本文描述了一种用于可视化转基因 Hb9::GFP 小鼠胚胎中运动神经元投射及轴突分支的实验方案。在对运动神经元进行免疫染色后，我们采用光片荧光显微镜对胚胎进行成像，以用于后续的定量分析。该方案也适用于中枢神经系统中其他神经元迁移过程的研究。
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方法文章
利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脊髓运动神经元（MNs）通过延伸其轴突与支配靶标进行通信，从而控制脊椎动物的运动和复杂行为。因此，揭示运动轴突在发育和退变过程中如何导航、分支并支配外周肌肉靶标的分子机制至关重要。尽管转基因 Hb9::GFP 小鼠品系长期以来被用于可视化胚胎发育期间的运动轴突轨迹，但由于分支模式的复杂性以及当前光学显微镜技术的局限性，对轴突终末分支全貌的详细描述仍不完整。本文介绍了一种改进的实验方案，结合光片荧光显微镜（LSFM）与稳健的图像分析方法，可对发育中的运动轴突进行定性和定量的可视化观察。该系统可轻松应用于将遗传突变体或运动神经元疾病模型与 Hb9::GFP 品系进行交叉研究，从而揭示导致运动轴突导航和分支缺陷的新分子机制。
引言
脊髓运动神经元（MNs）是中枢神经系统的一部分，但其支配外周肌肉以控制运动。在发育中的脊髓中，运动神经元前体（pMNs）的形成依赖于脊索及邻近体节发出的信号。所有终末分化的有丝分裂后运动神经元均由pMNs产生，并最终沿脊髓的头尾轴形成一系列不同的运动神经元亚型1,2。脊髓运动神经元在拓扑结构和解剖结构上具有良好的组织性，其形态排列与各自在外周所支配靶组织的位置相对应3。当轴突到达靶肌肉后，会接收到细胞内及外源性的神经营养因子，从而促进其进一步延伸并分支进入肌肉。支配和分支过程中的缺陷可能导致神经肌肉接头（NMJ）无法正常形成。例如，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）诱导表达的Pea3对轴突在皮肌最大肌（CM）和背阔肌（LD）中的分支化至关重要4,5。此外，DINE基因敲除小鼠胚胎表现出膈肌中膈神经分支化缺陷，导致出生后立即出现呼吸衰竭和死亡6,7。因此，运动神经元成熟的最后阶段（即轴突投射与分支）对于确保神经元与其靶细胞之间的有效通讯至关重要。
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方案
所有活体动物均饲养于经中华民国中央研究院动物实验管理委员会（IACUC）批准并监管的无特定病原体（SPF）动物设施中。
1. 固定
- 收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎，随后将其断头并去除内脏。
- 将胚胎分别置于24孔板中，每孔加入1 mL新配制的含4%多聚甲醛的1×磷酸盐缓冲液（PBS），4 °C摇床上固定过夜。
- 用1 mL 1×PBS至少洗涤固定后的胚胎3次，每次5–10分钟，然后在4 °C摇床上继续孵育过夜，以去除残留的多聚甲醛。
2. 整体免疫染色
- 在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) 对每个胚胎进行透化处理，过夜。
- 在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 含 10% FBS 的 1× PBS 对每个样本封闭，过夜。
- 将胚胎与 1 mL 抗 GFP 一抗（以 10% FBS 按 1:1,000 稀释）在 4 °C 条件下孵育 72 小时，并持续振荡，以增强运动神经的 GFP 信号。
- 一抗孵育后，在摇床上，于 4 °C 条件下，用 1 mL 0.5% PBST 洗涤 1–2 天，期间至少更换三次 0.5% PBST。
- 加入 1 mL 二抗（以 10%....
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结果
LSFM 可对小鼠胚胎中运动神经元的轨迹和轴突分支提供详细的三维可视化图像。在明场下，组织浸入商用透明试剂后完全呈现透明状态。在成像前，样品于透明试剂中保存长达一周，未观察到任何收缩或膨胀现象。在荧光通道下，运动神经元通过转基因表达的 GFP 进行标记（影片 1）。在某些情况下，轴突结构的细节会受到损害。例如，图 2 展示了成像质量较低的情况。多种因素可能影响成像质量：首先，通透和洗涤步骤不充分可能导致背景信号过高；其次，组织透明不充分会引起光散射，导致图像模糊；最后，成像过程中样品位置不佳可能增加光散射或阻断光路。
为了更详细地成像轴突分支并进行定量分析，可调整放大倍数，以揭示每一个精细的分支结构（视频 2）。应比较单侧与双侧照明的图像，以确定分支模式的最佳分辨率（图 3
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讨论
在某些情况下，该实验方案中的多个步骤可进行调整。例如，固定时间取决于胚胎的发育阶段，使用新配制的多聚甲醛时，固定时间可从2小时到1天甚至更长。由于固定是在整体免疫染色之前进行，对于对蛋白质交联敏感的抗体，可选用甲醇作为替代的固定剂。为了在染色后获得较高的信噪比，有必要优化去污剂的浓度（介于0.1%–0.5%之间）。在抗体孵育前后增加额外的洗涤步骤，也可提高信噪比。此外，组织透明化步骤至关重要，以确保光路在整个深层轴突投射过程中无阻碍。为增强组织透明度，在使用商用透明试剂孵育时，应尽量减少PBS的引入，因为将样本重新浸入缓冲液会逆转透明效果。否则，建议使用折射率更高的透明试剂或延长透明时间。同时，不同样本在图像采集过程中的参数设置也有所不同。双侧照明与多视角成像可实现更大景深和更精细的成像效果。然而，由于来自不同角度的照明是同时获取的，对于较小的样本或运动中的样本，单侧照明效率更高。高质量的图像可确保后续定量分析的准确性。
以往的研究，包括我们团队的研究，已利用共聚焦成像或双光子显微镜来观察 Hb9::GFP 胚胎中的运动轴突导航过程或分支模式
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
部分LSFM实验和数据分析使用了中国台湾中央研究院仪器服务中心的先进光学显微镜，并得到了沈淑珍女士的协助。我们感谢李素萍女士在IMB影像核心设施对Imaris图像分析提供的大量技术支持。IMB科学英文编辑核心团队对本文稿进行了审阅。本研究由中央研究院职业发展奖（CDA-107-L05）、科技部（104-2311-B-001-030-MY3）和国家卫生研究院（NHRI-EX106-10315NC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hb9::GFP | 杰克逊实验室 | 005029 | 收集胚胎发育第12.5天（E12.5）的胚胎 |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | 配制200ml：加入20ml 10X PBS、8g PFA至ddH₂O中。用NaOH（10N）调节pH至7.4。过滤除菌后于-20 °C保存。 | ||
| 10X 磷酸盐缓冲液（PBS 10X） | 配制1L：加入80 g NaCl、2 g KCl、14.4g Na₂HPO₄、2.4 g KH₂PO₄，用ddH₂O定容。高压灭菌后室温保存。 | ||
| Triton X-100 | 西格玛 | X100-500ML | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| 羊多克隆抗GFP抗体 | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 驴抗羊抗体 | 英杰公司 | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 透明化试剂 | 舜景生物实验室 | RC149001 | |
| 1.5ml 微量离心管 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24孔板 | 赛默飞世尔科技 | 142475 | |
| 5号直尖镊子 | ideal-tek | 3480641 | |
| 直型锐/锐虹膜剪 | Aesculap | BC110R | |
| 显微外科手术刀片，一次性使用 | Aesculap | BA365 | |
| 解剖显微镜 | 尼康 | SMZ800 | |
| 摇床 | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 显微镜 | 卡尔·蔡司显微系统 | ||
| Imaris 8.4.0 图像分析软件 | Bitplane，苏黎世，瑞士 | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J（Hb9::GFP 小鼠） | 杰克逊实验室 | 005029 |
参考文献
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
- Kania, A., Jessell, T. M.
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重印与许可
