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使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

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DOI：

10.3791/57548

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2018年5月15日

 ,  , 
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

本文内容

摘要

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。

摘要

颞叶癫痫（TLE）是最常见的部分性复杂癫痫综合征，也是对药物治疗反应最差的一种。当药物治疗无效或不建议进行神经外科手术时，深部脑刺激（DBS）是一种有前景的治疗策略。急性脑切片结合微电极阵列（MEAs）是研究神经元网络相互作用及其电刺激调控的有力工具。与传统的细胞外记录技术相比，该方法具有更多观测点以及明确的电极间距，从而可研究电生理信号的传播路径和速度。然而，在MEA记录过程中，组织供氧可能严重受损，需要较高的灌流速率，但这会降低信噪比，并导致实验温度出现更大的波动。电刺激进一步加剧了脑组织的应激状态，使得长时间的记录/刺激难以持续。此外，对脑切片活动的电调控需要精准靶向切片内的特定结构或通路，这就要求能够在实验过程中实时快速完成电极定位映射。本文介绍了如何利用平面微电极阵列（MEA）在啮齿类动物脑切片中记录并进行电调控由4-氨基吡啶（4AP）诱导的癫痫样活动。我们发现，来源于小鼠的脑组织优于大鼠脑组织，因此更适用于MEA实验。本方案能够稳定产生并维持一种可重复的癫痫样放电模式，该模式真实再现了传统场电位记录中观察到的电生理特征，可持续数小时，并能耐受长时间的持续电刺激。通过使用一种定制的小体积记录室，即使在低灌流速率（1 mL/min）下也能实现层流和快速溶液交换，从而保障整个实验过程中脑组织的活性。快速MEA电极映射以及刺激电极的实时监测与选择，则通过一个定制的图形用户界面（GUI）完成。

引言

癫痫是一种危及生命的进行性神经系统疾病，可导致大脑活动失控1；其疾病负担位居前列，并伴随显著的社会歧视2,3。颞叶癫痫（TLE）是最常见的癫痫综合征（占40%），也是对抗癫痫药物耐药性最高的一种类型（约30%）4。尽管手术切除致痫组织可能改善患者病情，但该方法并非适用于所有患者，且无法保证完全无发作的生活5。当药物治疗或神经外科手术不适用时，通过电刺激深部脑结构（DBS）调节癫痫相关的边缘网络环路是一种有前景的治疗策略。

啮齿类动物脑切片是研究健康与疾病状态下神经网络功能的重要工具6 通过……方法 体外 电生理学技术，因为它们至少在一定程度上保留了感兴趣脑区（ROI）原有的结构架构和神经连接。特别是，联合海马-内嗅皮层（hippocampus-EC）水平切片包含了参与颞叶癫痫（TLE）的关键神经元网络，因此常被用于此类研究。 体外 TLE 研究7.

可通过改变人工脑脊液（ACSF）的离子成分，在脑片中急性诱导类似癫痫发作的活动，例如降低镁离子浓度同时升高钾离子浓度8,9,10，或通过药理学手段干预，例如阻断抑制性GABA能活动（详见11的综述）。然而，这些模型基于兴奋与抑制之间的失衡调节，因此无法用于研究兴奋性和抑制性神经网络在癫痫发生过程中的相互作用及其协同贡献。对脑片持续灌注致痫药物4AP可同时增强兴奋性和抑制性神经传递，从而在保持突触活动整体完整的情况下研究急性癫痫发生过程12。

与传统的细胞外场电位记录相比，多电极阵列（MEA）能够从更多观测点记录神经元网络产生的电活动，传统方法因空间限制而难以在脑片表面容纳大量电极。此外，MEA芯片具有电极间距已知的优势，这对于追踪信号传播路径并评估记录信号的传导速度非常有用。尽管MEA最初设计用于培养神经元的记录13,14，但目前也已用于表征来自啮齿类动物15和人类16的急性脑片的电生理特征。因此，在癫痫研究领域，MEA是一种有价值的工具，可用于精确定位癫痫发作发生（ictogenesis）核心的神经网络相互作用16,17,18。

然而，MEA记录在长时间（数小时）的实验过程中， inherently 存在获取或维持稳定癫痫样放电模式的技术挑战。首先，由于记录室体积较大且为圆形的浸入式设计，组织供氧可能不足19,20 典型的商业可购得的多电极阵列（MEAs）存在信号噪声比差和温度不稳定的问题，当使用高灌流速率（6 - 10 mL/min）以改善脑片供氧时，可能会影响记录质量（参见关于加热与灌流设备的技术说明）21。其次，使用浸入式记录舱时，很难观察到具有高频成分的重复性放电，例如癫痫样放电19；当急性癫痫样放电模式由化学诱导并涉及电紧张耦合机制时，尤其如此，4AP 模型即属于这种情况22 （参见11 （以获得全面概述）。为克服这些局限性，研究人员已提出多种策略。例如，提高灌注速率19,20 同时减少脑切片厚度（≤300 µM）和面积17,18 是实现组织充分供氧的关键因素。此外，使用穿孔式多电极阵列（pMEAs）也可提高脑片的存活率，因为这种装置能够从两侧对脑组织进行灌流18.

尽管上述方法已显著提高了从脑片进行MEA记录的可行性，但这些方法尚未经过长时间（数小时）记录和电刺激实验的验证，而后者对脑组织构成了显著的应激。长时间记录可能是必要的，以研究癫痫样放电模式特定特征随时间演变的过程，而这些特征无法通过短期测量揭示。在脑深部电刺激（DBS）研究背景下，可能需要采用长时间的实验方案，以在同一脑片上评估和比较不同刺激范式的效应。

当仅需记录自发性电活动时，通常需对电极相对于感兴趣区域（ROI）进行定位映射 事后, 即在数据分析过程中，诱发反应或电刺激神经调控范式的研究需要将刺激精确传递至特定的感兴趣区域（ROI），因此要求在实验过程中能够快速、简便地进行实时电极定位映射。

本文展示了一种简单的实验方案，可在成年啮齿类动物脑切片中诱导并维持稳定的4-氨基吡啶（4AP）诱导的癫痫样放电模式。所观察到的电活动忠实地再现了该模型使用传统细胞外电生理技术所表征的电生理特征。这种活动可持续数小时，并可在长时间重复的持续电刺激下持续存在。用于维持和孵育脑切片的装置可使用常规实验室器材轻松组装（图1A），而一种可实现最佳灌流速度和层流的定制记录腔室（图1B）可通过商业渠道获得，或以较低成本使用3D打印技术自行制作。通过一个名为 mapMEA 的定制、用户友好的图形界面，可快速对感兴趣区域（ROI）进行定位，实现实时监测并选择刺激电极，该软件可根据请求免费获取。

微流控装置示意图，带有进出口；用于流体动力学分析的多焦点设置
图1：本实验方案所用的定制设备。 (A用于4AP中恢复、预温育和预孵育的保持装置由烧杯和培养皿组装而成。培养皿的直径应小于烧杯，并通过注射器活塞固定就位。将尼龙网（取自柔软的丝袜）用氰基丙烯酸酯胶水粘贴在培养皿边缘以替代其底部。通过插入培养皿与烧杯壁之间的弯脊髓针（22 G）供给氧气。气泡应从烧杯侧壁释放，且不得接触尼龙网，以避免脑片移位。培养皿的盖子可用于防止人工脑脊液（ACSF）蒸发并维持氧饱和度。B) 自定义记录室。in：入口储液槽，用于容纳加热套管和参比电极。out：出口储液槽，用于容纳吸引针。rec：记录室。 (C经火焰抛光弯曲的玻璃巴斯德吸管，用于操作组织并调节其在记录室中的位置。 (D) 定制切片压紧锚具。E记录室最终组装并安装到MEA芯片上。脑片置于底部，由锚定装置固定。红色箭头指示覆盖加热套管的聚四氟乙烯（PTFE）管，红色圆圈指示参考电极，即浸没于入口储液槽人工脑脊液（ACSF）中的饱和KCl小球。蓝色箭头指示出口储液槽中的吸引针。 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

本研究所述所有方法均已获得意大利卫生部批准（授权编号：860/2015-PR），符合欧盟关于动物福利的2010/63/EC指令。

1. MEA/定制培养室组件的制备

注意：在实验开始前2天启动。使用无环状结构的MEA（见材料表）。

  1. 清洁MEA（耗时：35 - 40 分钟）。
    1. 将酶清洁剂粉末溶于温热的蒸馏水中。用刷子将温热的清洁液均匀涂抹在MEA表面，然后将MEA浸泡在温热的清洁液中至少3小时。
    2. 用蒸馏水彻底冲洗MEA，并使用无绒无刮擦的擦拭纸将其擦干。
  2. 将MEA与记录室组装（耗时：10分钟 + 过夜）。
    1. 在记录室底面均匀涂抹弹性密封剂，确保无气泡产生。
    2. 借助镊子将记录室安装到MEA上，并施加轻柔压力。若存在气泡，可一边用手指施加轻压，一边轻微旋转移动记录室，直至所有气泡消失。在记录室外缘周围完整涂布一层密封剂。
      注意：关键步骤！ 切勿让密封剂覆盖MEA的电极接触点。
    3. 将MEA与记录室的组装体放入一个15 cm的培养皿中。在MEA附近放置一个盛有5 mL蒸馏水的培养皿或一个盛有10 mL蒸馏水的烧杯。盖上盖子以保持湿润环境，室温下静置过夜固化。
      注意：本方案可在此处暂停。
  3. 对MEA进行包被以增强其亲水性（耗时：5 - 10分钟 + 过夜）。
    1. 将MEA放入一个15 cm的培养皿中。在MEA的记录区域滴加50 µL的多聚赖氨酸（poly-D-lysine）。盖上培养皿，用封口膜密封，并在4 °C下保存过夜。
    2. 用蒸馏水彻底冲洗MEA，并将MEA保存在4 °C的蒸馏水中。
      注意：本方案可在此处暂停。包被后的MEA可储存并在多次实验中重复使用。定期清洁并重新包被MEA有助于去除组织残留物，提高信噪比。

2. 储备液的配制

注意：实验前1天开始准备（耗时约2小时）。储备液有助于加快实验当天的操作速度，可预先配制并保存。浓度倍数和成分详见表1，最终溶液的成分参见表2。

  1. 在室温下将化学物质溶解于蒸馏水中。使用滤瓶（滤膜直径：0.22 µm）过滤储备液。
  2. 在 4 °C 下保存（推荐最长保存时间见表1）。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

3. 琼脂的制备

注意：实验开始前1天准备（耗时约1 h）。

  1. 将 250 mL 蒸馏水倒入 500 mL 烧杯中，以 350 rpm 的速度开始搅拌。加入 5 g 琼脂，待其完全溶解。
  2. 将溶液加热至 250 - 300 °C，使水分蒸发，直至溶液体积减少至约 200 mL，得到 2.5% w/v 的琼脂溶液。
    注意：温度应足够高以使水分蒸发，但避免产生气泡。
  3. 将琼脂溶液倒入一个容积约为 200 mL、壁高约 1.5 cm 的塑料方盒中，在室温下冷却至凝固。
  4. 盖上盒盖，于 4 °C 保存。琼脂块可稳定存放数周。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

4. 冷冻切面的制备

注意：实验开始前 1 天进行准备。

  1. 将蒸馏水注入平底不锈钢碗中，液面距碗口边缘以下 0.5 - 1 cm。
  2. 于 -20 °C 条件下过夜保存。

5. 神经保护性切割用ACSF的制备

注意：在实验开始前1天或实验当天开始（见表1和表2）（耗时：30 min）。

  1. 在500 mL烧杯中加入200 mL蒸馏水，并以磁力搅拌器在350 rpm下开始搅拌。
  2. 加入50 mL储备液B和50 mL储备液C（见表1）。
  3. 加入3 mM丙酮酸、208 mM蔗糖、10 mM D-葡萄糖和1 mM L-抗坏血酸。
    注意：丙酮酸的实际体积取决于其密度和纯度，并可能因批次不同而有所变化。每次开启新批次时，均需重新计算所需体积。
  4. 用封口膜覆盖，持续搅拌30分钟。
  5. 将溶液转移至500 mL容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度。
  6. 用封口膜密封容量瓶，轻轻倒置3–5次，直至溶液均匀澄清。
  7. 将切割用人工脑脊液（ACSF）转移至带盖玻璃瓶中。
  8. 将切割用ACSF在-80 °C下保存20–30分钟，或在4 °C下过夜，以冷却至4 °C。
    注意：若选择过夜冷却，此处可暂停实验流程。否则，可在冷却ACSF的同时进行第6步操作。

6. 灌流人工脑脊液的配制

注意：在实验当天新鲜配制该溶液（耗时：5 - 10 分钟）。维持型人工脑脊液（ACSF）将在切片过程中用于冲洗脑片中的切片用ACSF（见步骤8.16），并用于脑片的长期保存和预温育。冲洗脑片时，100 mL维持型ACSF已足够。本方案中所用的维持和预温育装置为自制装置，其容积分别为300 mL和100 mL（参见 图1A）。在此设置下， 500 mL 保存用人工脑脊液 已足够。若从商业渠道获得的记录室容积不同，则应相应调整所需配制的总体积孵育ACSF。

  1. 在500 mL容量瓶中加入200 mL蒸馏水。
  2. 加入50 mL储备液A、50 mL储备液B、6.5 mL储备液M和1 mM L-抗坏血酸。通过旋转轻轻振荡，直至L-抗坏血酸完全溶解。
  3. 用蒸馏水定容至刻度，用封口膜密封容量瓶，轻轻倒置3 - 5次，直至溶液均匀澄清。有关保存用人工脑脊液（ACSF）的组成，请参见表2。

7. 实验台的准备

注意：此步骤需要 15 分钟，另需 30 分钟使温浴达到稳定温度。

  1. 记录工作台
    1. 启动温水浴，将其设定为 32 °C，加盖以维持其温度。
      注意：本实验方案中使用的温水浴可使用硬质塑料盒和预设为所需温度的水族恒温器自制。从室温开始，约30分钟可达到稳定的设定温度。由于预热和孵育腔体置于塑料盒底部，水位应刚好浸没恒温器，以防止腔体浮起。
    2. 组装持卵室和预热室（参见 图1A），并将保持用的ACSF倒入其中。将保持室置于室温下，并将预热室放入温浴中。开始用95% O₂2/5% CO₂2 气体混合物，并用倒置的巴斯德移液管去除任何夹带的气泡。保持覆盖状态。
  2. 切片台和振动切片机
    1. 使用氰基丙烯酸酯胶水将一小块琼脂固定在样品盘中央。
    2. 将一个250 mL烧杯放入装有冰的冰桶中，并倒入切割用ACSF溶液。
    3. 取两个 100 mL 烧杯，分别倒入 50 mL 的灌流 ACSF，置于室温下备用。这两个烧杯用于冲洗。
    4. 开始用 95% O₂2/5% CO₂2 气体混合物
    5. 将缓冲液托盘安装到振动切片机上，并用碎冰包围。在碎冰上倒入适量乙醇，以帮助在切片过程中维持低温环境。倒入乙醇后，根据需要添加更多冰块。
      注意：温度为 2 °C 是最佳选择。
    6. 将起泡器放入缓冲液托盘中，然后组装并安装振动切片机刀片组件。
      注意：确保刀片安装时的 Clearance angle 约为 ~10°.
    7. 将碎冰放入500 mL烧杯中，至体积的2/3处，然后加入蒸馏水至充满。
    8. 将冷冻的碗从冰箱中取出，倒扣在切片台上，并用一张纸巾和一张滤纸覆盖。
  3. 麻醉工作台
    1. 将一个小烧杯放入盛有冰块的托盘中，并倒入切割用人工脑脊液（ACSF）。开始用95% O₂2/5% CO₂2 气体混合物

8. 脑切片制备与维持

注意：本实验方案使用成年（4 - 6 周龄）雄性 CD1 小鼠，但也可使用其他品系（例如C57/BL617,18) 可被使用。我们随后还将小鼠脑切片的实验结果与同龄雄性Sprague-Dawley大鼠脑切片所得结果进行比较。以下步骤涉及 部分断开 由CA3驱动的脑切片 快速 类似发作间期的活动局限于海马本身，无法向海马旁皮层传播，如所述23海马-皮层失连接是利用海马-内侧皮层脑片制备进行电调控研究的前提条件。所使用的振动切片机指的是清单中所列的型号 材料表其他模型可能需要采用不同的操作步骤。

  1. 使用5%异氟烷与碳合气混合气体，以2 L/min的流速通入麻醉诱导室，对啮齿类动物进行麻醉。
  2. 在深度麻醉状态（对足部和脚掌施加夹捏无反射反应）下，按照文献23中的标准操作流程，在1分钟内取出脑组织。将脑组织放入盛有预冷平衡切割型人工脑脊液（ACSF）的小碗中，静置冷却90–120秒。
    注意：脑组织冷却时间不宜过长，否则可能冻结。
  3. 将冰冻的切割型ACSF倒入缓冲托盘中。将切割型ACSF均匀铺在置于冷冻托盘上的滤纸上。将脑组织放置于滤纸上，通过去除小脑并垂直切除额极，分离出所需的目标脑组织块。
  4. 借助弯头刮勺，用少量氰基丙烯酸酯胶水将脑组织背侧粘附于样品盘上，使已切开的额侧朝向琼脂块，枕极朝向振动切片机刀片。立即安装样品盘并固定于缓冲托盘中。
  5. 调整切片范围，使振动切片机刀片能够完全穿过组织直至琼脂块。调节样品盘高度，使刀片与脑组织块处于同一水平面。
  6. 在切片过程中，弃去前段组织，直至海马结构清晰可见（通常约900 µm处）。随后设置切片厚度为400 µm，开始切片并保留组织切片。每一切片需分离左右半球，并修剪多余组织，获得两片脑切片。随着后续切片进行，缓冲托盘逐渐升高，此时应向托盘槽内加入冰冻的蒸馏水（参见步骤7.2.7）。
  7. 使用倒置的巴斯德移液管，轻柔地将脑切片转移至第一个清洗烧杯中，排空移液管后，再将脑切片转移至第二个清洗烧杯。随后将脑切片转入孵育室，使其恢复至少60分钟。
    注意：通常可获得6–8片脑切片。本方案可在此处暂停。

9. 含4-AP的ACSF（4AP-ACSF）的配制

注意：此步骤需要10分钟准备时间，另加20分钟预热。注意！ 4-AP 是一种致惊厥药物，具有毒性。操作时需戴手套，避免洒出。

  1. 在500 mL容量瓶中加入200 mL蒸馏水。
  2. 加入50 mL储备液A、50 mL储备液B、5 mL储备液M和1 mM L-抗坏血酸。通过旋转轻轻振荡，直至L-抗坏血酸完全溶解。
  3. 添加 500 µL 4AP 储液的
  4. 加入蒸馏水至最终体积，用封口膜密封容量瓶，轻轻倒置3 - 5次，直至溶液均匀澄清。
  5. 组装4AP孵育室（参见 图1A）并倒入约80 mL的4AP-ACSF溶液。盖上灌流 chamber，将其转移至恒温浴槽中，并用95% O₂2/5% CO₂2 气体混合物。使用倒置的巴斯德移液管去除任何滞留的气泡。保持覆盖状态。
  6. 等待4AP-ACSF溶液温度降至30 - 32 °C （约20分钟）
    注意：如果脑切片仍在恢复中，可在此暂停实验方案。

10. 切片在4AP中的预温育与孵育（持续时间：90分钟）

  1. 检查预热的ACSF和4AP-ACSF的温度是否为30 - 32 °C。
  2. 使用倒置的玻璃巴斯德吸管将1个脑片转移至预热孵育室中，让组织静置25 - 30分钟。然后将脑片转移至4AP-ACSF孵育室中，静置60分钟。

11. 多电极阵列装置的准备

注意：记录前 15 分钟开始。

  1. 将剩余的4AP-ACSF转移至一个500 mL的锥形瓶中。
  2. 将锥形瓶放置在MEA放大器上方的架子上，并使用导管使溶液持续流入一个60 mL的注射器中。调节锥形瓶和注射器的高度，使溶液以重力驱动的流速维持在1 mL/min。
    注意：合适的高度取决于导管的内径（ID）。对于内径为5/32英寸的导管，30 cm的高度已足够。
  3. 开始用95% O2/5% CO2 混合气体对锥形瓶和注射器中的4AP-ACSF进行持续鼓泡。
  4. 让4AP-ACSF通过灌流导管流入烧杯，直至系统内无气泡；然后停止溶液流动。
  5. 将MEA基座上的加热元件连接至恒温器。将干燥的MEA芯片放入MEA放大器中，并固定放大器头部。使用塑料巴斯德吸管将4AP-ACSF加入记录室的入口和外周储液槽中。
  6. 将抽吸针置于储液槽内，并通过将其浸入ACSF中检查是否存在负压；确认可听到持续的低频抽吸声。
    注意：抽吸针应放置在合适位置，使4AP-ACSF刚好流经脑片表面。可使用真空管线或低噪声真空泵。
  7. 将加热套管固定在磁性支架上，并将其尖端插入记录室的入口端口；将磁性支架固定在MEA放大器头部的磁条上；将灌流导管连接至套管；并将套管连接至恒温器。
    注意：加热套管应由斜面聚四氟乙烯（PTFE）导管包裹，以延伸至记录室入口端口，并减少因套管金属材料引起的噪声。当入口储液槽充分充满4AP-ACSF后，不应观察到灌流系统滴液。
  8. 调节流速控制器，使流速为1 mL/min，并开始灌流。
    注意：重力驱动灌流可消除蠕动泵可能引起的噪声；若使用蠕动泵，则必须选用低噪声型号。
  9. 当4AP-ACSF开始通过套管流动后，开启恒温器。将加热套管温度设为37 °C，MEA基座温度设为32 °C，以使记录室内温度达到32 - 34 °C。
    注意：警告！切勿在无液体的情况下加热套管，否则可能导致不可逆损坏。应将套管设定温度高于记录温度（即 32 - 34 °C），以补偿加热套管尖端及记录室内实际温度与设定值之间的固有温度偏移。流速、环境温度及记录室体积均会影响记录液的温度。步骤11.9中所述参数已针对本方案及设备优化。务必使用热电偶测量实际记录温度，并根据需要调整设置。切勿将MEA基座温度设为超过34 °C，以防脑片过热。
  10. 将外部参比电极置于记录室入口储液槽中。
    注意：尽管MEA芯片配备有内置参比电极，但其被定制的记录室结构覆盖，因此必须使用外部参比电极。饱和KCl小球电极最为实用，因其无需氯化处理即可直接使用。

12. 微电极阵列实时成像

  1. 待4AP-ACSF液面和记录温度稳定至理想状态后，将灌流和吸引开关转至关闭位置，以暂时停止灌流和吸引。
    1. 使用倒置的玻璃巴斯德移液管，迅速将一片脑切片转移至MEA记录室中。根据需要，使用火焰抛光的卷口巴斯德移液管调整其在MEA记录区域上的位置。图1C）或柔软的小型紧凑刷子。放置固定锚（图1D) 放置到脑切片上。通过将两者的旋塞重新转回开启位置，恢复灌流和吸引。
      注意： 关键！ 切片应在60秒内转移并重新开始灌流，否则组织可能死亡。固定切片的压片锚应预先置于4AP-ACSF中，以避免因表面张力差异导致在将锚放置于脑片上时引起脑片移动。用于将脑片固定在多电极阵列（MEA）上的压片锚可使用不锈钢丝和尼龙线自行制作（图1D）或从商业来源获得。 图1E 显示最终的实验装置，其中MEA芯片已连接至放大器探头：脑切片置于记录室内的MEA芯片上，并由定制锚具固定。参考电极（红色圆圈）和覆盖加热套管的PTFE导管（红色箭头）位于进液储液池中，而吸液针（蓝色箭头）则位于出液储液池中。
  2. 使用安装在倒置显微镜载物台上的相机拍摄脑切片图像。
  3. 运行脚本 mapMEA 在计算机软件中启动图形用户界面以映射电极。
    注意：该定制软件允许用户选择与脑片特定结构相对应的电极。此步骤至关重要，可通过电刺激激活正确的通路并抑制痫性活动。

脑切片电极放置；示意图、软件设置、神经定位方法、电极选择。
图 2：实时 MEA 电极定位 的图形用户界面（GUI）。（A）海马-内嗅皮层（EC）联合脑切片在微电极阵列（MEA）上放置的示意图。本实验方案默认使用的脑区结构包括海马角3区（CA3）、内嗅皮层（EC）、旁嗅皮层（PC）和下托（SUB）。参考电极以三角形标记示意。虚线圆圈内的电极表示用于图像校正的 XY 坐标。（B）实时 MEA 定位过程中 GUI 界面的屏幕截图。截图左侧的流程图显示了需遵循的逐步操作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 点击 浏览 按钮以加载脑切片图像。确保参考电极出现在MEA左侧上半部分的第一行（图2A，三角形标记）。点击 激活指针 按钮，然后选择阵列最左侧一列的顶部和底部电极，以标记用于图像校正和电极映射的XY坐标。
  2. 从 切片类型 下拉菜单中选择 水平。勾选 默认结构 复选框。
    注意：可通过点击 输入新结构 按钮来自定义结构。水平脑切片的默认结构如 图2A 所示。
  3. 使用脑切片图像下方的数字按钮，选择对应于感兴趣区域（ROI）的电极，然后点击结构面板中相应的按钮进行分配（图2B）；对每个ROI重复此步骤。
  4. 按下 保存 按钮：软件将生成一个名为 #EXP_LabelledElectrodes 的结果文件夹，其中包含一个报告所选电极和ROI的表格。

13. 癫痫样活动的记录与电调控

  1. 让脑片在记录 chamber 中稳定 5 - 10 分钟后再开始记录。
  2. 在开始刺激程序前至少10分钟打开刺激单元，以使其完成自校准和稳定。启动刺激控制软件，并确认刺激器与MEA放大器已正确连接，软件主界面中的绿色LED指示灯将显示连接状态。有关更多详细信息，请参阅特定仪器和软件的使用手册。 参见 材料表.
  3. 采用双极配置进行刺激。选择与CA1区/近端下托锥体细胞层接触的电极对。参见24,25）在通过脚本比对的序列中 mapMEA (参见 第12节）。使用导线将所选电极中的一个连接至刺激器的负极插孔，另一个电极连接至同一刺激器通道的正极插孔。使用另一根导线将刺激器的接地端连接至放大器的接地端。
  4. 启动记录软件。为获取数据，请按下 播放 在录音软件主面板上点击按钮。至少记录4次发作期放电。
    注意：2 kHz 的采样频率可在获得较佳分辨率的场电位信号的同时，最大限度减少硬盘空间占用。一段 5 分钟的记录文件约占 80 MB。如需更高采样频率，可能需要 例如，用于记录刺激伪影或多单位放电活动。若仅需观察场电位，请使用300 Hz的实时低通滤波器以去除多单位放电活动。
  5. 确定刺激强度。
    1. 在刺激控制软件中，使用主面板设计一个持续时间为方形双相正负电流脉冲 100 µs/phase.
      注意： 警告！ 直流刺激需要平衡的电荷脉冲，以避免损坏设备。
    2. 运行 快速 输入/输出（I/O）测试以确定最佳刺激强度。通过在刺激控制软件的适当界面中设置不低于5秒的脉冲间隔，以0.2 Hz或更低的频率施加第13.5.1步设计的刺激脉冲。在 脉冲幅度 输入初始脉冲幅度 100 µA/phase 并增加 50 - 100 µA 每次试验逐步进行，直至刺激能够稳定地在海马旁皮层诱发类似发作间期的事件（通过记录软件显示的信号进行确认）。
  6. 边缘系统癫痫发生的电调控
  7. 设置刺激单元以执行所需的刺激方案。使用在输入/输出测试期间确定的刺激强度。
    注意：诱发电位反应的失败率应 ≤20%。
  8. 刺激停止后，通过记录至少4次痫性放电（同步骤13.4）来验证网络是否恢复至刺激前状态。

结果

采用6 × 10布局、电极间距为500 µm的平面MEA是本实验方案的理想记录装置，因为其记录区域可完全覆盖整个脑切片（图3A，另见17）。尽管穿孔MEA（pMEA）更有利于改善组织供氧，但其记录区域过小（直径约2 mm），无法同时记录海马和旁海马皮层产生的电信号（数据未显示；见18）。

观察到的4AP诱导的癫痫样放电模式（图 3A）忠实地再现了在此类情况下通常观察到的现象 体外 采用传统场电位记录方法建立的模型，包含三种类型的活动7,26: (i) 类似发作事件（图3B，箭头所示）是坚固且持久的（>20 秒，范围：20 - 60 秒）事件，表现出类似癫痫发作活动的脑电图特征，包含强直性和阵挛性成分（图 3C）；它们每 3 - 5 分钟在海马旁皮层内产生，并通过齿状回重新进入海马结构（图3D，箭头）；（ii) 慢性发作间样放电 (图3B，EC痕迹，黑色标尺；放大显示于 图3E）是短的（<1 s）在海马-内嗅皮层脑片制备中，痫样事件之间普遍存在持续约1秒的群体性电活动，且发生频率较慢（间隔10–30 s）；（iii快速类似发作间期的放电（图 3B，CA3 迹线，黑色条；放大显示于 图3E) 是反复出现的短暂（<1秒）由海马CA3亚区产生的群体事件；当Schaffer侧支保持完整时，快速的CA3驱动的发作间期事件可沿海马环路传播，并发挥抗致痫作用24 （数据未显示）；为防止痫样放电活动衰减，本方案中通过阻断CA3输出来实现参见 图3B, E需要注意的是，使用微电极阵列（MEAs）记录到的由CA3快速驱动的发作间期活动，其发生频率（约0.4 Hz）较使用玻璃微电极进行传统场电位记录所观察到的更慢。 （约 1 Hz，范围：0.5 - 2.0 Hz，数据未显示）。

电刺激神经调控在啮齿类动物脑片中成功的关键在于特异性神经通路的激活27 以及制备所包含区域之间的内在连接性24我们测试了来自成年雄性Sprague-Dawley大鼠和CD1小鼠的脑片，发现相较于大鼠，小鼠脑片在尺寸、厚度和内在连接性之间具有更优的平衡。首先，由于其尺寸较小，更适配 commercially available 多电极阵列（MEAs）的较小记录区域（图 4A，左侧：大鼠，右侧：小鼠）；其次，它们对MEA记录中固有的不利条件具有更强的耐受性（参见 引言）：尽管这两种组织产生的类似发作性放电（图4B) 持续时间相似 (图4C 左图），其在小鼠脑片中的发生频率显著较短（每种物种 n = 10 个脑片；双尾非配对 t 检验， p < 0.001; 图 4C 右侧）。后者可加快实验流程，使得在单个实验日内能够检测更多脑切片：在此组代表性结果中，我们对两种物种的脑切片检测数量相近（大鼠：n = 58；小鼠：n = 52），但小鼠个体数（n = 18）比大鼠个体数（n = 42）少一倍。

此外，小鼠脑切片似乎具有更密集的神经连接，因此更有可能对持续的电刺激神经调节产生较好的响应。图 4D）。因此，在本研究中 体外 癫痫发作模型中，旨在控制痫样活动的电刺激在小鼠脑组织中的可行性明显高于大鼠脑组织。这一特点也体现在使用脑片进行的刺激实验中，即使采用多种持续刺激方案，小鼠脑片实验的成功率也显著高于大鼠脑片。 (图4E）。事实上，小鼠脑组织似乎更能耐受持续的电刺激，这由在4小时测试实验时间范围内较高的存活率所表明（图4F因此，小鼠脑片不仅体积更小，而且能更好地保持固有连接性，是进行MEA记录以研究海马-海马旁网络相互作用以及评估与颞叶癫痫（TLE）相关的电神经调控方案的最佳选择。

在CA1/下托区域施加的周期性刺激已知可调控经4AP处理的海马-内侧皮层脑片制备模型中的边缘系统癫痫样放电24,25,27，其中1 Hz为最有效的频率27因此，它也可作为阳性对照，用于评估其他神经调控策略的有效性和效率（例如参见25）。如上所述，通过MEA直接递送的电脉冲（即，无需外部刺激电极）可在啮齿类动物脑组织中诱发群体反应（另见28). 脑切片内神经网络连接性的充分保存、脑切片在多电极阵列上的准确定位，以及刺激电极对的适当选择，使得能够开展有效调控癫痫发生的电神经调节实验。如图所示 图 5A可以使用平面MEA既作为记录装置又作为刺激装置，重现经典的1 Hz周期性起搏方案，其优势在于与传统的场电位记录相比，能够通过数量更多且等距分布的观测点，全程可视化观察电刺激对脑组织切片的影响。 图5B 显示了 n = 9 个脑切片实验结果的定量分析，表明总发作时间（总痫性活动持续时间/观察时间）显著减少25) 刺激期间（单因素方差分析，F(df)：6.84(2) p <0.01，Fisher 最小显著差异法 事后检验 测试，已保护）。结果与外部刺激电极的文献报道一致24,25.

为了计算总发作时间，观察时间取决于发作事件之间的间隔，同时也决定了为可靠评估神经调控效果所需的最小刺激方案持续时间。我们发现，记录至少4次发作性放电（即至少3个发作事件之间的间隔）是在采集样本数量与所需采集时间之间的一个良好权衡。在对照条件下（即无刺激），观察时间为首次测得的发作事件起始至最后一次发作事件终止之间的时间差。而在神经调控过程中，观察时间等于刺激方案的持续时间，因为测量的目的是量化在系统中引入扰动期间所发生的全部现象。相较于单独测量发作事件的持续时间或事件间间隔，计算并比较总发作时间是避免Ⅱ型错误的最合适参数。事实上，除了完全抑制发作活动外，还可能出现仅在电刺激期间发生一次发作事件的情况，而对照条件下通常会观察到多次发作事件。在此情况下，无法测量事件之间的间隔，若仍以发作持续时间作为刺激有效性的评估指标，则不能真实反映神经调控的实际效果（即发作活动的减少）。

总体而言，本文展示的结果表明，结合微电极阵列（MEA）的小鼠脑片是癫痫研究以及开展与癫痫治疗中深部脑刺激（DBS）领域进展相关的可靠神经调控研究的有力工具。此外，本文所述方案可提高脑片的存活率，并支持持续数小时的实验操作（图6），例如在比较不同电刺激范式的效果时可能需要较长的实验时间。

神经生理学数据分析；电极网格记录；电生理信号；电压图
图3：使用平面多电极阵列（MEAs）记录的典型4AP诱导的癫痫样放电模式。 (A小鼠脑切片置于平面6 x 10微电极阵列（MEA）上（电极间距： 500 µm) 以及通过MEA记录所呈现的4AP诱导的癫痫样放电模式的并列概览。网格中的每个方格对应脑片中相应位置的记录活动。虚线蓝线用于更清晰地标识电极行。每个方格左上角的蓝色数字表示记录电极编号。灰色交叉方格代表参考电极。B) EC和CA3模式在更快时间尺度下的代表性轨迹片段。箭头指示痫性事件。在EC轨迹中可观察到慢波的出现 痫间放电（黑色条），而CA3亚区则产生典型的持续性快速痫间放电模式（黑色条）。(C）扩展记录的一次发作期放电，显示典型的强直-阵挛模式。D) 快速尺度下可视化标记于（B）中红色条形区域内的内嗅皮层（EC，红色）和CA3（黑色）迹线片段所对应的发作前期至发作期转变过程。箭头指示发作性放电的起始点。叠加的迹线突出显示，发作事件起源于内嗅皮层，随后传播至CA3亚区。E) B图中黑色条标记的发作间期的扩展视图突显了慢波活动之间缺乏相关性 分别由EC（红色）和CA3（黑色）产生的快速发作间期放电模式。 请点击此处以查看此图的放大版本。

神经记录分析；脑片电极；图表比较小鼠和大鼠的癫痫发作指标。
图 4：小鼠脑片比大鼠脑片具有更高的实验产出率。（A）年龄匹配的大鼠（左）和小鼠（右）脑片。大鼠脑片明显大于MEA记录区域，其电活动无法被完整记录。（B）小鼠与大鼠内嗅皮层（EC）产生的复发性痫性活动的直接视觉比较。（C） 小鼠和大鼠脑片产生的痫性放电持续时间相似，但大鼠脑组织中这些事件的间隔时间几乎为小鼠的2倍。 * p <0.05。（D）与大鼠相比，小鼠用于控制痫样发作的电刺激实验可获得的可用脑片数量高出2倍。在58个大鼠脑片中，仅有20个（34%）可在海马下托电刺激后在旁海马皮层诱发群体反应，而小鼠脑片中这一比例为52个中有33个（63%）（Chi2：9.22；p = 0.002）。* p <0.05。（E）在可用的脑片中，小鼠脑片控制痫性活动的成功率是大鼠脑片的2倍（小鼠：33个脑片中20个成功，60%；大鼠：20个脑片中6个成功，30%；Chi2：4.67；p = 0.03）。* p <0.05。（F）小鼠脑片能够耐受多次长时间的持续电刺激（灰色阴影区域）。刺激停止后，小鼠脑组织的癫痫样放电模式可完全恢复，而大鼠脑组织的活性在3小时后显著下降。请点击此处查看该图的放大版本。

显示痫性状态的电生理数据；比较不同条件下内嗅皮层和海马旁皮层的柱状图。
图5：利用与微电极阵列耦合的脑片进行痫性发作电调控的代表性实验。（A）在对照条件（无刺激）、1 Hz 周期性起搏（PP，刺激伪迹被截断）以及停止刺激后的恢复期间，内嗅皮层（EC）和海马旁皮层（PC）中由4AP诱导的痫性活动记录。（B）PP在1 Hz下对总发作时间影响的量化结果。* p <0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

电生理信号分析，EC和PC时间序列，波形比较，图表，3小时数据。
图6：4AP诱导的痫样活动的代表性长期记录。（A）脑片制备后8小时、并在应用4AP 2小时后记录的迹线片段。（B）对应于（A）图中标记为a、b和c的方框内痫样放电的扩展迹线片段，显示在较长的观察时间窗内所生成的痫样活动具有一致性。请点击此处查看该图的放大版本。

储备液 A化学物质分子量浓度 (mM)
NaCl58.441150
溶剂：蒸馏水KCl74.5520
浓缩倍数：10x KH2PO4136.112.5
储存温度：4 °CCaCl2*2 H2O147.0220
最长储存时间：1 周D-葡萄糖180.2250
备注：使用 50 mm 膜过滤器过滤
储备液 B化学物质分子量浓度 (mM)
NaHCO384.01260
溶剂：蒸馏水
浓缩倍数：10x 
储存温度：4 °C
最长储存时间：1 周
备注：使用 50 mm 膜过滤器过滤
储备液 C化学物质分子量浓度 (mM)
KCl74.5520
溶剂：蒸馏水KH2PO4136.112.5
浓缩倍数：10x MgCl2*6 H2O203.350
储存温度：4 °CMgSO4*6 H2O246.4720
最长储存时间：2 周CaCl2*2 H2O147.025
备注：使用 50 mm 膜过滤器过滤
储备液 M化学物质分子量浓度 (mM)
MgSO4*6 H2O246.47100
溶剂：蒸馏水
浓缩倍数：100x
储存温度：4 °C
最长储存时间：4 周
4AP 储备液化学物质分子量浓度 (mM)
4-氨基吡啶94.11250
溶剂：蒸馏水
浓缩倍数：1000x
储存温度：4 °C
最长储存时间：2 周
备注：涡旋振荡 2–3 分钟或搅拌 30–60 分钟
注意：危险！ 4-AP 具有毒性且可诱发惊厥。操作时需佩戴手套，避免扩散或洒出。

表1：储备溶液。

维持用人工脑脊液（ACSF）记录用人工脑脊液（ACSF）切片用人工脑脊液（ACSF）
化学物质浓度 [mM]化学物质浓度 [mM]化学物质浓度 [mM]
NaCl115NaCl115Sucrose208
KCl2KCl2KCl2
KH2PO41.25KH2PO41.25KH2PO41.25
MgSO41.3MgSO41MgCl25
CaCl22CaCl22MgSO42
D-glucose25D-glucose25CaCl20.5
NaHCO326NaHCO326D-glucose10
L-Ascorbic Acid1L-Ascorbic Acid1NaHCO326
L-Ascorbic Acid1
pH7.4pH7.4Pyruvic Acid3
Osmolality300 mOsm/KgOsmolality300 mOsm/Kg
pH7.4
Osmolality300 mOsm/Kg

表2：溶液组成。

故障排除
问题应对措施
发作期放电呈现“块状”外观降低灌流速度和/或通过调整吸液针位置减少脑片上方的ACSF体积。
无发作期活动(1) 确认CA3驱动的快速发作间期事件是否未传播至皮层。如有必要，使用小解剖刀片（例如，n.10）或针切断Schaffer侧支，但需注意避免切断固定脑片的尼龙线。建议使用体视显微镜或直立显微镜，倒置显微镜会使此操作极为困难。
(2) 检查脑片活性：强电刺激是否能诱发发作期活动？等待约2小时4AP作用后，若仍未出现发作期活动，则更换脑片。
放置固定锚时脑片发生移动(1) 轻柔移除脑片固定锚并重新定位脑片。
(2) 检查固定锚是否均匀润湿了4AP-ACSF。
(3) 从记录室中移除4AP-ACSF，以促进脑片与MEA芯片的贴附。
(4) 重新放置脑片固定锚。
脑片转移后在MEA芯片上漂浮(1) 使用巴斯德移液管轻柔吸除多余的ACSF。
(2) MEA芯片可能需要重新包被。
电刺激未能引发网络反应增加刺激强度，更换电极对。
电刺激可在近端但不能在远端皮层区域引发群体反应该问题可能源于连接性差或刺激强度过低。电刺激可能仅在部分皮层区域有效或无效。建议更换脑片。
信号噪声大(1) 检查参考电极：基线噪声有时是由于入口储液池未完全充满，导致参考电极未能充分浸入ACSF中。
(2) 检查设备的整体接地情况。
(3) 调整吸液针位置，使其发出持续而轻柔的吸液声。将吸液针接地。
(4) 使用棉签蘸乙醇清洁MEA外部接触点。
(5) MEA芯片可能已损坏：更换MEA芯片并检查伪迹及信噪比。

表3：故障排除。

讨论

多电极阵列（MEAs）是神经生理学研究中不可或缺的工具，得益于数十年的探索与发展，近年来已趋于成熟。与传统的场电位记录相比，MEA具有显著优势，即可提供更多的观测点以及明确的电极间距，这对于精确定位神经元网络间的相互作用至关重要。

MEA 记录技术还可与其他电生理学方法结合使用，例如膜片钳记录15，以研究单个神经元活动与神经网络活动之间的关系。此外，同时可视化场电位和多单元活动的可能性，可为小规模神经元群体活动与集体神经网络活动之间的相关性提供宝贵的见解。与电压敏感性染料、钙成像和光遗传学29相结合，能够通过多角度方法推断神经生理学现象。除了药理学研究外，同一系统既可记录又可刺激的特性使 MEA 记录技术具有极强的功能性和广泛的应用性：例如，利用本文介绍的神经调节方案，可研究记忆形成核心的突触可塑性现象30，这些方案与用于治疗癫痫及多种脑部疾病的深部脑刺激（DBS）密切相关。最近的研究已证实，MEA 记录技术可成功应用于人类癫痫脑组织16，这表明该技术在癫痫研究中具有不可估量的价值，不仅有助于理解这种毁灭性疾病的基本机制，还可优化 DBS 算法以改善治疗效果。

然而，由于MEA需要使用浸没式记录室，并要求脑片直接放置在集成了微电极的固体基底上，这使得脑片电生理实验不得不在“受限”条件下进行。因此，脑组织可能无法获得充足的氧气供应，进而影响记录质量。

本文所述方案可利用急性离体4AP模型，结合微电极阵列（MEA）可靠地记录和研究啮齿类动物边缘系统网络中的癫痫发生过程，并实现长时间的电刺激，从而为评估深部脑刺激（DBS）策略提供重要信息。

基于传统场电位记录研究癫痫边缘网络电神经调节的既往研究中，使用小鼠或大鼠脑片所得结果相似24,25；但大鼠脑组织的使用更具挑战性，这可能与其相比小鼠脑组织连接性较弱有关7。就微电极阵列（MEA）技术而言，由于小鼠脑片尺寸较小，更适用于该技术。此外，由于小鼠脑组织中类发作样放电的发生率高于大鼠，因此在一次实验日内可检测更多脑片，从而加快数据采集速度、提高效率，并减少实验动物的使用数量。

相对于现有方法的意义：

使用本文所述定制记录室记录到的痫样放电在持续时间和发生频率上似乎与使用传统MEA环形记录室及相同类型MEA（平面微电极，参见 17）所观察到的结果相似。然而，必须强调的是，当使用传统的圆形记录室并配合低灌流速率（1 mL/min）时，脑片厚度必须显著减小，这可能因连接性较差而妨碍神经调控实验的顺利进行。

在此方案中，一种受膜片钳记录 chamber 设计启发的低体积定制记录 chamber 提供了稳定且可靠的层流，这对于成功进行 MEA 记录至关重要；同时，该设计允许将脑片厚度增加至 400 µm，从而在组织存活率与内在连接性之间实现合理平衡。事实上，人们普遍认为，记录 chamber 内记录液的层流在脑片电生理实验中极为理想，因其不受在环形流动式圆形记录 chamber 中常见的温度、氧气和 pH 梯度的影响。 关键词：MEA 记录，脑片，电生理学，层流，记录 chamber，膜片钳，组织存活率，内在连接性19,20,31 （如商业化的多电极阵列所配备的那些）。此类梯度会引入实验偏差，并对脑片产生不利影响。使用体积相对较小的记录室（约1.5 mL）并结合高灌流速率（5 - 6 mL/min)16,31 确保灌注液充分交换（≥3次/分钟）。该定制腔室可从商业渠道以合理价格轻松购得，或使用3D打印技术在实验室内部制备。其他研究已报道从400 µm厚的人脑切片获得MEA记录16 使用传统的MEA环形室，保持ACSF体积为1 mL，并借助低噪音蠕动泵实现高灌注速率（5–6 mL/min）。然而，作者采用了一种不同的癫痫发生模型， 即，低浓度 Mg2+，这一体系受涉及显著升高细胞外K+的电紧张机制影响的可能性较4AP模型更小+ 浓度11,22我们发现，在4AP模型中，高灌注速率并不可取，可能是由于积累的细胞外K⁺被快速冲走所致。+，这可能需要在记录用人工脑脊液（ACSF）中显著增加16事实上，当ASCF灌注速度增加至2-3 mL/min且脑片被较厚的ACSF层浸没时，痫样放电事件表现出更明显的“分段”特征；而当恢复至较低的灌注速率（1 mL/min）并使ACSF液面接近组织表面形成较薄液层时，可重现具有显著强直-阵挛成分的完整放电活动（数据未显示）。本方案中所述的定制记录舱可在1 mL/min流速下实现每分钟3-5次的灌注液更换。因此，即使在相对较低的灌注速率下，脑片的整体供氧状况也得到显著改善，同时仍能保证稳定的记录温度和高信噪比。最重要的是，能够维持细胞外K⁺+ 浓度至生理值。

4AP致痫模型不需要对ACSF的离子成分进行显著修改，例如降低Mg2+或提高K+浓度，其独特优势在于能够保持兴奋性和抑制性突触传递的完整性12，这一点在癫痫研究中尤为重要，因为谷氨酸能和GABA能神经网络在癫痫样同步化过程中发挥着关键作用（参见 7）。本方案所用的4AP-ACSF含有生理浓度的K+（3.25 mM），以及较灌流ACSF略低的Mg2+浓度（1 mM vs 1.3 mM）。该Mg2+浓度仍在大鼠脑脊液中报道的生理范围内，且已被多个实验室采用（例如参见17,18）。就本方案所述目的而言，我们发现这种轻微降低更有利于增强4AP的作用效果。

在先前的研究中，4AP 是在脑片已放置于记录室后才施加的17,18。除非实验人员需要观察 4AP 施加与癫痫样放电模式出现之间的时间潜伏期，否则我们发现这种方法相当耗时，不适合本方案中所述的长时间记录和刺激实验。在 32 °C 条件下用 4AP 预孵育脑片可节省大量实验时间，因为在进行实验的同时，可对其他组织切片进行系列预处理。

脑片的长期存活性有助于长期分析神经网络特性。此外，若实验者希望比较多种刺激方案，脑片对重复电刺激的增强耐受性具有显著优势，因为这些刺激方案必须在同一脑片上进行，以确保统计学的稳健性。在我们的实验中，当测试3种刺激方案时，每种方案均包括一个对照阶段和一个恢复阶段，整个实验可能持续3至5小时。在此背景下，活体MEA定位至关重要，以确保激活正确的神经通路，并通过电刺激抑制而非促进痫性发作。我们开发的用户友好型图形界面（GUI）是一种快速、简便且灵活的工具，可用于定位不同脑区结构的电极。与商业软件不同，即使仅具备基础编程技能，也可添加自定义的MEA布局。图像可在明场下采集，因此任何分辨率良好且适配显微镜的通用相机均可使用。倒置显微镜对于观察微电极相对于脑片的位置至关重要，因为在正置显微镜下，微电极将被组织遮挡于下方。然而，如果实验者需要进行刀切以中断特定神经通路，则建议在倒置显微镜之外另配备体视显微镜。

最后，该方法的另一个优势在于大多数所需工具的组装成本低廉且相对简便，例如定制的记录室和孵育室、温浴装置以及切片固定锚，同时无需使用昂贵的低噪声蠕动泵。

该技术的局限性：

MEA记录无法可视化非常缓慢的脑波， 即，信号中的直流偏移。此类基线偏移有助于癫痫发作放电持续时间的渐近测量，更重要的是，它们对于研究皮层扩布性抑制（一种与癫痫猝死相关的现象）具有重要意义32 在癫痫和偏头痛之间存在共性33).

关于电刺激神经调节，本文所述方案允许进行多次刺激，而不会影响脑片的存活率。我们已成功进行了多达3次、每次20至45分钟的刺激，这与先前研究中报道的结果相似25。尽管脑片可能能够耐受更多次数的刺激或更长时间的刺激方案，但我们在本研究中并未对此进行测试。我们建议将刺激方案的次数限制在3次以内，并避免长时间（≥60分钟）的刺激，因为这可能会对在这些极限条件下维持的脑组织造成显著应激，甚至在撤除刺激后仍无法恢复。

方案中的关键步骤：

影响在与多电极阵列联用的脑片中成功记录和调控癫痫样活动的关键因素有多个。除所使用的啮齿类动物种类和脑片质量外，记录期间的灌流速率以及人工脑脊液（ACSF）流动的动力学特性即在记录室中观察到的活动模式（如层流式与环形）表明，脑片的恢复条件、长期维持状态以及4AP的应用方式是最为关键的步骤。

使用浸没式孵育室时，必须将脑片保存在室温下，以维持脑组织网络活性，并促进通过应用4AP诱导类似痫样放电。据我们观察，在32 °C条件下恢复和维持脑片，会在切片后3 - 4小时内导致脑组织质量下降。

然而，在室温下将脑片孵育于含4AP的ACSF中，再于32 °C进行记录是不可取的。我们发现在此条件下难以观察到稳定的反复性痫样放电。事实上，已有文献报道，在20–24 °C的低温条件下，无论是在体外in vitro34还是在体内in vivo35，均可减弱甚至抑制4AP诱导的痫样活动发生。因此，4AP孵育与记录的温度均应维持在30–34 °C范围内，且两者温度应保持一致。为了避免因4AP诱导神经元过度兴奋，同时脑片又从室温突然暴露于温暖（32 °C）的含4AP-ACSF溶液中，从而对脑组织造成过大应激，至关重要的是需进行一个中间预热步骤，即先将脑片在32 °C的保存型ACSF中孵育20–30分钟，使其适应温度变化。若省略此步骤，可能会影响4AP诱导痫样活动的形成。

另一个需要提及的方面是切片后人工脑脊液（ACSF）中D-葡萄糖浓度的重要性。25 mM的浓度比许多实验室使用的10 mM浓度更能有效维持脑片的活性，同时可使痫性放电的发生率提高一倍（因此，每天在多个脑片上进行一系列长时间的实验方案将更加容易实现）。

最后，需要提及切片过程中的几个重要细节。首先，切勿让完整脑组织和脑切片在低温切割用人工脑脊液（ACSF）中结冰。由于小鼠脑体积较小，将其冷却少于<2 分钟即已足够。切片完成后应立即将组织切片从缓冲托盘转移至室温下的冲洗烧杯中。冲洗掉切割用ACSF非常重要，否则高浓度蔗糖会导致脑切片粘附在孵育室的尼龙网上。为有效冲洗组织，关键在于尽量减少转移移液管中残留的切割用ACSF，以避免过度污染孵育用ACSF。采用两步冲洗法有助于最大限度减少污染。切片程序完成后，应立即将组织切片从冲洗烧杯转移至孵育室中，孵育室内的软质尼龙网半悬浮于孵育用ACSF中，可使切片两侧均得到充分氧合。此原则应在切片后的所有步骤中贯彻执行：脑切片绝不能沉在烧杯底部，不应接触孵育室的侧壁，彼此之间也不应接触或重叠。

修改与故障排除：

人工脑脊液（ACSF）的成分可根据实验者的需要进行调整。例如，可添加药物以分析特定神经递质或离子通道对电神经调节效果的贡献。此外，丙酮酸和抗坏血酸（参见 表2）可以省略，但我们发现它们具有显著的神经保护作用。我们在表3中列出了本方案中可能遇到的最常见问题及其解决方法。

结论：

MEA记录无疑是一种研究健康与疾病状态下神经网络相互作用的宝贵技术。除了药理学研究外，该技术还可用于评估与应用于癫痫及其他神经系统疾病的深部脑刺激（DBS）相关的电神经调节方案。在本实验方案中，我们证明了可以重现典型的周期性刺激实验，其结果与传统的细胞外场电位记录结合外部刺激电极所获得的结果相似。随着商用、操作便捷的设备及先进软件工具的日益普及，MEA记录技术也适用于闭环刺激实验，以提供 特设的 对脑组织进行刺激，并研究反馈机制对神经网络反应的贡献。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

G.P. 是欧洲联盟“地平线2020”框架计划下MSCA-IF-2014项目Re.B.Us（项目编号：660689）资助的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者。GUI地图MEA可向作者ilaria.colombi@iit.it申请免费获取。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚-D-赖氨酸 Sigma-AldrichP7886MEA 包被所需材料
NaClSigma-AldrichS9888化学
KClSigma-AldrichP9541化学
KH2PO4Sigma-Aldrich795488化学
CaCl2*2 H2OSigma-AldrichC3306化学
D-葡萄糖Sigma-AldrichRDD016化学
NaHCO₃3Sigma-AldrichS5761化学
MgCl2*6 H2OSigma-AldrichM2670化学
MgSO₄4*6 H2OSigma-AldrichM5921化学
蔗糖Sigma-AldrichRDD023化学
丙酮酸，98% Sigma-Aldrich107360化学
4-氨基吡啶Sigma-AldrichA78403致惊厥药物
STG-2004多通道系统STG4004-1.6mA4通道电压刺激发生器±8 V）和电流输出（±1.6 mA
MEA1060多通道系统N/AMEA 放大器
平面MEA多通道系统60MEA500/30iR-Ti 无环必须无环状结构，以便使用定制记录室
麦克雷克多通道系统记录软件
McStimulus II多通道系统STG4004 控制软件
TC02多通道系统TC02双通道恒温器
PH01多通道系统PH01加热灌注导管
MPH 多通道系统MPH PH01 磁力架与吸液针
Elastostil E43WackerE43用于将定制记录室固定到微电极阵列上的弹性密封剂
MEA定制腔室Crisel InstrumentSKE-chamber MEA定制记录室
Ag/AgCl 电极，片状，1.0 mm Crisel Instrument64-1309定制记录室的参比电极
TergazymeSigma-AldrichZ273287-1EA酶清洁剂
MATLABThe Mathworks电极标测的编程环境
VT1000SLeica BiosystemsVT1000S振动切片机
Warner Instruments64-1309Ag-AgCl电极颗粒 1.0 mm（E205）。参比电极。

参考文献

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使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动
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