一种用于研究人类T细胞记忆应答的负压水疱实验方案 体内

摘要

在此，我们展示了吸疱皮肤回忆反应模型的操作方法。该模型为研究人类皮肤免疫反应提供了简便的途径 体内 适应性免疫反应，例如在疫苗开发中的应用。

摘要

皮肤抗原回忆模型可用于研究人类记忆免疫应答 体内结合皮肤负压水疱（SB）诱导技术，该模型可获取代表细胞记忆应答的稀有抗原特异性T细胞群体及其细胞因子微环境 原位.

本报告描述了皮肤回忆反应、SB诱导以及抗原特异性T细胞采集的实用操作步骤。为示例该方法，采用结核菌素皮肤试验对先前接种过卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin）以预防结核分枝杆菌感染的个体进行抗原回忆刺激 结核分枝杆菌 最后，提供了SB样本的多重分析和流式细胞术分析示例，表明与从血液中分离的细胞相比，该取样方法可获得较高等比例的抗原特异性多功能CD4+ T细胞。

此处描述的方法安全且侵入性极小，为研究先天性和适应性免疫反应提供了独特的机会 体内并且可能对从事疫苗开发中细胞介导免疫和人类记忆应答研究的广大科研人员具有重要意义。

引言

皮肤水疱（SB）是一种人工诱导产生的水疱，可直接从皮肤中收集细胞和液体。通过负压法诱导形成水疱的技术是皮肤科学领域中广为人知的工具，用于研究健康与疾病状态下的皮肤免疫学^{1,2,3,4,5,6,7,8}本报告展示了SB技术与皮肤抗原回忆反应相结合（SB皮肤回忆法）如何为适应性免疫应答提供直接的洞察 体内.

SB诱导的原理很简单：在皮肤的小面积区域施加轻微负压。负压最终会迫使表皮与真皮分离，形成一个充满液体和细胞的局部水疱^1,2,9。可通过细针穿刺抽吸获取水疱液，其内容物可用于后续体外研究 in vitro。

近年来，SB方法在研究中的应用引起了日益增长的兴趣 体内 除局限于皮肤的疾病外的免疫反应^10,11人类适应性免疫的研究受到一定限制，因为通常只能从外周血中采集目标细胞和细胞因子，而对淋巴结或胃肠道黏膜组织进行侵入性取样可能无法被接受且不符合伦理要求。例如，在疫苗接种后对持久性人类记忆T细胞应答的研究即面临此类限制。¹²在这些试验中，相关T细胞的取样可能面临巨大挑战，因为介导免疫反应的细胞群体主要存在于淋巴组织中，仅有极少量的特异性T细胞在外周血中循环。

SB 技术为研究记忆性 T 细胞及其他特定细胞群体提供了独特的机会。在皮肤接种抗原后，针对该抗原特异的 T 细胞会从其淋巴器官的隐匿部位被募集至皮肤，并可轻易地从 SB 中取样。这种皮肤回忆模型的方法学及其研究应用已由 Akbar 进行描述。 等 2013年²一种常用于皮肤回忆反应的抗原是商业化的结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD），该抗原用于结核菌素皮肤试验（TST）。¹³，其中PPD被注射到皮肤的真皮层。在对PPD具有既往免疫记忆的个体中[例如，具有 结核分枝杆菌 (Mtb）感染或既往接种过卡介苗（BCG）疫苗]，抗原沉积会引发记忆性免疫应答，导致免疫细胞向皮肤迁移并产生 体内 PPD特异性CD4+ T细胞的克隆扩增^2,11,14,15. 因此，大量针对PPD的多功能CD4+ T细胞在皮肤中积聚，可随时用于刮取采样。通过该方法采集的T细胞已被证实具有良好的稳定性，且数量充足，可用于多种免疫学检测以及长期培养研究。 体外 培养¹⁵因此，皮肤回忆模型与SB诱导可能成为研究的有效方法 体内 T细胞反应 离体 分析，加深对这一方法的了解可能使对细胞免疫学和疫苗学感兴趣的研究人员受益。

本报告首次提供了在注射PPD的皮肤区域诱导人皮肤负压水疱的分步操作指南。通过卡介苗（BCG）接种志愿者的结核菌素皮肤试验（TST），展示了皮肤抗原回忆反应模型。最后，相关 离体 通过SB分离的细胞和细胞因子的分析示例. PPD特异性T细胞的表型和功能特征已在其他文献中详尽描述^{2,10,11,16,17,18,19}本报告旨在探讨该方法在实践和免疫学方面的相关问题，以促进其他研究团队更便捷地应用此技术。

方案

以下所述所有方法，包括使用人类志愿者，均已获得丹麦健康研究伦理委员会（H-15002988）和丹麦数据保护机构（jr.nr. 2015-57-0102）的批准。PPD 必须是经认证并获准用于人类的合格产品，并按照制造商提供的正确剂量使用。任何剂量或给药方式的偏差可能需要额外的伦理批准，且志愿者必须签署知情同意书。

1. 结核菌素皮肤试验

1. 从志愿者处获得口头和书面的知情同意。注射前，确保志愿者理解并接受该操作，包括可能的不良反应。
   注意：本方案的纳入标准为年龄 > 18 岁及以上且有记录的卡介苗接种史。纳入标准可能因研究问题而异（即，另一个纳入标准可能是结核菌素皮肤试验（TST）阳性证据。
2. 使用现成的供人用PPD溶液［20结核菌素单位（TU）/mL］。用酒精棉片消毒小瓶的橡胶瓶塞。
3. 准备注射部位
   1. 在志愿者前臂的腹侧定位注射部位。
   2. 将手臂掌心向上平放在平坦表面上，选择前臂上三分之一区域，距离肘关节约5 - 10 cm处。避开瘢痕、静脉或皮肤损伤部位。
   3. 使用酒精棉片对区域进行消毒。
4. 制备PPD溶液
   1. 使用1 mL无菌注射器配27-30G/短针头例如，12 mm）固定针。
   2. 轻轻混匀并吸取0.1 mL PPD溶液，确保无可见气泡。
5. 皮内PPD注射
   注意：此步骤描述了如何进行一次PPD沉积，但在同一手臂上进行多次PPD沉积也是可行的。然而，这可能需要获得特定的伦理批准。
   1. 绷紧皮肤，将针头以5–15°角刺入皮肤，针尖斜面朝上。
   2. 将针尖插入皮肤的真皮层，并确保针尖几乎可透过表皮看到。
   3. 缓慢注射0.1 mL PPD溶液。
      注意：若操作正确，会立即出现一个6 - 10 mm的苍白丘疹，该丘疹约10分钟后消失。
   4. 进行两次或多次注射时，注射位点之间应保持最大间距（5–10 cm），同时与肘部和腕部区域保持适当距离。
      注意：这可以防止皮肤试验反应的潜在重叠，从而确保两个吸力室能够不受干扰地定位。

2. 皮肤反应评估 - 第3天

1. 48 - 72 小时后，观察皮肤反应的大小。测量硬结（肿胀）范围，而非红斑（发红）范围。
2. 用手指触诊硬结区域，然后用圆珠笔标记出硬结的边缘。使用直尺测量硬结的直径，并以毫米为单位记录结果。
   注意：硬结大小的读数可指导选择负压吸引室的孔径直径。

3. 负压水疱诱导——第7天

1. 组装负压吸引装置单元。
   注意：负压吸引装置单元是带有连接腔室的真空泵，用于诱导水疱形成。本演示中使用的装置为定制设备，但此类负压吸引装置也可从商业渠道获得。泵的压力需可在 -20 至 -40 kPa 范围内调节，并能提供稳定可靠的负压。在使用本方法开展实验前，应获得所在地区的伦理审批。
   1. 首先，通过将底部孔板和窗口板与腔室及连接软管组装，完成负压吸引腔室的准备。将腔室连接软管牢固地连接至真空泵。
      注意：腔室应包含一个带孔的底板，用于诱导水疱，该孔应适合与人体皮肤接触；同时应包含一个带观察窗的顶板，以便对水疱形成过程进行可视化监测。
2. 根据皮肤反应的大小确定孔板上孔径的最佳尺寸；孔径越大，形成的水疱也越大。
3. 使用酒精棉片对孔板及受试者的皮肤进行消毒。
4. 将负压吸引腔室固定于皮肤上。
   1. 确保受试者手臂处于舒适放松状态。
   2. 确保负压吸引腔室底板上的孔位于PPD反应区域上方，使皮肤反应的中心部位清晰可见。
   3. 使用绑带松紧适当地固定腔室：当施加负压后，腔室将自然吸附于皮肤并保持位置稳定。
5. 开启负压吸引装置，并将压力调节至 -20 kPa。
6. 30 分钟后，将负压增加至 -25 kPa。
7. 60 分钟后，进一步将负压增加至 -30 kPa。
8. 维持 -30 kPa 的负压，直至水疱完全形成。请注意，本方案中提供的负压值是针对特定定制仪器设定的；在其他设备上应用该方案时，可能需要对压力进行适当调整。
   注意：水疱诱导阶段通常持续 60 至 180 分钟（1 - 3 小时），其中实际水疱形成多发生在最后 30 分钟内。水疱形成过程中常伴有瘙痒感。水疱可表现为单个或多个融合的形态。若发生水疱破裂或出血，建议通过缓慢释放压力的方式终止水疱诱导。
9. 水疱完全形成后，释放负压，并小心地将负压吸引腔室从皮肤上取下，避免水疱破裂。
10. 在水疱周围皮肤区域覆盖柔软敷料，并在水疱上方放置硬质保护帽（例如，取自 50 mL 塑料管的管帽）。
11. 先用非致敏性外科胶带固定保护帽，再用柔软弹性绷带进行包扎加固。
12. 指导受试者在接下来的 12 至 24 小时内避免对水疱区域施加过度的物理压力。

4. 水疱液采集 - 第8天

1. 第8天^th 当天，轻轻移除保护性敷料，并使用皮肤消毒喷雾对水疱进行消毒。
2. 使用一支2 mL无菌注射器和23G针头采集水疱内容物。将针头插入水疱顶部或侧壁，缓慢抽吸液体。避免触碰水疱腔底部，但需确保完全采集所有液体。
3. 在已塌陷的水疱上敷上敷料。
4. 将水疱液转移至无菌管中。记录体积。
5. 使用台式离心机以600 × g离心4分钟，使水疱液沉淀。
6. 将上清液转移至另一管中，并用500 µL细胞培养基重悬细胞沉淀。
   注意：细胞现在可用于计数和进一步分析。上清液可于 -20 至 -80 °C 保存至使用时。

5. 吸疱细胞与液体的分析

注意：本方案不涵盖对皮肤负压水疱获取的细胞和液体进行分析的操作说明。然而，为了在本报告中提供代表性结果，我们进行了细胞内染色流式细胞术和多重分析。以下简要描述了相关方法。

1. 流式细胞术
   1. 取1名卡介苗（BCG）接种志愿者的吸疱液中分离的新鲜细胞，以每份1 × 10⁵个细胞的密度悬浮，加入10 µg/mL PPD进行刺激，并在37 °C、5% CO₂条件下培养。同时设置未刺激细胞组作为平行对照培养。
   2. 取1名卡介苗（BCG）接种志愿者的外周血单个核细胞（PBMCs），以每份1 × 10⁶个细胞的密度悬浮，加入10 µg/mL PPD进行刺激，并在37 °C、5% CO₂条件下培养。同时设置未刺激细胞组作为平行对照培养。
   3. 刺激2小时后，向所有细胞中加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）和莫能菌素（monensin），并在37°C下继续孵育6小时。
   4. 使用以下抗体组合对细胞进行染色：活/死细胞染料-BV510、抗-CD4-AF780、抗-CD3-BV421、抗-CD8-PerCP-Cy5.5、抗-CCR7-PE、抗-CD45RA-BV786、抗-IFN-γ-AF700、抗-TNF-α-PE-Cy7 和抗-IL-2-FITC。
   5. 在PBMC染色组合中设置荧光减一对照（FMO controls）。
   6. 使用流式细胞仪进行流式细胞术分析，并采用相应软件分析结果。
   7. 采用以下设门策略对产生细胞因子的CD3+CD4+CD8-细胞亚群进行设门分析：单细胞群体 - > 活性CD3+细胞 - > CD4+CD8-细胞 - > IFN-γ+、TNF-α+ 或 IL-2+细胞。
   8. 采用以下设门策略对效应记忆T细胞群体进行设门分析：单细胞群体 - > 活性CD3+细胞 - > CD4+CD8-细胞 - > CCR7-CD45RA-细胞。
   9. 使用布尔门控（Boolean gating）方法计算各细胞因子的表达谱型。
2. 细胞因子释放检测
   1. 为展示体内（in vivo）细胞因子释放情况，采用多重分析法（multiplex analysis）检测4名志愿者吸疱液解冻样本中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13的浓度水平。
   2. 为展示来源于吸疱液细胞的体外（ex vivo）细胞因子释放情况，使用1名卡介苗（BCG）接种志愿者的新鲜吸疱细胞及其外周血单个核细胞（PBMCs）进行实验。
   3. 用100个菌落形成单位（CFU）的Mtb H37Rv感染PBMCs和吸疱细胞，并培养4天。
   4. 采用多重分析法检测所有培养上清液中IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13的浓度水平。
   5. 将高于检测计算范围的测量值调整至该检测方法的最高计算限值。

结果

纳入8名健康成年志愿者（中位年龄：30岁，范围：26–43岁），均有记录在案的既往卡介苗（BCG）接种史（距卡介苗接种的中位时间：5.5年，范围：1–30年）。受试者在第3天接受2 TU PPD皮内注射，并进行结核菌素皮肤试验（TST）评估。第7天诱导血清泡（SB），第8天采集血清泡；所有血清泡均使用孔径为10 mm的负压吸引装置产生。其中7名个体在同一手臂同时接种2份独立的PPD制剂，并进行2个平行的血清泡诱导（详见《实验方案》中步骤1.4下方关于多次PPD接种的说明）。第7天采集外周血，通过密度梯度离心法分离血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）。血浆及血清泡液体上清保存于-20 °C。新鲜血清泡细胞（SBCs）采用尼格罗素染色结合显微镜计数。

临床TST反应和SBC产量见图1。TST硬结的中位数大小为10.25 mm（范围：0 - 20 mm），每个水疱的中位细胞数为50,000个（范围：15,000 - 210,000个细胞，水疱数量：15）。两名志愿者在两次TST中均无临床反应，相应的总细胞产量较低，为15,000个细胞/水疱。细胞产量与TST的平均临床反应相关（Spearman's r = 0.643，p = 0.094）。

图1：负压抽吸水疱法获取细胞的数量。（a）本图显示了从TST后第7天形成的水疱中分离出的经尼格里素染色细胞的代表性显微图像。（b）本图显示了8名接种过卡介苗的志愿者中，平均TST硬结直径（mm）与平均细胞收获量（n/水疱）之间的关系（水疱总数 = 15）。每个圆点代表一次个体平均测量值。请注意，有两个圆点重叠，因为有两名志愿者的TST硬结直径均为0 mm，细胞收获量均为15,000。请点击此处查看该图的放大版本。

为展示流式细胞术对SB的表征，从一名43岁志愿者处获取SBCs，该志愿者30年前接种过卡介苗，且无已知的结核分枝杆菌暴露史 Mtb. SBCs 在单个水疱形成后被分离（硬结：1.4 mm/100,000 个 SBCs）。 图2 显示SBCs细胞内细胞因子染色的代表性图谱 与 外周血单个核细胞（PBMCs）。

在此志愿者中，CD3+CD4+CD8- SBCs 的比例从未刺激细胞的 67% 上升至 > 90% 在 PPD 上 体外 再次刺激后，CD3+CD4+CD8- PBMCs 的比例保持不变（约 51%）， 图2。超过92%的 体外 PPD刺激以及未刺激的CD3+CD4+CD8- SBCs均为效应记忆型细胞（CCR7-CD45RA-，数据未显示）。PPD刺激诱导产生的特异性CD3+CD4+CD8-细胞比例在SBCs中高于PBMCs（33.1%） 与0.2%，减去未刺激样本）。在PBMCs中，针对PPD特异性的CD3+CD4+CD8-多能性细胞所占比例均 < 0.05%.

图2：SBCs 的代表性流式细胞术图谱 与 外周血单个核细胞（PBMCs）。 面板 a 和 b 显示 CD8+ 和 CD4+ 群体的代表性密度图a未刺激的 与PPD刺激的PBMCs和（c) SBCs。图示 b 和 d PPD刺激的CD3+CD4+CD8-细胞内细胞因子染色的慢速图谱b) 外周血单个核细胞（PBMCs）和（dSBCs。 请点击此处以查看此图的放大版本。

如预期所示，CD3+CD4+CD8- SBCs 被激活 体内，表现为高比例的细胞染色显示细胞因子上调（12%），主要细胞因子为TNF-α和IFN-γ。然而，在PPD刺激后，分泌细胞因子的细胞群体转向以三重或双重阳性IFN-γ+TNF-α+IL-2+（17%）和IFN-γ+TNF-α+（15%）表型为主（图3b，同一供体的PBMC谱型被纳入以作比较 图3a). 在PPD刺激下，效应记忆CD4+ T细胞亚群（CD3+CD4+CD8-CCR7-CD45RA-）的细胞因子表达谱与图2和图3中所示的CD3+CD4+CD8-细胞群相似（数据未显示）。

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讨论

本文描述了一种研究人类免疫记忆反应的实用方法 体内，通过吸疱法诱导皮肤抗原回忆反应并采集细胞。以结核菌素皮肤试验（TST）为例，展示皮内抗原注射及卡介苗（BCG）疫苗回忆反应。最后，通过流式细胞术和多重细胞因子分析对吸疱样本进行表征，结果表明约三分之一的吸疱细胞为具有效应记忆表型的抗原特异性多功能T细胞。

本方案的关键步骤包括皮内注射技术、负压水疱诱导以及水疱穿刺。首先，正确的皮内注射需要经过培训的专业人员操作，不当的注射可能导致效果不理想。PPD通常是一种广为人知且安全的皮肤抗原，但其成分在不同生产商之间可能存在差异，从而限制了结果的可比性^13,20。本报告提供了单次皮内注射2 TU的指导，也可选择进行两次平行注射（2 × 2 TU），后者可能需要额外的伦理审批。然而，其他研究曾使用10 TU剂量，这会增加出现强烈皮肤反应的可能性^10,21。在负压水疱诱导过程中，逐步小幅增加负压可降低出血和水疱破裂的风险。血液中的红细胞或白细胞污染的可能性通常较低²。无菌穿刺技术可防止微生物污染，避免穿刺针接触真皮层水疱底部则可减少碎屑或常驻皮肤细胞的混入。然而，部分研究人员更倾向于通过对穿刺后的水疱施加滚动压力来收集水疱液¹⁰。必要时可穿刺水疱内部的间隔结构。负压水疱技术本身属于微创操作；塌陷后的水疱可无瘢痕愈合，感染极为罕见²。但可能出现一定程度的色素减退，因此对于有胶样瘢痕病史的个体，应尽量避免使用负压水疱诱导方法。

技术局限性包括细胞总产量较低，因此长期保存的选择有限。白细胞产量、临床TST反应、水疱大小以及红细胞污染之间的关系已在其他文献中得到充分描述^2,10。在本文展示的BCG回忆实验中（图1），每个水疱的细胞中位总产量为50,000个，这意味着使用这些细胞进行的实验规模较小，尤其是当单独研究SBCs时¹⁵。然而，SB样本中的特异性T细胞群体在相对数量和绝对数量上大多超过PBMC样本中的相应细胞。在图2所示的示例中，100,000个SB细胞样本中三重阳性PPD特异性T细胞的数量比来自同一供体的1×10⁶个PBMCs中的数量高出两倍以上（数据未显示）。对TST反应进行视觉评分是评估结核分枝杆菌（M. tuberculosis）免疫记忆最常用的临床方法。需要注意的是，潜在的适应性免疫反应与临床皮肤反应的峰值时间并不一致^2,21。并非所有接种过BCG疫苗或暴露于Mtb的个体都会产生强烈的TST反应，因此在启动使用该方法的回忆试验之前，必须考虑对TST无反应者样本的分类策略和处理方法，以及研究人群中预先存在的分枝杆菌致敏情况。此外，在SB取样和视觉评分过程中，由于全身性或皮肤相关的免疫功能受损（例如在HIV感染和某些年龄组中所见），皮肤反应减弱的个体可能存在理论上的偏倚^2,13,18,20。另外，重复检测会导致TST反应的免疫增强效应是众所周知的现象^20,22。然而，当重复进行TST检测时，SB细胞的表型保持相对稳定¹⁰。这一观察结果支持了SB回忆反应在细胞免疫应答纵向研究中的应用价值。

对于T细胞免疫学家而言，水疱法（SB）回收能够获得高比例的抗原特异性细胞。然而，从PPD沉积部位取样时，水疱采集的时机至关重要，因为细胞组成和细胞因子微环境会随时间发生变化。在本方案中，水疱于PPD攻击后第7天诱导形成，所分离的细胞主要为CD4+效应记忆T细胞，其中包含大量共表达IFN-γ、TNF-α和IL-2的细胞。这些观察结果与先前研究一致，表明T细胞的活化、增殖和分化发生在经PPD致敏的皮肤中^2,15,21。在PPD致敏个体中的动力学水疱研究表明，皮肤的早期反应是非特异性的；但在PPD攻击后的最初几天内，反应迅速转为以CD4+ T细胞为主（已有研究报道包括中枢记忆和效应记忆表型），且在第3天后，反应主要由高比例的PPD特异性细胞因子分泌型CD4+ T细胞主导^2,8,10,15,21。这种适应性细胞因子反应可在皮肤中持续检测超过2周^2,8,10,23。结核菌素皮肤试验（TST）后第7天似乎是收集细胞因子分泌型记忆CD4+ T细胞的最佳时间点²。然而，具体最佳时间点可能因所研究的抗原及免疫反应类型而异。值得注意的是，有研究报道适应性PPD反应的峰值可能略早，在TST后第5天时促炎性细胞因子的分泌已开始下降¹⁰。

SB 液体中含有高水平的促炎性细胞因子及其他可代表皮肤微环境的蛋白质^15,24动力学研究表明，SB 液中 TNF-α 和 IFN-γ 水平在 3 天后达到峰值，而 IL-2 水平在 7 天后达到峰值^2,10，可能反映了在此后期阶段适应性反应占主导地位。由于SB细胞已被激活 体内，它们表现出较高的自发性细胞因子释放，以及在再次刺激后特异性释放的潜力（图3 和 4).

本报告聚焦于CD4+ T细胞免疫。如图2所示，分离出的T细胞绝大多数为CD4+，而吸疱液中几乎检测不到CD8+ T细胞。这与其他关于吸疱法PPD回忆反应的研究结果一致，这些研究均报道CD8+ T细胞的比例较低，且迁移能力较CD4+ T细胞更弱^2,8,10,23。进一步表征CD8+ T细胞的贡献将更有助于理解其作用；然而，这超出了本报告的范围。

T细胞被认为在Mtb的免疫控制中起关键作用；然而，目前尚难以确定血液中适应性免疫反应所反映的保护效果的可靠相关指标^25,26。这一障碍严重阻碍了新型结核病疫苗的研发，因为目前尚无替代大规模且极其昂贵的有效性试验的可行方案²⁷。结核病疫苗研发人员通常通过评估血液中疫苗特异性T细胞群体的微小且短暂的变化来判断疫苗的免疫原性^28,29。然而，血液中所检测到的循环抗原特异性T细胞的微小比例是否具有生物学意义仍存疑问（即，能否迁移至感染部位，并代表控制Mtb的富含T细胞的微环境）^27,30,31。

根据以往的研究及本文提供的数据，SB皮肤回忆模型在研究疫苗特异性T细胞方面具有尚未开发的潜力。该模型不仅能够唤起数十年前产生的疫苗免疫应答，还可在组织特异性的背景下评估真正的记忆潜能^15,18,19,21。新型特异性皮肤试验（包括由候选亚单位结核疫苗抗原组成的抗原）提示，利用该模型进行疫苗评估具有新的前景^28,32。此外，转录组学分析表明，在PPD刺激的皮肤中产生的细胞介导免疫应答与Mtb感染肺组织中观察到的免疫应答相似¹⁸。

虽然皮肤钻孔活检也可从皮肤中获取细胞，并提供空间信息，但与SB取样相比，该方法更具侵入性，且需要通过酶解或机械处理来制备单细胞悬液³³。两种方法在细胞因子和细胞标志物的检测结果上具有可比性^2,10。

除了皮肤病学领域外，抽吸水疱法已单独或联合全身性或局部皮肤激发试验应用于医学研究的多个领域。例如脓毒症、EB病毒相关性淋巴组织增生性疾病、糖尿病性神经病变、糖皮质激素摄入效应的研究，以及用于测试治疗性抗体或T细胞靶向治疗模型的人体试验^{10,34,35,36,37,38}。

从治疗学角度来看，SB皮肤回忆法在研究中枢T细胞记忆潜能方面具有独特优势；并且从生物学和技术角度来看，皮肤似乎提供了一个相关的取样区室^{2,15,18,19,21}。特别是与传统的被动采集循环PBMCs方法相比，SB皮肤回忆法能够研究那些已证明可在相应抗原刺激下从淋巴结迁移出来，并在组织特异性的体内环境中完成局部扩增和分化的T细胞^15,18,19,21。

总之，本文展示的模型可能对人类适应性免疫及T细胞靶向制剂领域的研究人员具有重要意义即，在传染病疫苗学或癌症研究领域）。本方案中采用的TST模型当然在结核病疫苗学领域具有特殊相关性。然而，该模型的基本概念在其他研究领域也具有广泛的应用价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验室用手套	Imtex, Denmark	1013
消毒喷雾	Apotek, Denmark		含甘油的82%酒精，适用于人体皮肤
酒精棉片	Mediq, Denmark	1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml)	AJ Vaccines
带固定针头的Myjector注射器	Terumo	A236	1 ml/29G/12mm
直尺	不适用		用于皮肤反应评估
圆珠笔	不适用		用于皮肤反应评估
便携式肺部吸引装置	Laerdal Medical, Denmark	78000011	注意：  由Hvidovre医院技术部门改装，适用于-40kPa以下压力范围，并配备压力表 （货号1031107）
未加热负压室组件，带连接管路	Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
孔板，47mm，10mm孔径	Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
负压仪器密封套件	Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
负压室绑带	Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA		12英寸
Micropore外科胶带	3M	1533-1	2.5cm x 9.1m
15ml塑料管盖	Sarstedt, Germany	62,547,254
Tubigrip弹性绷带	Mölnlycke Health Care, Sweden	1443
Cosmopor无菌粘性敷料	Hartmann	9008337	7.2 x 5 cm
2ml 同轴鲁尔滑动注射器	Becton Dickinson	300185
Microlance 23G/30mm针头	Becton Dickinson	300700
Safe-Lock微量离心管（已高压灭菌）	Eppendorf	0030120086	已高压灭菌
Minispin plus离心机	Eppendorf	5453000011
Gibco AIM V培养基	Life Technologies	12055-091