方法文章

基于均相时间分辨Förster共振能量转移的胰岛素分泌检测方法

8.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/57531

⸱

2018年5月10日

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

本文介绍均相时间分辨荧光共振能量转移（HTRF）作为一种高效方法，用于快速检测细胞分泌的胰岛素。

摘要

胰岛素分泌的检测对于阐明受调控分泌的机制以及代谢研究至关重要。尽管已有多种胰岛素检测方法存在数十年，但近年来均相时间分辨荧光共振能量转移（HTRF）技术的出现极大地简化了这些检测过程。该方法是一种快速、经济、可重复且稳健的光学检测技术，依赖于与高亮度、长寿命荧光团偶联的抗体，从而实现时间分辨的荧光共振能量转移。此外，HTRF胰岛素检测适用于高通量筛选实验的开发。本文中，我们采用HTRF技术检测INS-1E细胞（一种源自大鼠胰岛素瘤的细胞系）中的胰岛素分泌，从而评估基础胰岛素水平及其在葡萄糖刺激下的变化。此外，我们利用该胰岛素检测系统证实了多巴胺作为葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）负向调节因子的作用。类似地，其他多巴胺D2样受体激动剂，如喹吡罗和溴隐亭，也以浓度依赖的方式抑制GSIS。我们的结果突显了HTRF胰岛素检测方法在确定多种药物对GSIS的影响及其药理学特征方面的实用性。

引言

能量代谢的调控由一种主要的合成代谢激素——胰岛素精细调节。胰岛素由胰腺β细胞在细胞外葡萄糖水平升高时合成并释放。释放的胰岛素可促进胰岛素敏感组织对葡萄糖的摄取1,2。从生理学角度看，这一过程与餐后葡萄糖浓度升高相联系，随后胰岛素分泌以调节葡萄糖的摄取。葡萄糖稳态的紊乱会导致代谢功能障碍，最终引发胰岛素抵抗，并进而导致2型糖尿病的发生2,3,4。

尽管胰岛素分泌已被广泛研究，但其调控机制仍不甚清楚。一个重要的研究方向是鉴定胰岛β细胞胰岛素分泌的新调节因子。5,6,7,8这些研究需要更深入地理解葡萄糖刺激与胰岛素分泌之间的偶联关系。因此，准确监测和定量葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）水平的能力至关重要。然而迄今为止，可用于胰岛素分泌细胞系和/或胰岛细胞定量GSIS的方法十分有限。其中一种是放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA），该方法利用放射性同位素标记的胰岛素和抗体进行检测。该方法的主要局限性包括因放射性物质的操作和处置所带来的安全问题。此外，该方法劳动密集，涉及多次长时间的洗涤和孵育步骤。酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是另一种成本较高且劳动密集的方法，依赖抗体检测胰岛素。抗体亲和力的差异以及识别胰岛素效率的不同是该方法的限制因素，可能影响结果的可重复性。ELISA和RIA均未设计用于高通量实验。AlphaScreen是一种均相检测技术，用于检测和测量胰岛素分泌水平。AlphaScreen技术基于将环境中的氧气转化为激发态单线态氧，后者可与化学发光物质反应，从而产生化学发光信号。由于该检测为均相体系，省去了RIA和ELISA中许多洗涤步骤。然而，由于反应本身的特性导致信号不稳定，是影响检测读数的限制因素。 (TR-PINCER，由 Heyduk 及其同事开发9另一种均相胰岛素检测方法基于两种不同抗体分别结合胰岛素分子上不同表位的原理。这两种抗体各自通过化学方式连接至双链DNA，该DNA具有短的互补单链DNA突出端。当抗体与胰岛素结合时，彼此靠近，形成双链DNA双螺旋结构。每种抗体还分别偶联有相应的供体或受体荧光团，DNA双螺旋的形成使这些荧光团相互接近，从而产生 Förster 共振能量转移（FRET）。然而，TR-PINCER 方法的一个潜在局限性在于 FRET 本身。FRET 反应过程中背景荧光无法快速消散，可能导致较高的背景荧光水平以及较低的信噪比。因此，仍需一种可靠、稳健且成本效益高的方法，以高通量方式定量检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）。

生物物理学的最新进展推动了基于均相时间分辨荧光能量共振转移（HTRF）的检测方法的发展。具体而言，尽管该检测中的能量转移可被描述为基于FRET，但更准确地说，HTRF依赖于发光能量共振转移（LRET）。10 供体与受体物种之间的非辐射能量转移11,12,13这一区别非常重要，因为基于荧光或淬灭的FRET相互作用的时间特性与LRET有很大不同，尽管FRET和LRET可以使用相同类型的门控方式。此外，在HTRF中使用稀土镧系加密合物（如铕或铽加密合物）可产生较长的荧光半衰期12,14。这提供了引入时间延迟的独特优势（µsec) 在供体激发与受体发射检测之间（即， 时间分辨检测）。这一时间延迟使得背景荧光在检测受体发射荧光之前有足够时间消退。因此，检测信号不受非特异性荧光干扰，从而实现高信噪比（图1此外，HTRF 的均相特性消除了洗涤未结合物质的步骤，使得该检测方法比基于 ELISA 或 RIA 的方法更为快速。

胰岛素FRET检测示意图；铕螯合物为供体，XL665为受体，激发/发射波长为337/665 nm。
图1：HTRF胰岛素检测机制示意图。两种独立制备的单克隆抗体分别特异性识别并结合胰岛素上的不同位点。这些抗体分别与铕螯合物（供体）或XL665（受体）偶联。在337 nm激发供体后，其发射波长为620 nm。由此产生的能量转移导致XL665在更长的波长（665 nm）处发射荧光。请点击此处查看该图的放大版本。

本文提供了一种基于HTRF技术的详细实验方案，用于测定INS-1E细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）水平。INS-1E细胞是一种广泛使用的、来源于大鼠胰岛素瘤的胰岛β细胞系15。此外，该检测方法还可用于鉴定调控胰岛素分泌的分子调节剂的药理学特征。我们应用此基于HTRF的胰岛素检测方法，研究多巴胺D2样受体对GSIS的调控作用。越来越多的研究表明，神经递质多巴胺是GSIS的重要调节因子8,16,17,18,19,20,21,22。多巴胺通过作用于胰腺β细胞表面表达的多巴胺D2样受体（D2、D3、D4受体），以负性自分泌/旁分泌方式影响GSIS8,16,19。利用本检测方法，我们证实了多巴胺作为GSIS负性调节因子的作用，并证明多巴胺D2样受体激动剂溴隐亭（bromocriptine）和喹吡罗（quinpirole）同样可降低GSIS水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. INS-1E 细胞：培养与接种

  1. 在37 ˚C、5% CO2的湿润培养箱中培养INS-1E细胞，使用含5% (v/v) 热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素/链霉素溶液和50 µM β-巯基乙醇的RPMI 1640完全培养基。每孔加入10 mL完全RPMI 1640培养基进行培养，待细胞融合度达到80–90%时，可进行胰蛋白酶消化传代或用于胰岛素分泌实验。
  2. 第1天：吸除培养基，用5 mL预热的PBS洗涤细胞一次。加入0.5 mL用PBS按1:1稀释的0.025%胰蛋白酶溶液，37 ˚C孵育3–4分钟以消化细胞。加入9 mL完全培养基终止胰蛋白酶反应，并用移液器将细胞转移至15 mL离心管中。
  3. 通过离心沉淀细胞，并将细胞沉淀重悬于约5 mL新鲜培养基中。
  4. 取10 µL重悬的细胞与10 µL台盼蓝活体染料混合，检测细胞活力。使用血细胞计数板对混合液中10 µL样本的活细胞和死细胞进行计数，细胞活力应高于90%。将重悬的细胞用新鲜培养基稀释至每毫升100万个细胞。
  5. 在预先包被多聚-L-赖氨酸的24孔板中，每孔接种0.5 mL细胞悬液，接种密度为每孔50万个细胞。
  6. 第2天：铺板后18–24小时更换培养基，每孔加入500 µL新鲜RPMI 1640培养基。继续孵育24小时，使细胞充分从上一次传代操作中恢复。额外的培养时间有助于细胞在培养板上充分贴壁和铺展。

2. 胰岛素分泌测定（第3天）

  1. 配制 KRB 缓冲液：132.2 mM NaCl、3.6 mM KCl、5 mM NaHCO3、0.5 mM NaH2PO4、0.5 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2，以及 0.001 g/mL 牛血清白蛋白（BSA），pH 7.4。
  2. 吸除细胞培养基，并用预温的 PBS 洗涤两次。
  3. 进行葡萄糖饥饿处理：每孔加入 450 µL 不含葡萄糖但含 BSA 的 KRB 缓冲液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  4. 在葡萄糖饥饿处理期间，用含 200 mM 葡萄糖的 KRB 缓冲液（10×浓度）配制药物的系列稀释液。
    1. 将药物用含 200 mM 葡萄糖的 KRB 缓冲液（也为最终检测浓度的 10 倍）配制成最终浓度的 10 倍浓度。若药物原液（连同添加的 10×葡萄糖）溶于 DMSO，需确保整个实验中 DMSO 的终浓度保持一致（理想情况下终浓度低于 0.1%）。
    2. 对于多巴胺和喹吡罗处理，使用终浓度范围为 100 µM 至 100 pM（从高到低）的药物浓度梯度，剂量反应曲线的最后一个点不含药物。对于溴隐亭处理，使用终浓度范围为 10 µM 至 10 pM 的药物浓度梯度，剂量反应曲线的最后一个点为无药物对照。
  5. 葡萄糖饥饿处理后，将药物系列稀释液加入检测体系中，以建立剂量反应曲线。
  6. 每孔加入 50 µL 对应的系列稀释液（总体积为 500 µL）。
  7. 进行葡萄糖刺激处理：在含 20 mM 葡萄糖的条件下，将细胞与相应浓度梯度的药物共同孵育 90 分钟（37 °C、5% CO2）。设置对照组：（1）仅用 20 mM 葡萄糖刺激，不加任何额外药物；（2）既不加药物也不加葡萄糖的细胞组（用于提供基础分泌速率）。
  8. 刺激处理后，小心收集上清液（可直接使用或于 4 °C 保存）。
    注意：此时可额外进行一次轻柔离心（600 × g，5 分钟），以去除检测上清液中残留的细胞。

3. 使用HTRF检测胰岛素分泌

  1. 用不含 BSA 的 KRB 将检测上清液按 1:10 比例稀释，最好在透明的 96 孔板中进行。
  2. 为 HTRF 胰岛素检测制备胰岛素标准曲线（表 1）。
标准储备液 500 ng/ml系列稀释工作液 [胰岛素] ng/ml
STD 730 µl 储备液 + 140 µl KRB150
STD 630 µl STD 7 + 45 µl KRB60
STD 530 µl STD 6 + 45 µl KRB24
STD 430 µl STD 5 + 45 µl KRB9.6
STD 330 µl STD 4 + 45 µl KRB3.84
STD 230 µl STD 3 + 45 µl KRB1.54
STD 130 µl STD 2 + 45 µl KRB0.61
STD 045 µl KRB0
注：STD 储备液浓度为 500 ng/ml

表1. 制备胰岛素标准曲线的系列稀释。

  1. 将标准曲线样品和稀释后的检测上清液加入HTRF板中。通过HTRF法检测分泌型胰岛素可在96孔或384孔板中进行，需注意检测体积应相应调整。使用96孔白色半区板时，每孔加样10 µL；使用384孔白色低体积圆底板时，每孔加样5 µL（参见材料表）。
  2. 在检测缓冲液（参见材料表）中按1:2的比例配制抗体混合液（供体：cryptate，受体：XL-665）。
    注意：有关HTRF检测的更多具体信息可参阅试剂生产商提供的说明。
  3. 向检测体系中加入抗体混合液，96孔板每孔30 µL，384孔板每孔15 µL。
  4. 密封反应板，并在室温下孵育。
  5. 使用酶标仪和相应的HTRF光学模块（337 665 620 nm）（参见材料表及生产商说明书），在加入抗体后2 h、4 h和/或过夜孵育后读取数据。设定积分起始时间为60 µs，积分为400 µs，每孔闪光200次。
    注意：上述参数基于我们所用特定仪器的设置。不同仪器在620 nm和665 nm处的读数可能存在差异。因此我们建议使用665/620的比值进行计算，该比值可消除不同仪器间的系统差异，从而获得不受检测设备影响的一致性结果。

4. 数据分析与归一化

  1. 通过将比率荧光读数（665 nm/620 nm）外推至二次多项式曲线来计算检测孔中的胰岛素浓度（图2）。

胰岛素浓度与665/620比值关系图，显示蛋白质结合分析的剂量-反应曲线。
图2：胰岛素标准曲线。 使用已知浓度的人胰岛素储备液绘制胰岛素标准曲线。将获得的HTRF比值（665 nm / 620 nm）对胰岛素浓度作图。数据最符合二阶二次多项式曲线拟合（R2 = 0.99996）。此为一条代表性标准曲线。误差线 = 标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 以推导出的数据（ng/mL胰岛素分泌量）为基础，将不同配体浓度刺激下胰岛素的分泌量归一化至%最大胰岛素分泌检测孔的平均值（仅20 mM葡萄糖条件）。
  2. 利用单次实验的曲线拟合（R2）计算板内变异。在该实验中，根据实验内重复样本所得到的各个R2值，计算曲线拟合的平均标准误差。
  3. 为确定板间变异，使用至少三次独立实验的数据，计算总体曲线R2值的平均标准误差。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们通过使用已知浓度的纯化人胰岛素标准品生成胰岛素标准曲线，验证了我们的胰岛素HTRF检测方法（图2）。标准曲线的建立使我们能够外推比率荧光读数，从而确定药物处理后分泌的胰岛素水平（图2）。板内曲线拟合的变异极小（R2 = 0.99996 ± 5.0 x 10-5），板间变异也较低（R2 = 0.947 ± 5.5 x 10-5；n = 3块板）。

接下来，我们测定了INS-1E细胞的基础胰岛素分泌水平。在24孔板中以每孔5 × 105个细胞的密度接种，发现在无葡萄糖条件下静态孵育90分钟后，细胞分泌胰岛素水平为54.53 ± 2.2 ng/mL。加入20 mM葡萄糖以刺激葡萄糖刺激的胰岛素...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述的HTRF胰岛素检测法提供了一种快速、高效的系统，用于测量培养细胞体系中的胰岛素分泌。该方法最重要的优势之一是具有高信噪比，因而背景信号低。此外，我们已证实HTRF信号在较长时间内保持稳定（>24 h）7。然而，由于胰岛素结合单克隆抗体在加入检测体系后会迅速达到结合饱和，抗体结合动力学可能受环境温度或胰岛素分泌水平变化的影响。因此，我们在多个时间点（2 h、4 h和过夜）读取检测板信号，以精确定义抗体何时达到完全饱和且HTRF信号最强7。我们最近还发现，胰岛素抗体与前胰岛素原或C肽之间无明显交叉反应，表明该检测法对成熟胰岛素具有较高的特异性7。

优化该检测方法的一个重要步骤是建立胰岛素分泌的宽动态范围。此动态范围定义为在基础状态（未刺激）与刺激状态下检测到的胰岛素水平之间的差异。我们发现，在高葡萄糖刺激前进行初始的短暂葡萄糖饥饿处理（0 mM 葡萄糖，1 小时），可通过使 INS-1E 细胞进入敏感化状态，从而在葡萄糖刺激的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

我们感谢Cisbio Bioassays的Nicolas Pierre提供的有益建议，以及日内瓦大学的Pierre Maechler博士慷慨提供INS-1E细胞。本研究得到了美国国防部（授予Z.F.的资助号PR141292）和匹兹堡基金会的John F.与Nancy A. Emmerling基金（授予Z.F.）的资助支持。

致谢

作者无任何利益冲突需要披露。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔白色半面积板Greiner Bio-One82050-042
384孔白色低体积圆底板Corning15100157
高浓度胰岛素检测试剂盒Cisbio Bioassays62IN1PEH 适用于HTRF法胰岛素检测的10,000次测试试剂盒
PHERAstar FSX酶标仪BMG LabtechFSX适用于HTRF法检测的酶标仪
微孔板封板膜Fisher ScientificDY992用于抗体孵育期间密封微孔板
血细胞计数板Hausser Scientific3100
RPMI 1640培养基（1×）Gibco 11875-093含L-谷氨酰胺
0.05%胰蛋白酶 Corning25-052-CI含0.53 mM EDTA，不含碳酸氢钠
DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）Corning21-031-CV不含钙和镁
胎牛血清Corning35-010-CV
HEPESGibco 156-30-080
丙酮酸钠Gibco 11360070
青霉素/链霉素溶液（100×）Corning30-002 CT
2-巯基乙醇SigmaM1348
台盼蓝染液（0.4%）Gibco 15250-061
盐酸多巴胺Sigma8502
甲磺酸溴隐亭Tocris427
盐酸喹吡罗（(-)-Quinpirole hydrochloride）Tocris1061
牛血清白蛋白Calbiochem12659
聚-L-赖氨酸SigmaP4832
葡萄糖SigmaG7021
DMSO（二甲基亚砜）Sigma276855

参考文献

  1. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
  2. Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
  3. Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  5. Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
  6. Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
  7. Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684(2016).
  8. Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
  9. Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
  10. Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
  11. Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
  12. Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
  13. Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
  14. Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
  15. Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
  16. Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
  17. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
  18. Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
  19. Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
  20. Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
  21. Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
  22. Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
  23. Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
  24. Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
  25. Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
  26. Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
  27. Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432(2017).
  28. de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

HTRF INS 1E

相关文章