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方法文章

腺相关病毒介导的 CRISPR 心脏基因编辑在小鼠中的应用

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DOI：

10.3791/57560

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2018年8月2日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program, Ohio State University Wexner Medical Center

本文内容

摘要

在此，我们提供了一项详细的实验方案，用于执行 体内 利用重组腺相关病毒（rAAV）介导的CRISPR递送系统在小鼠中进行心脏基因编辑。该方案为治疗杜氏肌营养不良症相关的心肌病提供了一种有前景的治疗策略，也可用于在出生后小鼠中构建心脏特异性的基因敲除模型。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统极大地促进了多种物种的培养细胞及活体生物的基因组编辑。CRISPR 技术还被探索用于多种人类疾病的新型治疗手段。概念验证数据令人鼓舞，例如近期研究利用小鼠模型证明了基于基因编辑的治疗策略在杜氏肌营养不良症（DMD）中的可行性和有效性。特别是，通过静脉注射和腹腔注射重组腺相关病毒血清型 rh.74（rAAVrh.74），可实现将编辑工具高效递送至心脏 金黄色葡萄球菌 CRISPR 相关蛋白 9（SaCas9）及两种引导 RNA（gRNA），用于删除小鼠 23 号外显子中带有突变密码子的基因组区域 Dmd 基因。当gRNA被设计为靶向目的基因的编码区时，该方法也可用于敲除目的基因，并研究其在出生后小鼠中的心脏功能。在本方案中，我们详细展示了如何构建rAAVrh.74-CRISPR载体，以及如何在新生小鼠中实现高效的心脏递送。

引言

成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）技术代表了基因组编辑领域的最新进展，彻底改变了细胞和生物体遗传学研究的现状。基于CRISPR的基因组编辑利用单导向RNA（gRNA）引导CRISPR相关内切酶（如CRISPR相关蛋白9（Cas9）和Cpf1）靶向基因组DNA上的特定序列，该序列与gRNA编码的原间隔序列互补，并在其侧翼含特定的原间隔序列邻近基序（PAM）1,2。PAM序列因Cas9或Cpf1基因来源的细菌种类不同而有所差异。目前最常用的Cas9核酸酶来源于Streptococcus pyogenes（SpCas9），其识别的PAM序列为NGG，位于基因组DNA靶序列下游的非靶链上。在靶位点处，Cas9和Cpf1蛋白会引发双链断裂（DSB），随后通过细胞固有的DNA修复机制进行修复，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）通路3,4。在缺乏同源重组模板的情况下，DSB主要通过易错的NHEJ通路修复，可能导致核苷酸的插入或缺失（indels），若DSB发生在基因的编码区，则可能引起移码突变5,6。因此，CRISPR系统已被广泛用于在多种细胞模型和完整生物体中构建功能缺失型突变，以研究基因功能。此外，催化失活的Cas9和Cpf1已被开发用于在转录水平和表观遗传水平调控靶基因的表达7,8。

最近，SpCas9 和 SaCas9（源自Staphylococcus aureus）已被包装到重组腺相关病毒（rAAV）载体中，用于在人类疾病动物模型中进行出生后的基因校正，尤其是杜氏肌营养不良症（DMD）9,10,11,12,13,14,15。DMD 是一种由DMD基因突变引起的致命性X连锁隐性遗传病，该基因编码抗肌萎缩蛋白16,17，根据新生儿筛查数据，其发病率约为每3500名男性新生儿中有一例18,19。该病以进行性肌肉无力和萎缩为特征。DMD 患者通常在10至12岁之间丧失行走能力，并在20至30岁之间因呼吸和/或心脏衰竭而死亡20。值得注意的是，超过>90% 的 DMD 患者会出现心肌病，且心肌病是 DMD 患者死亡的主要原因21,22。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）已批准使用Deflazacort（一种抗炎药物）和Eteplirsen（一种用于跳过第51号外显子的外显子跳跃药物）治疗 DMD23,24，但这些治疗方法均无法在基因组DNA水平上纠正遗传缺陷。携带抗肌萎缩蛋白基因第23号外显子点突变的 mdx 小鼠已被广泛用作 DMD 的动物模型25。此外，我们先前已证明，通过肌肉内注射 Ad-SpCas9/gRNA 可在mdx小鼠骨骼肌中实现包含第21、22和23号外显子的基因组DNA的框内缺失，从而恢复功能性抗肌萎缩蛋白的表达9；而通过静脉和腹腔注射 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 可在mdx/utrophin+/-小鼠的心肌中实现同样效果26。

在本实验方案中，我们详细描述了使用rAAVrh.74-SaCas9/gRNA载体对mdx/utrophin+/-小鼠进行出生后心脏基因编辑以恢复心肌组织中抗肌萎缩蛋白的每一个步骤，包括gRNA设计及心肌切片中抗肌萎缩蛋白的分析。

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方案

本方案中使用的动物饲养于俄亥俄州立大学实验动物资源中心，符合动物使用指南的要求。所有动物实验均经俄亥俄州立大学机构动物护理、使用与审查委员会批准。

1. 将gRNA设计并克隆至CRISPR载体

  1. 选择两个靶向 dystrophin 基因第20内含子和第23内含子（i20 和 i23）的 gRNA，用于 SaCas9：i20：5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 以及 i23：5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT （PAM序列已用下划线标出并以斜体显示）。
    注意：i20 和 i23 的靶位点相距约 23 千碱基对（kbp）。为破坏一个编码基因，建议使用两个靶向共有外显子的 gRNA，其 PAM 序列为 SaCas9 识别的 NNGRRT（优先选择 NNGAAT、NNGGGT 和 NNGAGT），且两个靶点间距在 20 kbp 以内。
  2. 使用以下PCR参数在1×退火缓冲液（5×退火缓冲液储备液含0.5 mol/L K-乙酸盐、150 mmol/L HEPES-KOH、10 mmol/L Mg-乙酸盐，pH 7.4）中退火gRNA寡核苷酸（100 µmol/L）：95 °C 10 min，90个循环的95至59 °C，每循环降低0.4 °C，持续20 s；90个循环的59至32 °C，每循环降低0.3 °C，持续20 s；20个循环的32至26 °C，每循环降低0.3 °C，持续20 s。
  3. 将退火后的gRNA寡核苷酸与pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA通过BsaI和T4 DNA连接酶在单一体系中进行连接反应（1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA，1 µL退火寡核苷酸，1.5 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液，0.5 µL T4 DNA连接酶，1 µL BsaI，10 µL ddH₂O）2O)，在PCR仪中设置以下反应条件：5个循环的[37 °C 5分钟和16 °C 10分钟]；37 °C 20分钟；80 °C 5分钟。
  4. 将15 µL连接产物转化至30 µL感受态细胞中，涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的琼脂平板，37 °C培养24 h。
  5. 挑取5-10个菌落，接种于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37 °C、250 rpm条件下于摇床培养箱中培养3-4小时。
  6. 通过PCR筛选菌落：10 µL 2x PCR预混液，8 µL ddH₂O2O，1 µL 大肠杆菌培养物，1 µL 10 µmol/L U6-正向引物，1 µL i20 或 i23 gRNA 反向引物。PCR 扩增循环参数：95 °C 预变性 5 分钟，35 个循环（95 °C 变性 30 秒，61 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒）。
  7. 将阳性克隆接种于含100 µg/mL氨苄青霉素的4 mL新鲜LB培养基中，总体积为5 mL，于37 °C、250 rpm条件下过夜培养。
  8. 使用相应的质粒提取试剂盒纯化质粒DNA，并利用U6-forward引物通过Sanger测序验证质粒。
  9. 在DMEM培养基中培养C2C12细胞，添加10% FBS和1%青霉素-链霉素，待细胞融合度达到约70%时，用于检测质粒的基因编辑效率。
  10. 将5 µg SaCas9/gRNA质粒混合物（摩尔比1:1）电穿孔转入1 x 10⁶个细胞中6 C2C12 细胞按照制造商的说明书进行操作。
  11. 转染48小时后，收集C2C12细胞并提取基因组DNA。
  12. 以100 ng基因组DNA为模板，进行小鼠dystrophin基因位点的PCR扩增：上游引物5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA（1 µL，10 µmol/L），下游引物5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA（1 µL，10 µmol/L），10 µL 2x绿色PCR预混液，7 µL ddH2O，1 µL基因组DNA（100 ng）。PCR扩增程序为：95 °C预变性5 min，35个循环的[95 °C 30 s，61 °C 30 s，72 °C 30 s]，最后72 °C延伸2 min。

2. rAAV 的制备

  1. 细胞培养时，将AD293细胞接种至20至40个15 cm培养皿中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen-Strep）的DMEM培养基，在细胞融合度达到约90%时进行转染。
  2. 每皿用200 µL低血清培养基稀释以下3种质粒：1）10 µg pHelper；2）5 µg pXR（rh.74或其他血清型）；3）pX601-i20与pX601-i23混合质粒共5 µg（1:1比例）。加入80 µL聚乙烯亚胺（PEI）进行转染，室温孵育10分钟，然后逐滴加入AD293细胞培养物中。
  3. 转染72小时后，进行腺相关病毒（AAV）的生产，使用细胞刮收集培养基和AD293细胞沉淀，于1100 × g离心10分钟。
  4. 将细胞沉淀重悬于15 mL rAAV裂解缓冲液（50 mmol/L Tris碱，150 mmol/L NaCl，pH 8.5）中，随后进行3次冻融循环（交替置于液氮和42 °C水浴中）。若不立即处理，可将细胞裂解物储存于-80 °C备用。
  5. 用0.45 µm滤膜过滤培养基，加入含2.5 mol/L NaCl的40% PEG8000，使PEG终浓度为8%。4 °C孵育1小时，然后于1100 × g离心15分钟。
  6. 将沉淀重悬于rAAV裂解缓冲液中，并与步骤2.3获得的细胞裂解物合并，加入苯并核酸酶（50 U/mL），37 °C处理1小时。
  7. 将经苯并核酸酶处理的含rAAV混合物于4 °C、1100 × g离心15分钟，保留上清液（即粗制rAAV制备物）。

3. rAAV 的纯化与浓缩

  1. 将粗制的rAAV样品按以下顺序从上到下加入超速离心管中的碘克沙醇梯度：粗制AAV裂解液（约15 mL）、8 mL 15% 碘克沙醇、6 mL 25% 碘克沙醇、5 mL 40% 碘克沙醇、5 mL 58% 碘克沙醇。用1x DPBS补满离心管至顶部，填满剩余空余体积。
  2. 在10 °C条件下，以230,000 × g的转速使用超速离心转子离心120分钟，随后用18号针头收集含有rAAV颗粒的40%梯度层，体积为3–4 mL。
  3. 用1x DPBS稀释rAAV颗粒，并使用离心过滤装置（截留分子量100 kDa）进行离心浓缩。重复此步骤3–5次，最终将rAAV样品浓缩至300–500 µL。

4. rAAV 滴度测定

  1. 从2 µL浓缩的rAAV中提取基因组DNA，用乙醇中的3 M NaOAc沉淀，并重悬于20 µL ddH2O中。
  2. 通过pX601质粒的系列稀释获得rAAV定量的标准曲线：每个10 µL ddH2O中分别含有1 × 109、1 × 108、 1 × 107、1 × 106、1 × 105 拷贝。将经DNA酶处理的rAAV样品按1:10、1:50、1:100和1:1000稀释。
  3. 使用实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒，在实时PCR系统中按照制造商说明书进行qPCR以测定rAAV滴度：每反应加入1 µL 10 µmol/L的正向引物（5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC）和反向引物（5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC）、5 µL 2× PCR预混液、1 µL稀释后的rAAV样品以及2 µL ddH2O。运行以下扩增程序：95 °C 3分钟，随后进行45个循环的[95 °C 5秒和61 °C 20秒]。

5. 新生 mdx/utrophin+/- 小鼠尾静脉和腹腔注射 rAAVrh.74-CRISPR

  1. 将3日龄的mdx/utrophin+/-小鼠幼崽置于冰上1分钟以固定，随后通过眶后注射或腹腔注射途径，每只小鼠全身给予1 × 1012个病毒颗粒，体积为50 µL。
  2. 让小鼠恢复后放回原笼具中。在rAAV给药十周后，通过CO2暴露处死小鼠以收集组织。
  3. 迅速冷冻组织用于基因组DNA和RNA提取；对于需要进行冷冻切片的组织，使用液氮冷却的异戊烷冷冻，并包埋于最佳切割温度化合物中。

6. 目标基因编辑结果的分析

  1. 基因组DNA PCR分析
    1. 从经rAAV处理或未处理的mdx/utrophin+/-小鼠的心脏组织中分离总基因组DNA。
    2. 使用步骤1.12中的相同方案进行PCR分析。
  2. dystrophin表达的RT-PCR分析
    1. 按照试剂盒制造商的操作手册，使用RNA提取试剂盒从心脏组织中提取总RNA。
    2. 进行逆转录反应时，先用无RNase的DNase预处理总RNA，并以5 µg处理后的RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。
    3. 将逆转录产物用于dystrophin表达的RT-PCR分析，所用dystrophin cDNA引物序列为：5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 和 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC。
  3. 通过qPCR分析评估基因编辑效率
    1. 采用定量RT-PCR检测包含外显子22的转录本减少情况，以评估基因编辑效率。上游引物（外显子21）序列：5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA，下游引物（外显子23）序列：5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT。以Gapdh作为参考基因，其上游引物序列为：5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC，下游引物序列为：5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT。
    2. 按照制造商说明书，在实时荧光定量PCR系统中使用qPCR试剂盒进行定量实时PCR（qPCR），反应条件为两步法：95 °C 3 min，随后45个循环（95 °C 5 sec，61 °C 30 sec）。
  4. 免疫荧光染色分析dystrophin表达
    1. 使用冷冻切片机将冷冻组织切成10 µm厚度，室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。
    2. 用PBS洗涤两次，加入封闭液（10%马血清）室温孵育1小时。
    3. 加入抗dystrophin一抗，4 °C孵育过夜。
    4. 用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加入荧光标记的二抗（1:500稀释），室温孵育1小时。
    5. 使用含DAPI的封片剂封片，并用倒置共聚焦显微镜成像。

7. 通过T7E1检测法进行脱靶分析

  1. 使用在线 CRISPR 设计工具（如 <http://crispr.mit.edu>）预测潜在的脱靶位点。
  2. 通过 PCR 扩增覆盖前 5–10 个潜在脱靶位点的基因组区域：200 ng 基因组 DNA，1 µL 高保真 DNA 聚合酶，5 µL 10x PCR 缓冲液混合物，1.5 µL 10 µmol/L 的位点特异性正向和反向引物，用 ddH2O 调整体积至 50 µL。
  3. 将 PCR 产物进行电泳，使用凝胶回收试剂盒提取并纯化 DNA，用分光光度计测定浓度。
  4. 在 Buffer 2.1 中通过 PCR 仪缓慢变性并重新退火纯化的扩增子，以促进异源双链的形成。循环条件与步骤 1.2 中所述相同。
  5. 用 0.5 µL T7E1 酶在 37 °C 下消化重退火产物 30 分钟，并通过 1–2% 琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。
    注意：扩增子也可通过靶向深度测序进行分析。

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结果

在将gRNAs包装入rAAV用于体内研究之前，应先在细胞培养中评估其诱导靶向基因组DNA区域缺失的效率。为此，将gRNAs与表达SaCas9的载体通过电穿孔法转入C2C12细胞，并利用跨越靶位点的引物通过PCR分析基因组DNA图1PCR产物约为500 bp表明目标基因组DNA已被成功删除，这是基因编辑成功的标志；而对照细胞由于基因组DNA片段较大，不应产生扩增条带。

在细胞培养中确认gRNA的有效性后，可利用三质粒共转染AAV293细胞的方法，将gRNA包装至rAAVrh.74或其他血清型（如AAV6、AAV8或AAV9，这些血清型均表现出高效的心脏基因递送能力）中。我们发现，无需分别为两种gRNA制备两个独立的rAAV，而是将两种gRNA载体以等摩尔比例混合，制备单一的rAAV制剂。rAAV病毒颗粒通过密度梯度超速离心法进行纯化，并通过SDS-PAGE分析其纯度。高度纯化的rAAV制剂在SD...

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讨论

在本方案中，我们详细说明了实现所需目标的全部必要步骤 体内 利用rAAVrh.74介导SaCas9和两条gRNA递送系统对出生后小鼠进行心脏基因编辑。如前所述，该方法可用于恢复肌营养不良小鼠中抗肌萎缩蛋白的表达，具体操作详见我们的研究工作27但也可实现对小鼠心脏相关基因的快速反向遗传学研究，而无需经历传统基因敲除方法中生成和繁育基因敲除小鼠模型的漫长过程。

为了在目标组织中实现高效的基因编辑，需注意以下几个关键步骤：1）需使用适当的细胞系验证SaCas9/gRNA诱导靶向基因组DNA缺失的有效性；2）选择能够介导高水平基因转导至目标组织的合适AAV血清型至关重要；3）确定AAV载体向目标组织进行基因转移的最佳递送途径。

在本方案中，设计的 SaCas9/gRNA 被包装到 AAVrh.74 中，而非先前报道的 AAV8 和 AAV9，用于编辑 Dmd 基因12,

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致谢

R.H. 获得美国国立卫生研究院基金（R01HL116546 和 R01 AR064241）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 555 山羊抗兔 IgGThermo Fisher ScientificA-21428
苯并核酸酶（Benzonase Nuclease）Sigma-AldrichE1014
生物安全柜Thermo Fisher Scientific13471300 系列 A2 型 II 级生物安全柜
BsaINew England BioLabs IncRO535S
感受态细胞Agilent Technologies200314
细胞培养皿，150 mmNest Scientific USA715001
冷冻切片机Leica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
抗肌萎缩蛋白抗体（Dystrophin antibody）Spring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi 质粒提取试剂盒IBI ScientificIB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
滤器单元，0.45μmThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq 预混液PromegaM7122
高容量质粒小量提取试剂盒IBI ScientificIB47102
马血清Abcamab139501
Isotemp 2239 水浴锅Thermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp 加热块Thermo Fisher Scientific11-718
倒置共聚焦显微镜Carl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 仪Roche5015243001LightCycler 480 Instrument II
大容量离心机Thermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
微量离心机Thermo Fisher Scientific75002445Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop 分光光度计Thermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop™ 2000/2000c
i20-F 引物Integrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
i20-R 引物Integrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
i23-F 引物Integrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
i23-R 引物Integrated DNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
引物（Oligos）Integrated DNA Technologies
OptiPrep 密度梯度介质Sigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
聚乙烯亚胺（Polyethylenimine）Polysciences23966
蛋白酶 K（Proteinase K）Sigma-AldrichP2308
Quick-Seal 离心管Beckman Coulter Inc342414
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR 试剂盒Alkali ScientificQS2005
RevertAid RT 反转录试剂盒Thermo Fisher ScientificK1691
转子Beckman Coulter Inc33792270Ti 型
T4 DNA 连接酶New England BioLabs IncM0202S
PCR 仪Bio-rad1861096
TRIzol 试剂Thermo Fisher Scientific15596026
超速离心机Beckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
超滤离心管MilliporeSigmaUFC510096
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂Vector Laboratories, IncH-1200

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