探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

摘要

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。

摘要

植物宿主与其相关微生物之间的密切互作在决定植物适应性方面至关重要，并可促进植物对非生物胁迫和病害的耐受性提升。由于植物微生物组可能具有高度复杂性，通常优先选用低成本、高通量的方法（如基于扩增子的16S rRNA基因测序）来表征其微生物组成与多样性。然而，在开展此类实验时，选择合适的方法学对于减少可能影响样本间及研究间分析与比较的偏差至关重要。本方案详细描述了一种从土壤、根际和根组织样本中收集和提取DNA的标准化方法。此外，我们介绍了一个经过充分验证的16S rRNA扩增子测序流程，可用于探究这些样本中细菌群落的组成，并可轻松适配于其他标记基因。该流程已成功应用于多种植物物种，包括高粱、玉米、小麦、草莓和龙舌兰，且有助于克服植物细胞器DNA污染带来的问题。

引言

与植物相关的微生物组由动态且复杂的微生物群落组成，包括细菌、古菌、病毒、真菌以及其他真核微生物。除了在引发植物病害方面已被广泛研究的作用外，与植物相关的微生物还能通过提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性、促进养分有效性以及通过产生植物激素来增强植物生长，从而对植物健康产生积极影响。因此，人们特别关注定殖于植物根内生境、根际以及周围土壤中的微生物类群。尽管部分微生物可在实验室培养基上单独培养，但许多微生物无法实现体外培养，部分原因在于它们可能依赖于与其他微生物的共生关系、生长极为缓慢，或需要实验室环境中难以复制的特定条件。由于基于测序的环境与宿主相关微生物样本系统发育分析无需依赖培养，且具有成本较低、通量较高的优势，已成为研究微生物群落结构的首选方法。

选择适当的测序技术取决于用户需求，这些技术由多种新一代测序（NGS）平台提供¹，关键因素包括：所需的覆盖度、扩增子长度、预期的群落多样性，以及测序错误率、读长和每运行/每兆碱基的成本。在基于扩增子的测序实验中，另一个需要考虑的变量是选择扩增哪个基因以及使用哪些引物。在设计或选择引物时，研究人员通常不得不在扩增的通用性与从所得扩增子中获得的分类学分辨率之间进行权衡。因此，这类研究通常会选择能够选择性靶向微生物组特定子集的引物和标记基因。评估细菌群落组成通常通过测序细菌16S rRNA基因的一个或多个高变区来实现^2,<....

方案

1. 根内菌群、根际及土壤样品的采集与分离

1. 进入野外前，将超纯水（每份样品至少 90 mL）进行高压灭菌以实现消毒。通过向 1 L 无菌水中加入 6.75 g KH₂PO₄、8.75 g K₂HPO₄ 和 1 mL Triton X-100，配制附生生物去除缓冲液（每份样品至少 25 mL）。使用孔径为 0.2 µm 的真空滤器对缓冲液进行灭菌。
   1. 在执行步骤 1.2 至 1.5 时，始终佩戴经乙醇灭菌的洁净手套，并在处理每份样品之间更换手套，以防止污染。所有设备均需用 70% 乙醇灭菌，并在样品间擦拭清洁。采样前，确定实验所需的最优采样深度，并在所有土壤和根系采集过程中保持一致。
2. 采集散装土壤样品时，使用经乙醇灭菌的土壤钻取器，从植株基部约 23 至 30 cm 处采集不含植物根系的土壤。
3. 将土壤转移至塑料袋中，轻轻振荡使其均质化，然后取一份土壤样品（约 600 mg）装入一个 2 mL 离心管中。立即将该 2 mL 管置于干冰上，或在液氮（N₂）中快速冷冻，直至准备进行 DNA 提取（步骤 2）。
   1. 在某些环境中，周围土壤可能含有植物材料。此时，在将土壤放入塑料袋前，应使用经灭菌的 2 mm 筛网将植物残渣与土壤分离。
4. 为采集根系及根际样....

结果

执行推荐的实验方案后，应获得一组带有索引的双端测序数据，这些数据可回溯至各个样本，并根据下游分析方法被归类为细菌可操作分类单元（OTU）或精确序列变体（ESV，也称为扩增子序列变体（ASV）和亚可操作分类单元（sOTU））。为了获得高质量的序列数据，在样本处理和文库构建的每一步都必须注意保持样本间的一致性，并尽量减少任何潜在偏差的引入。在完成样本采集、处理及DNA提取（步骤1和步骤2）后，所得洗脱液应呈透明状态，不含可能抑制扩增反应的有机污染物。虽然可通过微量分光光度计测定各DNA样本的纯度，但我们发现土壤DNA提取试剂盒能够可靠地去除所有污染物。由于DNA质量具有可预测性，因此相较于基于紫外吸收的定量方法，使用特异性结合DNA的荧光染料进行定量更为合适^19,20,21。在PCR扩增前，土壤和根际样本的DNA浓度平均约为10 ng/µL，而根组织样本的平均浓度通常约为30 ng/µL（<.......

讨论

本方案展示了一条从田间取样到样品处理及后续测序的成熟流程，用于研究根内生圈、根际及土壤微生物群落组成。研究根际相关微生物组面临独特挑战，部分原因在于土壤取样的固有困难。土壤在物理和化学性质上具有高度变异性，不同土壤条件之间的距离可能仅有几毫米^28,29。这可能导致从相邻取样点采集的样品在微生物群落组成和活性方面存在显著差异^30,31。因此，在DNA提取前使用土壤钻取器和铲子以保持取样深度一致并进行均质化处理，对于根微生物组研究的可重复性至关重要。高效分离根际与根组织组分同样关键；采用过于剧烈的根表面灭菌方法可能在DNA提取前导致根内内生菌裂解，而过于温和的冲洗则可能无法完全去除根表面附着的微生物⁷。另一个可能对测序结果产生负面影响或造成干扰的因素是细菌污染，污染来源多样，有时难以与环境样品中的目标细菌区分³²<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1-10/20 µL 过滤吸头	USA Scientific	1120-3810	可替换为其他供应商的等效产品。
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5510	可替换为其他供应商的等效产品。
10 µ多通道移液器	Eppendorf	3122000027	可替换为其他供应商的等效产品。
10 µ升，100 µL，和1000 µL 微量移液器	Eppendorf	3120000909	可替换为其他供应商的等效产品。
100 µ多通道移液器	Eppendorf	3122000043	可替换为其他供应商的等效产品。
1000 µL 过滤型微量移液器吸头	USA Scientific	1122-1830	可替换为其他供应商的等效产品。
2 mL 微量离心管	USA Scientific	1620-2700	可替换为其他供应商的等效产品。
2 mm 土壤筛	林业供应商	60141009	可替换为其他供应商的等效产品。
200 µL 过滤型微量移液器吸头	USA Scientific	1120-8810	可替换为其他供应商的等效产品。
25 mL 储液槽	VWR International LLC	89094-664	可替换为其他供应商的等效产品。
50 mL 锥形瓶	Thermo Fisher Scientific	352098	可替换为其他供应商的等效产品。
500 mL 真空滤器（0.2 µm 孔径）	VWR International LLC	156-4020
96孔微孔板	USA Scientific	655900
96孔PCR板	BioRad	HSP9631
Agencourt AMPure XP 磁珠	赛默飞世尔科技	NC9933872	使用说明： https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf
铝箔	木板路	7124	可使用其他供应商的等效产品替代。
分析天平，精度为 0.001 g	Ohaus Pioneer	PA323	可替换为其他供应商的等效产品。
Bioruptor Plus 超声波破碎仪	Diagenode	B01020001
牛血清白蛋白（BSA）20 mg/mL	New England Biolabs	B9000S
离心	Eppendorf	5811000908	包括50 mL和96孔板桶适配器
低温手套	Millipore Sigma	Z183490	可替换为其他供应商的等效产品。
DNeasy PowerClean 试剂盒（可选）	Qiagen Inc.	12877-50	先前的 MoBio
DNeasy PowerSoil 试剂盒	Qiagen 公司	12888-100	先前的 MoBio
干冰	任何	NA
DynaMag-2 磁力架	赛默飞世尔科技	12321D	请勿替换
乙醇	VWR International LLC	89125-188	可替换为其他供应商的等效产品。
加仑尺寸冷冻袋	Ziploc	NA	可替换为其他供应商的等效产品。
Gemini EM 微孔板读板仪	Molecular Devices	EM	可使用另一种从顶部读取96孔板的荧光计。
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
实验服	Workrite	J1367	可替换为其他供应商的等效产品。
液氮2	任何	NA	可替换为其他供应商的等效产品。
液氮2 杜瓦瓶	Thermo Fisher Scientific	4150-9000	可替换为其他供应商的等效产品。
Milli-Q超纯水净化系统	Millipore Sigma	SYNS0R0WW
微型离心机	Eppendorf	5404000014
分子级水	Thermo Fisher Scientific	4387937	可替换为其他供应商的等效产品。
研钵	VWR International LLC	89038-150	可替换为其他供应商的等效产品。
腈基手套	赛默飞世尔科技	19167032B	可替换为其他供应商的等效产品。
纸巾	VWR International LLC	BWK6212	可替换为其他供应商的等效产品。
PCR板封膜	Thermo Fisher Scientific	NC9684493
PCR条形管	USA Scientific	1402-2700
研钵	VWR International LLC	89038-166	可替换为其他供应商的等效产品。
塑料刮勺	LevGo, Inc.	17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)	Thermo Fisher Scientific	13000014
PNA - 叶绿体和线粒体	PNA Bio	NA	务必通过生物信息学方法对序列进行验证
防护眼镜	Millipore Sigma	Z759015	可替换为其他供应商的等效产品。
Qubit 3.0 荧光仪	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32854
橡胶锤（可选）	Ace Hardware	2258622	可替换为其他供应商的等效产品。
剪刀	VWR International LLC	89259-936	可替换为其他供应商的等效产品。
铲子	家得宝	2597400	可替换为其他供应商的等效产品。
土壤钻取器（小直径： &小于1英寸	Ben Meadows	221700	可替换为其他供应商的等效产品。
喷雾瓶	Santa Cruz Biotechnology	sc-395278	可替换为其他供应商的等效产品。
标准去盐带条形码引物（10 µM)（表1）	IDT	NA	4 nmol Ultramer DNA 寡核苷酸，标准脱盐。NGS 接头和测序引物（表 1）针对使用 v3 化学的 Illumina MiSeq 平台设计。
PCR扩增仪	Thermo Fisher Scientific	E950040015	可替换为其他供应商的等效产品。
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	可替换为其他供应商的等效产品。
称量舟	Spectrum Chemicals	B6001W	可替换为其他供应商的等效产品。