉素）培养脊髓性肌萎缩症（SMA）患者成纤维细胞。
2. 使用自动细胞计数仪测定细胞浓度，将细胞用生长培养基稀释至1 × 10⁵ 个细胞/mL，然后接种至合适的培养板中。进行RT-PCR或qPCR时，使用12孔板（每孔1 mL）。
3. 将培养板置于37 °C、CO₂ 培养箱中孵育24小时。

2. LNA/DNA 混合物转染

1. 确保细胞汇合度在65 –80%之间，以获得最佳转染效率。
2. 将10 μM LNA/DNA混合物置于冰上缓慢解冻。
3. 在1.5 mL离心管中，将混合物加入无血清培养基中，配制20倍浓度的混合物溶液，终体积为50 μL。
4. 将混合物溶液与含有3%转染试剂的50 μL无血清培养基（1:1比例）混合。
5. 室温孵育10分钟。
6. 向每管中加入900 μL含5% FBS的无血清培养基。
7. 吸除培养板中的旧培养基，每孔加入1 mL含有转染试剂的LNA/DNA混合物溶液。
8. 将细胞在37 °C、CO₂培养箱中孵育24–48小时。

3. RNA 提取

1. 吸去培养基，向细胞中加入 1 mL 异硫氰酸胍-苯酚-氯仿试剂。用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿反复冲洗孔底数次，并将液体收集至 1.5 mL 离心管中。
2. 高速涡旋振荡 30 秒，于 -80 °C 保存 1 小时或过夜。
3. 在室温下解冻样品，并充分涡旋振荡。
4. 加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温孵育 3 分钟。
5. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
6. 将上层透明的水相转移至新离心管中。注意避免吸取上下两相之间的白色中间层。
7. 加入 500 µL 异丙醇和 1 µL 8 µg/µL 甘油原（RNA 级）。涡旋振荡 10 秒，室温孵育 10 分钟或 -20 °C 过夜。
8. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，弃去全部上清液。管底将形成白色沉淀。
9. 加入 1 mL 冷的 75% 乙醇，在 4 °C 下以 7,500 x g 离心 5 分钟。
10. 彻底去除乙醇，在室温下干燥沉淀，直至管内无残留乙醇。
11. 将沉淀溶解于 30 µL 无 DNase/RNase 的水中，60 °C 孵育 10 分钟。
12. 使用分光光度计（260 nm 处）测定 RNA 浓度，并将 RNA 浓度调整至 50 ng/µL。

4. 一步法 RT-PCR 检测 SMN2 外显子包含率

1. 将12.5 µL的2x RT-PCR反应缓冲液、1.0 µL一步法RT-PCR酶混合物、每种引物各0.5 µL（SMN2上游引物：5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3'，SMN2下游引物：5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3'，GAPDH上游引物：5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3'，GAPDH下游引物：5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3'）、2 µL总RNA（50 ng/µL）以及8.5 µL无RNase/DNase的去离子水混合。
2. 在50 °C下反转录15分钟以合成cDNA后，开始PCR反应。对SMN2外显子6-8进行30个PCR循环扩增（94 °C变性15秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸25秒）。对GAPDH进行20个PCR循环扩增（94 °C变性15秒，60 °C退火30秒，68 °C延伸20秒）。
3. 向PCR产物中加入5 μL 6x上样缓冲液，取5 µL混合物上样至2%琼脂糖凝胶中，在100 V电压下电泳40分钟。
4. 使用ImageJ软件对凝胶成像并进行分析。
5. 测量全长条带与Δ7条带的强度，通过（全长）/(全长 + Δ7 SMN2)的强度值计算外显子7的包含率。

5. 定量 PCR（qPCR）检测SMN2外显子包含率

1. 进行cDNA合成时，混合1 µL Oligo dT、1 µL 10 mM dNTPs和11 µL总RNA（50 ng/µL），在65 °C孵育5分钟。
2. 将样品置于冰上，向每个样品中加入4 µL 5x缓冲液、1 µL 0.1 M DTT、1 µL RNase抑制剂和1 µL逆转录酶。
3. 在50 °C孵育60分钟，然后升温至80 °C持续10分钟以终止反应。cDNA可保存在-20 °C。
4. 用无RNase的水稀释cDNA（1:5稀释）。混合10 µL 2x SYBR Green qPCR酶混合液、每种引物各0.8 µL（10 µM）（全长SMN2上游引物：5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3′，全长SMN2下游引物：5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′，Δ7 SMN2上游引物：5′-TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′，Δ7 SMN2下游引物：5′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′，GAPDH 上游引物：5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′，GAPDH 下游引物：5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′）、3 µL稀释后的cDNA以及5.4 µL无RNase的水。
5. 启动qPCR反应。反应条件为：95 °C预变性30秒，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性5秒，60 °C退火延伸20秒。
6. 计算全长SMN2相对于GAPDH或Δ7 SMN2的相对表达量，并使用ΔΔCt法对未处理细胞进行归一化处理。

6. 蛋白质印迹法

1. 从细胞中移除转染培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
2. 加入含有蛋白酶抑制剂的100 µL裂解缓冲液。
3. 使用无菌细胞刮刀将细胞从每个孔底部刮下，并收集至1.5 mL离心管中。将样品置于冰上孵育30分钟。
4. 用21号针头反复吹打细胞裂解液10次，以破碎细胞。
5. 在4 °C条件下以20,800 × g离心15分钟，收集上清液至新的1.5 mL离心管中。样品可储存于-80 °C超低温冰箱中。
6. 使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并将浓度调整至1.0 µg/µL。
7. 取5 µL样品与5 µL 2×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（10% SDS；14% 0.5 M Tris-HCl溶液，pH 6.7；1% 0.5 M EDTA-2Na储备液，pH 8.0；20%甘油；0.004%溴酚蓝染料，5% β-巯基乙醇）混合，在70 °C加热10分钟。
8. 将样品上样至4–12% Bis-Tris蛋白凝胶中，在150 V电压下电泳运行1小时。
9. 将厚滤纸分别浸入以下缓冲液中：（浓缩阳极缓冲液：0.3 M Tris-HCl，20%甲醇；阳极缓冲液：0.03 M Tris-HCl，20%甲醇；阴极缓冲液：25 mM Tris，20%甲醇，40 mM 6-氨基己酸，0.01% SDS）。
10. 将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜浸入甲醇中20秒，随后转移至阳极缓冲液中。
11. SDS-PAGE结束后，将凝胶在阴极缓冲液中振荡平衡5–10分钟。
12. 按以下顺序将滤纸、PVDF膜和凝胶放置于半干转印仪中：浓缩阳极缓冲液滤纸/阳极缓冲液滤纸/PVDF膜/蛋白凝胶/阴极缓冲液滤纸（图2）。
13. 覆盖夹心结构，以20 V电压开始转印，持续30分钟。
14. 转印完成后，用PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤PVDF膜一次。
15. 用含5%脱脂奶粉的PBST在室温下封闭膜30分钟，或在4 °C封闭过夜。
16. 将纯化的鼠抗SMN抗体和兔抗Cofilin抗体用含5%脱脂奶粉的PBST按1:10,000稀释，室温孵育1小时或4 °C孵育过夜。
17. 用PBST洗涤3次，每次10分钟。
18. 将二抗（HRP标记的山羊抗鼠IgG（H+L）和抗兔IgG（H+L））用含5%脱脂奶粉的PBST按1:10,000稀释，在室温避光孵育1小时。
19. 用PBST洗涤膜3次，每次10分钟。
20. 使用化学发光Western blot检测试剂盒检测蛋白条带信号。

结果

利用脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的成纤维细胞，我们针对SMN2基因第7内含子中的ISS-N1沉默子区域，使用了八种不同的反义LNA/DNA混合修饰寡核苷酸（mixmer），以5 nM浓度进行转染（图3）。每种mixmer均含有经修饰的磷硫酰化骨架，使其能够抵抗核酸酶降解。为评估mixmer的有效性，采用特异性针对SMN2的引物，通过RT-PCR和qPCR定量分析SMN2外显子7的包含率。在患者细胞中转染mixmer #1–5时，外显子7的包含效率介于78–98%之间（图4a, b）；而以相同剂量转染mixmer #6–8则未观察到与对照组相比的显著差异。qPCR分析结果还显示，与对照组相比，mixmer #1–3和#5处理显著增加了全长SMN2 mRNA转录本的含量（图4c<...

讨论

的 体外 此处描述的评估方法快速、简便，且具有足够的灵敏度，可用于多种反义寡核苷酸（AON）的检测。该方案广泛适用于其他基因的外显子跳跃与包含，以及多种细胞类型。此外，大多数AON化学修饰类型（PMO除外）均可通过此方法进行转染。AON可调控内源性或人工导入基因的pre-mRNA剪接，并可与携带靶基因的质粒载体共转染。

该方法的关键步骤是，在将AONs转染入成纤维细胞时，细胞融合度应约为65%–80%。此条件可能因其他细胞类型而异。AONs转染的最佳浓度也可能不同（0.5–100 nM），具体取决于靶向序列和细胞类型。

该方法并非没有潜在的缺陷。例如，混合修饰寡核苷酸（mixmer）的效率取决于其序列以及LNA/DNA的组成。对于ISS-N1靶点，由LNA构成且在每三个核苷酸位置上以DNA替代LNA的mixmer，其效果优于在每隔一个核苷酸位置进行DNA替代的相同序列mixmer，或全LNA寡核苷酸¹³。然而，对于其他靶序列，结果可能不同。因此，在进一步研究之前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脊髓性肌萎缩症成纤维细胞	Coriell NIGMS 人类遗传细胞储存库	GM03813
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher	11320033
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F1051
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher	15140122
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Thermo Fisher	25300062
无血清培养基	Thermo Fisher	31985070
转染试剂	Thermo Fisher	15338100
硫氰酸胍-苯酚-氯仿（TRIzol）	Thermo Fisher	15596-018
RT-PCR 引物			序列 5' 至 3'
SMN2 正向引物：			CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 反向引物：			TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH 正向引物：			TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH 反向引物：			GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR 引物
全长 SMN2 正向引物：			GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
全长 SMN2 反向引物：			CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH 正向引物：			GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH 反向引物：			AGGGATCTCGCTCCTGGAA
氯仿	Sigma-Aldrich	P3803
糖原，RNA 级	Thermo Fisher	R0551
ImageJ 软件
蛋白酶混合抑制剂	Roche	11836153001
阴极缓冲液			0.025 M Tris 碱 + 40 mM 6-氨基己酸 + 20% 甲醇
阳极缓冲液			0.03 M Tris 碱 + 20% 甲醇
浓缩阳极缓冲液			0.3 M Tris 碱 + 20% 甲醇
β-巯基乙醇	Millipore	ES-007-E
PVDF 膜	GE	10600021
Western 印迹上样/样品缓冲液	NuPage Invitrogen	NP007
一步法 RT-PCR 试剂盒	Qiagen	210210
dNTPs	Clontech	3040