本文描述了一种用于可视化转基因 Hb9::GFP 小鼠胚胎中运动神经元投射及轴突分支的实验方案。在对运动神经元进行免疫染色后，我们采用光片荧光显微镜对胚胎进行成像，以用于后续的定量分析。该方案也适用于中枢神经系统中其他神经元迁移过程的研究。
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方法文章
利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脊髓运动神经元（MNs）通过延伸其轴突与支配靶标进行通信，从而控制脊椎动物的运动和复杂行为。因此，揭示运动轴突在发育和退变过程中如何导航、分支并支配外周肌肉靶标的分子机制至关重要。尽管转基因 Hb9::GFP 小鼠品系长期以来被用于可视化胚胎发育期间的运动轴突轨迹，但由于分支模式的复杂性以及当前光学显微镜技术的局限性，对轴突终末分支全貌的详细描述仍不完整。本文介绍了一种改进的实验方案，结合光片荧光显微镜（LSFM）与稳健的图像分析方法，可对发育中的运动轴突进行定性和定量的可视化观察。该系统可轻松应用于将遗传突变体或运动神经元疾病模型与 Hb9::GFP 品系进行交叉研究，从而揭示导致运动轴突导航和分支缺陷的新分子机制。
引言
脊髓运动神经元（MNs）是中枢神经系统的一部分，但其支配外周肌肉以控制运动。在发育中的脊髓中，运动神经元前体（pMNs）的形成依赖于脊索及邻近体节发出的信号。所有终末分化的有丝分裂后运动神经元均由pMNs产生，并最终沿脊髓的头尾轴形成一系列不同的运动神经元亚型1,2。脊髓运动神经元在拓扑结构和解剖结构上具有良好的组织性，其形态排列与各自在外周所支配靶组织的位置相对应3。当轴突到达靶肌肉后，会接收到细胞内及外源性的神经营养因子，从而促进其进一步延伸并分支进入肌肉。支配和分支过程中的缺陷可能导致神经肌肉接头（NMJ）无法正常形成。例如，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）诱导表达的Pea3对轴突在皮肌最大肌（CM）和背阔肌（LD）中的分支化至关重要4,5。此外，DINE基因敲除小鼠胚胎表现出膈肌中膈神经分支化缺陷，导致出生后立即出现呼吸衰竭和死亡6,7。因此，运动神经元成熟的最后阶段（即轴突投射与分支）对于确保神经元与其靶细胞之间的有效通讯至关重要。
为了观察神经突起的形态模式，研究人员通常对切片或整体封片样本进行共聚焦成像或双光子荧光显微镜观察8,9,10。这两种显微技术均可提供可接受的分辨率和组织穿透深度。双光子荧光显微技术通过同时吸收两个低能量光子来激发荧光分子11。由于双光子激发使用近红外辐射，较低的激发频率有助于减少光散射，并提高组织穿透能力，可达组织深部约1 mm，从而实现更深层的成像。共聚焦显微镜则通过滤光装置去除离焦信号，仅收集焦平面内的荧光信号12。利用该方法，可将来自不同焦平面的样本图像通过Z轴堆叠（Z-stack）功能整合，生成三维（3D）图像。然而，由于大部分光线被阻挡，信号强度会降低，同时高数值孔径会限制景深。更重要的是，即使每次仅对一个焦平面成像，整个样本仍会受到光照，因此这两种技术均会导致严重的光损伤和光毒性。
为克服这些局限性，光片荧光显微镜（LSFM）已成为一种更受青睐的替代方案，具有成像速度快、光效率高以及光毒性低等优势13,14。此外，LSFM支持多视角成像，特别适用于在三维空间中观察运动轴突及其分散的终末结构。LSFM优于另外两种技术的原因在于，样品被固定在可绕垂直轴旋转并可在x、y和z轴方向移动的载物台上。这种设计不仅能够以最小遮挡的方式观察样品，还可灵活选择理想的照明路径，而双光子显微镜和共聚焦显微镜则存在这一缺陷，二者均要求将样品固定在平片上。因此，LSFM是进行小鼠胚胎轴突分支三维成像及运动神经终末定量分析的最合适工具。
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方案
所有活体动物均饲养于经中华民国中央研究院动物实验管理委员会（IACUC）批准并监管的无特定病原体（SPF）动物设施中。
1. 固定
- 收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎，随后将其断头并去除内脏。
- 将胚胎分别置于24孔板中，每孔加入1 mL新配制的含4%多聚甲醛的1×磷酸盐缓冲液（PBS），4 °C摇床上固定过夜。
- 用1 mL 1×PBS至少洗涤固定后的胚胎3次，每次5–10分钟，然后在4 °C摇床上继续孵育过夜，以去除残留的多聚甲醛。
2. 整体免疫染色
- 在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) 对每个胚胎进行透化处理，过夜。
- 在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 含 10% FBS 的 1× PBS 对每个样本封闭，过夜。
- 将胚胎与 1 mL 抗 GFP 一抗（以 10% FBS 按 1:1,000 稀释）在 4 °C 条件下孵育 72 小时，并持续振荡，以增强运动神经的 GFP 信号。
- 一抗孵育后，在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 0.5% PBST 洗涤 1–2 天，期间至少更换三次 0.5% PBST。
- 加入 1 mL 二抗（以 10% FBS 按 1:1,000 稀释），在 4 °C 避光条件下持续振荡孵育过夜。
- 在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 0.5% PBST 洗涤 3 次，持续 2–3 天。将样本保存在 1× PBS 中，置于 4 °C，直至成像前一天。
注意：可根据需要成像的胚胎部位，在透明化前将胚胎解剖为更小的片段。本实验方法中保留前肢（图 1A）。 - 将胚胎置于 1.5 mL 离心管中，加入折射率为 1.49 nD 的商用透明化试剂，在室温避光条件下孵育过夜，使胚胎透明化以利于成像。
注意：透明化试剂的体积约为样本体积的五倍。
3. LSFM（2–3 小时）
- 样品设置
- 设置 5X/0.1 照明光学系统和 5X/0.16 检测光学系统。组装样品 holder 和样品毛细管（内径 1.5 mm，绿色），并将其放入显微镜中。
注意：详细设置步骤请参阅显微镜的操作手册。 - 按以下步骤安装胚胎：
- 准备 P200 移液器吸头，剪去上部，使其直径与毛细管匹配，并去除尖端部分（约 3 mm），以便固定样品。
- 用小火焰熔化移液器吸头的钝端。
- 熄灭火焰，并迅速 将胚胎垂直附着在熔化 的末端。
- 将移液器吸头的上部与样品毛细管对接。
- 让腔室缓冲液与胚胎平衡 1 分钟，以清除碎片或气泡。
- 使用成像软件，在 定位 选项卡下选择 定位毛细管，并调节 x、y、z 轴以定位样品毛细管。
- 选择 定位样品，并将放大倍数调至 0.6X 以聚焦胚胎。旋转胚胎，确保成像肢体的长轴与两个光源的光路对齐（图 1B）。
- 设置 5X/0.1 照明光学系统和 5X/0.16 检测光学系统。组装样品 holder 和样品毛细管（内径 1.5 mm，绿色），并将其放入显微镜中。
- 图像采集
- 在 采集 选项卡下，定义光路参数，如检测物镜、激光阻挡滤光片、分光镜、相机和激光器。
注意：本实验使用 GFP 通道（激发波长：488 nm；发射滤光片：BP 505 至 545 nm；分光镜：SPS LP 560）。 - 勾选“枢轴扫描”复选框以减少阴影。
- 定义采集设置：位深度为 16 位；放大倍数为 0.36–0.7X；单侧照明（左/右）或双侧照明。
- 点击 连续采集，并设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置，以获得更清晰的图像。
注意：激光功率应尽可能保持最低，以最小化光损伤。 - 按下 停止 以结束图像采集。
- 在 采集 选项卡下，定义光路参数，如检测物镜、激光阻挡滤光片、分光镜、相机和激光器。
- 多维采集
- 通过移动首尾图像的 Z 位置来定义 z 层切。点击 最佳 以设置切片数量。
- 点击 开始实验 以采集选定的 z 层切。
- 完成后，将图像保存为 .czi 格式。
- 图像处理（可选）
- 若采用双侧照明，请在 Lightsheet Processing 通道下进行 双侧融合。若采集了多视角图像，则需进行 多视角处理，以合并来自不同角度的图像。
- 在 最大强度投影 通道下，使用沿投影轴方向最高强度像素的数据生成二维图像。
- 在 复制 通道下，点击 子集 以从原始图像集中选择子集。
4. 轴突分支的定量分析（每条神经约需30分钟）
- 在成像分析软件中打开图像文件（默认情况下，包含 XYZ 数据的图像将以 Surpass 模式打开，并以 3D 渲染视图显示）。
- 使用显示调节窗口（编辑 | 显示显示调节）调整图像的颜色、亮度和对比度，以便根据局部强度对比检测纤维结构。
- 点击添加新纤维图标，并在下拉菜单中选择自动路径（无环）算法。
- 选择感兴趣区域（本例中为待分割的目标轴突）。完成后点击下一步。
- 通过设定最大和最细直径测量值来定义起始点和种子点，这些测量值可使用切片模式进行测定。
- 在感兴趣区域的边缘设置一个起始点。如需手动添加或删除起始点，请先更改指针模式（导航 | 选择），然后在目标位置Shift + 右键单击。
- 手动设置种子点的阈值，以确保所有可见的分支结构均被标记。更改指针模式（导航 | 选择），然后在目标位置Shift + 左键单击以手动添加或删除种子点。
注意：必须手动去除背景噪声以及邻近神经产生的信号干扰。 - 勾选移除起始点周围的种子点选项。
- 勾选移除不连通的片段，以排除距离过远、可能代表背景噪声的点。在下一步中指定最大间隙长度，以定义排除的上限阈值。
- 调整背景减除的阈值，该过程使用高斯滤波器估算每个体素的背景强度。
- 使用近似横截面积算法自动设置树突直径的阈值。
- 跳过棘突计算的相关步骤。
- 完成处理，并选择所需的样式 和颜色。
- 在属性中取消勾选体积框，仅显示重建后的轴突。
- 在统计选项卡下，选择详细信息。使用纤维编号 树突终末点来量化运动神经终末，作为运动轴突分支程度的指标。
注意：可根据需要添加统计标注。 - 将重建轴突的图像导出为 .tif 文件。
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结果
LSFM 可对小鼠胚胎中运动神经元的轨迹和轴突分支提供详细的三维可视化图像。在明场下，组织浸入商用透明试剂后完全呈现透明状态。在成像前，样品于透明试剂中保存长达一周，未观察到任何收缩或膨胀现象。在荧光通道下，运动神经元通过转基因表达的 GFP 进行标记（影片 1）。在某些情况下，轴突结构的细节会受到损害。例如，图 2 展示了成像质量较低的情况。多种因素可能影响成像质量：首先，通透和洗涤步骤不充分可能导致背景信号过高；其次，组织透明不充分会引起光散射，导致图像模糊；最后，成像过程中样品位置不佳可能增加光散射或阻断光路。
为了更详细地成像轴突分支并进行定量分析，可调整放大倍数，以揭示每一个精细的分支结构（视频 2）。应比较单侧与双侧照明的图像，以确定分支模式的最佳分辨率（图 3
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讨论
在某些情况下，该实验方案中的多个步骤可进行调整。例如，固定时间取决于胚胎的发育阶段，使用新配制的多聚甲醛时，固定时间可从2小时到1天甚至更长。由于固定是在整体免疫染色之前进行，对于对蛋白质交联敏感的抗体，可选用甲醇作为替代的固定剂。为了在染色后获得较高的信噪比，有必要优化去污剂的浓度（介于0.1%–0.5%之间）。在抗体孵育前后增加额外的洗涤步骤，也可提高信噪比。此外，组织透明化步骤至关重要，以确保光路在整个深层轴突投射过程中无阻碍。为增强组织透明度，在使用商用透明试剂孵育时，应尽量减少PBS的引入，因为将样本重新浸入缓冲液会逆转透明效果。否则，建议使用折射率更高的透明试剂或延长透明时间。同时，不同样本在图像采集过程中的参数设置也有所不同。双侧照明与多视角成像可实现更大景深和更精细的成像效果。然而，由于来自不同角度的照明是同时获取的，对于较小的样本或运动中的样本，单侧照明效率更高。高质量的图像可确保后续定量分析的准确性。
以往的研究，包括我们团队的研究，已利用共聚焦成像或双光子显微镜来观察 Hb9::GFP 胚胎中的运动轴突导航过程或分支模式
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
部分LSFM实验和数据分析使用了中国台湾中央研究院仪器服务中心的先进光学显微镜，并得到了沈淑珍女士的协助。我们感谢李素萍女士在IMB影像核心设施对Imaris图像分析提供的大量技术支持。IMB科学英文编辑核心团队对本文稿进行了审阅。本研究由中央研究院职业发展奖（CDA-107-L05）、科技部（104-2311-B-001-030-MY3）和国家卫生研究院（NHRI-EX106-10315NC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hb9::GFP | 杰克逊实验室 | 005029 | 收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎 |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | 配制200ml：加入20ml 10X PBS、8g PFA至ddH₂O中。用NaOH（10N）调节pH至7.4。过滤除菌后于-20 °C保存。 | ||
| 10X 磷酸盐缓冲液（PBS 10X） | 配制1L：加入80 g NaCl、2 g KCl、14.4g Na₂HPO₄、2.4 g KH₂PO₄，用ddH₂O定容。高压灭菌后室温保存。 | ||
| Triton X-100 | 西格玛 | X100-500ML | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| 羊多克隆抗GFP抗体 | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 驴抗羊抗体 | 英杰公司 | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 透明化试剂 | 舜景生物实验室 | RC149001 | |
| 1.5ml 微量离心管 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24孔板 | 赛默飞世尔科技 | 142475 | |
| 5号直尖镊子 | ideal-tek | 3480641 | |
| 直型锐/锐虹膜剪 | Aesculap | BC110R | |
| 显微外科手术刀片，一次性使用 | Aesculap | BA365 | |
| 解剖显微镜 | 尼康 | SMZ800 | |
| 摇床 | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 显微镜 | 卡尔·蔡司显微系统 | ||
| Imaris 8.4.0 图像分析软件 | Bitplane，苏黎世，瑞士 | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J（Hb9::GFP 小鼠） | 杰克逊实验室 | 005029 |
参考文献
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