从土壤、根际和根 Endosphere 提取细菌群落数据的根菌群探析

Summary

在这里, 我们描述了获取土壤、根际和根 endosphere 微生物的扩增子序列数据的协议。该信息可用于研究植物相关微生物群落的组成和多样性, 适合广泛的植物种类使用。

Abstract

植物宿主和相关微生物之间的密切互动对确定植物的适应性至关重要, 并能促进对非生物胁迫和疾病的耐受性提高。由于植物菌群可以是高度复杂的, 低成本, 高通量的方法, 如基于扩增子的 16S rRNA 基因测序, 往往更倾向于表征其微生物组成和多样性。然而, 在进行此类实验时, 选择适当的方法对于减少可能使样本和研究之间的分析和比较变得困难的偏见至关重要。本议定书详细描述了从土壤、根际和根样本收集和提取 DNA 的标准化方法。此外, 我们还强调了一个建立完善的 16S rRNA 扩增子测序管道, 允许探索这些样本中细菌群落的组成, 并可以很容易地适应其他标记基因。这条管道已经验证了各种植物种类, 包括高粱, 玉米, 小麦, 草莓和龙舌兰, 并可以帮助克服与植物细胞器污染相关的问题。

Introduction

植物相关的微生物由细菌、古菌、病毒、真菌和其他真核微生物组成的动态和复杂的微生物群落组成。除了它们在引起植物病害方面的良好研究作用外, 植物相关的微生物还可以通过提高对生物和非生命胁迫的耐受性, 促进养分供应, 并通过激素的生产。因此, 特殊的兴趣存在于与植物根系 endospheres、豆科和周围土壤相关联的分类。虽然有些微生物可以在实验室产生的培养基上隔离培养, 但许多人不能, 部分原因是它们可能依赖与其他微生物的共生关系, 生长非常缓慢, 或者需要在实验室环境中不能复制的条件。由于它绕过了耕种的需要, 而且相对便宜和高通量, 基于序列的环境和宿主相关微生物样本的系统发育分析已成为测定微生物群落的首选方法。组成。

不同的下一代测序平台¹提供的适当排序技术的选择取决于用户的需求, 其中包括: 所需的覆盖率、扩增子长度、预期的社区多样性, 以及排序错误率, 读长, 和每运行成本/megabase。另一个需要在基于扩增子的测序实验中考虑的变量是什么基因将被放大, 以及将使用什么引物。在设计或选择底漆时, 研究人员常常被迫在放大的普遍性和由此产生的 amplicons 所能实现的分类分辨率之间做出权衡。因此, 这些类型的研究往往选择了引物和标记, 有选择地针对微生物群的特定子集。对细菌群落组成的评估通常是通过对细菌 16S rRNA 基因^2、3的一个或多个高变区域进行排序而完成的。在本研究中, 我们描述了一个基于扩增子的测序协议, 它是针对 16S rRNA 基因的 500 bp V3-V4 区域而开发的, 它允许对细菌类群进行广泛的扩增, 同时也为区分不同的分类群。此外, 该协议可以很容易地适应使用其他底漆集, 如那些针对真菌的 ITS2 标志或 18S rRNA 亚单位的真核生物。

虽然其他方法, 如猎枪 metagenomics, metatranscriptomics 和单细胞测序, 提供其他优势, 包括解决微生物基因组和更直接测量社区功能, 这些技术通常更比此处描述的系统系统分析更昂贵和计算密集型⁴。此外, 在根样本上执行猎枪 metagenomics 和 metatranscriptomics 产生的读数占宿主植物基因组的百分比很大, 克服此限制的方法仍在开发中^5,6。

与任何实验平台一样, 基于扩增子的分析可以引入一些潜在的偏差, 在实验设计和数据分析过程中应该考虑到这一点。这些方法包括样本采集、DNA 提取、PCR 引物的选择以及如何进行库准备。不同的方法可以显著地影响生成的可用数据量, 也会阻碍研究结果的比较。例如, 去除根际细菌的方法⁷和使用不同的提取技术或选择 DNA 提取套件^8,9已被证明大大影响下游分析, 这导致不同的结论关于哪些微生物存在和他们的相对丰度。由于可以自定义基于扩增子的分析, 所以在研究中进行比较可能具有挑战性。地球微生物学项目建议, 研究复杂系统的研究人员, 如植物相关的微生物群将受益于标准化协议的发展, 作为一种手段, 以尽量减少因应用而引起的变异性研究^10、11之间的不同方法。在这里, 我们讨论了以上的许多主题, 并提出了适当的最佳做法的建议。

该协议展示了从高粱双色收集土壤、根际和根样本的过程, 并使用建立良好的 dna 隔离套件¹¹提取 dna。此外, 我们的协议还包括一个详细的扩增子排序工作流, 使用一个常用的 "通用" 平台来确定细菌群落的^结构12, 13, 14.在最近发表的关于18种单子叶植物物种的根、根际和相关土壤的研究中, 本议定书已得到验证, 用于广泛的植物寄主, 其中包括高粱双色、玉米、和小麦的¹⁵。该方法也得到了验证, 以用于其他标记基因, 这表明其成功地应用于研究的真菌 ITS2 标记基因在龙舌兰微生物组学^16,17和草莓微生物群¹⁸。

Protocol

1. 根 Endosphere、根际和土壤样品的收集和分离

1. 进入现场之前, 高压釜超纯水 (每样至少90毫升水) 进行杀菌。通过将6.75 克的25毫升的₂PO₄、8.75 克的 K₂HPO₄和 X-100 的1毫升, 为无菌水的1升, 准备真菌去除缓冲 (每样样品至少可达到每个采样率的约为 mL)。使用0.2 µm 孔径的真空过滤器消毒缓冲器。
   1. 对于步骤1.2 至 1.5, 请穿戴干净的手套, 在任何时候都用乙醇消毒, 并更换每个样品之间的手套以防止污染。用70% 乙醇消毒所有设备, 在样品间擦拭所有设备。取样前, 确定试验的最佳取样深度, 并与所有土壤和根系集合一致。
2. 收集散装土壤样品, 使用乙醇灭菌土壤核心收集器获得土壤没有植物根通过收集一个核心约23至30厘米从基地的植物。
3. 将土壤转移到塑料袋中, 用柔和的震动融汇土壤, 并转移土壤样品的整除 (约600毫克) 以填充2毫升管。立即将2毫升管放在干冰或闪光冷冻在液体 N₂的管, 直到准备进行 DNA 提取 (步骤 2)。
   1. 在某些环境中, 周围土壤可以含有植物材料。在这种情况下, 使用灭菌的2毫米筛将植物碎片从土壤中分离出来, 然后放入塑料袋中。
4. 收集根和根际, 使用乙醇灭菌铲挖掘植物, 照顾尽可能获得尽可能多的根。深度取决于植物。虽然像小麦这样的小植物可以通过挖几厘米来除去, 但像高粱这样的大型植物可能需要30厘米或更多。从根部轻轻地摇动多余的土壤, 直到有大约2毫米的土壤附着在根部表面。
   注意: 在与小植物, 有脆弱的根, 或在干燥, 高粘土含量的土壤工作时要小心。理想情况下, 在震动后, 根上应该只有一层薄薄的土壤。如果土壤中有大量的聚集物, 橡胶槌可以用来通过轻轻地击中射击的底部来去除土壤。如果在这个过程中剩余的土壤量超过或低于2毫米, 应注意近似厚度。
5. 对于大型植物, 使用无菌剪刀和/或剪刀切割一个有代表性的根分部, 并将至少500毫克的根组织放入50毫升圆锥瓶。对于较小的草, 把整个根系统放进瓶子里。添加足够的真菌去除缓冲, 以覆盖根部, 然后立即将样品放在干冰或闪光冻结的样品在液体 N₂。
   注意: 小心不要溢出50毫升锥形瓶, 因为它会使洗涤步骤困难。应该有足够的空空间, 使真菌缓冲能够流到底部, 围绕在整个瓶子的根, 并覆盖顶部。因为有些草的根系生物量比将其放入50毫升圆锥小瓶中要多, 所以应该收集根的一个小节。然而, 应该指出的是, 切割根可能导致内生细菌被冲出到根际的分数, 所以打破根应尽量减少。如果在返回实验室后不立即处理样品, 则可以将其存储在摄氏-80 摄氏度。
6. 将根根从根部分离, 在冰上解冻根部样品, 然后将根样品在4摄氏度上油脂实验10分钟, 三十年代的脉冲为 160 W, 三十年代分离. 将根转移到冷冻 (4 °c), 清洁50毫升管使用无菌钳。不要用缓冲区和土壤来处理原始管, 这是根际分数 (图 1)。
7. 离心管包含缓冲和根际10分钟在4°c, 4000 x g. 醒酒上清, 闪光冻结含有根际分数的管在液体 N₂, 并存储根际分数在-80 °c, 直到准备进行 DNA提取 (步骤 2)。
8. 要洗涤根, 增加大约20毫升冷 (4 °c) 不育水到根分数。用力摇动 (用手或搅拌机, 15-三十年代) 冲洗根, 然后排出水。
9. 重复此步骤至少两次, 直到根表面没有土壤残留。如果不立即执行 DNA 提取 (步骤 2), 则将根包在无菌铝箔上, 在液 N₂中将根部冷冻, 并将样品储存在-80 摄氏度, 直到准备好进行 DNA 提取。

2. DNA 提取

注: 在整个步骤2和3中, 应随时佩戴带有乙醇消毒的干净手套, 所有工作都应在用乙醇消毒的表面上进行。

1. 从土壤和根际样品中提取 DNA。
   1. 使用无菌铲快速将250毫克的土壤和根际从步骤1.3 和1.7 转移到分离的收集管中提供的商业 DNA 隔离套件, 为从土壤中提取, 然后进行 DNA 隔离使用套件供应商的协议。
   2. 在 dna 隔离套件提供的洗脱缓冲器中, 将 dna 洗脱后, 将 dna 储存在-20 摄氏度, 直到准备好进行步骤3。
2. 从根样本中提取 DNA。
   1. 使用液体 N₂冷却灭菌砂浆和杵。测量出600至700毫克的根组织, 并将组织放入砂浆中。小心, 添加足够的液体 N₂以覆盖根。
   2. 把树根磨成小块。继续添加液体 N₂和研磨 (至少两次, 在样品之间保持一致), 直到根是细粉。确保此步骤中的根组织不会解冻。
      注意: 使用适当的个人防护设备 (实验室大衣、防护眼镜和低温手套) 时, 用液体 N₂。
      注: 对于低质量的 DNA 提取, 可以将多余的根研磨成粉末, 并将粉末贮存在-80 摄氏度。
   3. 很快, 在根粉开始解冻之前, 用不育的刮刀将根粉转移到冰上预先称量的1.5 毫升管上。记录管和粉末的重量。通常, 300-400 毫克的粉末转移。
   4. 使用无菌刮刀快速将150毫克的根粉转移到用于从土壤中提取的商业 dna 隔离套件中提供的收集管, 然后使用套件供应商的协议进行 DNA 隔离。
      注: 对于一些根样本, 可能存在高浓度的有机物残留在 dna 颗粒中, 这防止了 dna 在 PCR 过程中的扩增, 特别是当使用不同的 dna 提取协议 (e. g, CTAB 提取)。如有必要, 按照环境 dna 清理试剂盒中提供的指示清洁 dna。
3. 使用高灵敏度台式荧光计测量所有 DNA 样品的浓度。
   1. 将每个洗脱 DNA 样本的 1-20 µL 添加到 dsDNA 高灵敏度检测试剂盒中的管中。添加荧光计工作解决方案 (1:200 染料: 缓冲器) 高达200µL。
   2. 准备两个额外的管, 包含10µL dna 标准 1 (0 ng/µL dna) 或10µL 的标准 2 (100 ng/µL), 并增加190µL 的荧光计工作解决方案, 每个标准。
   3. 测量标准和每个样品的浓度。如果不自动完成, 则通过两个标准的线性回归计算从吸光度输出中的 DNA 浓度。

3. 扩增子图书馆的准备和提交

1. 为放大反应设置材料。
   1. 将 DNA 样品解冻4摄氏度, 在步骤3中将其保持在冰上。随机的 DNA 样本的顺序, 以尽量减少偏倚, 由于在 PCR 板上的位置 (表 2)。
   2. 在96井 PCR 盘中, 从分子级水中的每样样品中稀释 DNA 到5µL, 总容积为20µL. 将20µL 的分子级水添加到四角井, 作为放大 (空白) 的负控制 (表 2)。
   3. 将条形码底漆 (10 µM) 排列在 PCR 条管或96井板中, 这样可以添加多通道吸管 (图 2)。
   4. 准备足够的 PCR 大师组合, 以三种方法放大每个 DNA 样本。准备1.5 µL 的 BSA (20 毫克/毫升), 37.5 µL 预先制作的2x 主混合 (由 PCR 缓冲器、氯化镁₂、dNTPs 和Taq DNA 聚合酶)、0.57 µL 叶绿体肽 (100 µM)、0.57 µL 线粒体肽 (100 µM) 和25.86 µL 分子级水组成。
   5. 将主混合倒入一个无菌的25毫升多通道的吸管库中, 将66µL 的主混合分布到一个新的96井 PCR 板中, 使用多通道吸管。
      注: 在计算主混合试剂卷时, 请确保还包括每板4个空白井。
   6. 使用多通道吸管, 添加6µL 5 ng/µL dna (从规范化的 dna 板块) 到主混合板。然后添加到主板1.5 µL 10 µM 向前底漆, 使每列有一个不同的前向条码, 1.5 µL 10 µM 反向底漆, 使每行有一个不同的反向条码 (图 2)。
      注: 在添加底漆之前, 如果添加了不同的引物, 可使用随机板和主混合体放大其或 ITS2 真菌基因。如果是这种情况, 可以使用类似的底漆设计。
   7. 简单地在 3000 x g 下旋转盘子. 使用多通道吸管轻轻混合, 然后分成三个板块, 25 µL 反应混合物。
      注意: 虽然三的复制不是严格必要的, 但它减少了技术变异性的影响。
2. 用 thermocycler 设置到以下条件的每个板块中的 DNA 放大: 180s 在98°c, 30 个周期:98 °c 为四十五年代 (变性), 78 °c 为十年代 (肽退火), 55 °c 为六十年代 (底漆退火) 和72°c 为九十年代 (引伸), 然后600s 在72摄氏度之后, 4 摄氏度保持一步。放大后, 将三个复制板放入一个单一的96井板中。
3. 用高灵敏度的荧光计试剂在96井板阅读器中量化 DNA。
   1. 将每种 PCR 产品的2µL 添加到96井微板块, 连同98µL 荧光计工作溶液 (1:200 染料: 缓冲器)。包括4井作为标准: 5 µL 脱氧核糖核酸标准 1 (0 ng/µL 脱氧核糖核酸), 1 µL 标准 2 (10 ng/µL), 2 µL 标准 2 (20 ng/µL), 5 µL 标准 2 (50 ng/µL)。然后添加荧光计工作解决方案, 最终体积为100µL。
      注意: 如果无法使用台式荧光计, 可以用步骤2.3 中的描述来测量每个样本。
   2. 用四标准的线性回归计算从吸光度输出中的 DNA 浓度。
   3. 对于成功放大的条形码产品 (那些浓度大于 15 ng/µL), 每个样品的池 100 ng 成一个1.5 毫升管 (表 2)。
   4. 使用电子表格程序中的 = 平均值 () 函数计算添加到池中的样本的平均体积。将 "空白" PCR 产品的体积添加到汇集的样品中。
      注: 由于 "空白" PCR 产品有自己独特的条码组合, 他们可以测序检查任何实验室污染物。
4. 使用步骤2.3 中描述的台式荧光计测量聚集产品的浓度, 并将600的 DNA 和稀释在分子级水中, 在1.5 毫升管中的最终体积为100µL。将剩余的共用产品存储在摄氏-20 摄氏度。
5. 以96井格式的顺磁性纯化珠为整除, 通过以下几种例外的方法, 清洗 600 ng DNA。
   1. 做一个新鲜的600µL 整除70% 乙醇。摇一瓶磁性珠子, 重新悬挂沉淀到底部的珠子。
   2. 添加1x 体积 (100 µL) 的珠溶液到600整除的 DNA。彻底混合吹打10次。室温下孵育5分钟。
   3. 将管子放在磁支架上2分钟 (或直到溶液清晰), 将珠子与溶液分开。当管仍在磁性支架上时, 小心地吸清上清, 而不接触磁性珠子, 并丢弃清上清液。
      注: 在这一点上, 扩增子产品绑定到磁性珠子。任何在吸入过程中受到干扰或丢失的珠子都会导致 DNA 丢失。
   4. 将管放在磁支架中, 将300µL 70% 乙醇添加到管中;在室温下孵化三十年代. 取出乙醇并丢弃。重复这一过程, 并删除所有的乙醇后, 第二次清洗。从磁支架上取下管子, 空气干燥5分钟。
   5. 将30µL 的分子级水添加到干珠中, 然后吹打10次混合。在室温下孵育2分钟. 将管子回磁支架1分钟, 将珠子从溶液中分离出来。把洗脱液转移到新的管子上。
      注: 磁性珠子不会影响下游反应。
6. 使用步骤2.3 中描述的台式荧光计测量清洁的、汇集的 DNA 的最终浓度。将整除稀释至 10 nM, 最终体积为30µL, 或按测序装置优选的浓度和容积。
7. 利用测序装置的服务, 将 DNA 序列化到一个 2 x 300 bp 配对端序列上。

Results

执行建议的协议应导致一个索引配对端读取的数据集, 可以匹配回每个样本, 并分配给细菌操作分类学单位 (OTU) 或精确序列变体 (ESV, 也称为扩增子序列变体 (ASV) 和次操作分类单元 (sOTU)), 取决于下游分析。为了获得高质量的序列数据, 必须在每个步骤中都注意保持样本之间的一致性, 并尽量减少在样品处理或库准备过程中引入任何潜在偏差。在收集、处理和提取样本 (步骤1和 2) 中的 DNA 后, 由此产生的洗脱液应该清晰而无有机物, 从而抑制放大。虽然纯度可以通过 microvolume 分光光度计测量每个 DNA 样本来验证, 但我们发现土壤 dna 提取试剂盒能够可靠地去除所有污染物。由于 dna 质量的可预测性, 依靠荧光染料专门绑定 dna 的量化方法比基于紫外吸光度^19、20、21的定量方式更合适。在 PCR 扩增之前, 土壤和根际样品平均约10µL DNA, 而...

Discussion

该协议展示了一个建立的管道, 用于探索根 endosphere、根际和土壤微生物群落组成, 从野外取样到样品处理和下游测序。研究根相关的微生物提出了独特的挑战, 部分原因是从土壤取样的固有困难。土壤在物理和化学性质上是高度可变的, 不同的土壤条件可以用少量毫米^28、29来分隔。这可能导致从相邻取样点收集的样本, 它们的微生物群落组成和活动有相当大的不同^30,31。因此, 在 DNA 提取之前, 使用土芯收集器和铲子保持一致的取样深度和均匀性, 对于根微生物研究的重现性至关重要。有效地分离根际和根系也至关重要;使用苛刻的根表面杀菌方法可能会在 DNA 提取前溶解菌, 而更保守的清洗可能不会从根表面清除所有微生物⁷。另一个可能对测序结果产生负面影响或干扰的关键因素是细菌污染, 这可能来自许多来源, 有时无法区分取样的环境细菌^3...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-10/20 和微;L 带滤芯的微量移液器吸头	USA Scientific	1120-3810	可以替代其他供应商的等效吸头。
1.5 mL 微量离心管	USA Scientific	1615-5510	可替换为其他供应商的等效管。
10 µL 多通道移液器	Eppendorf	3122000027	可替代其他供应商的等效移液器。
10 µL、100 和微量;L 和 1000 µL 微量移液器	Eppendorf	3120000909	可以替代其他供应商的等效移液器。
100 和微;L 多通道移液器	Eppendorf	3122000043	可替代其他供应商的等效移液器。
1000 和微;L 带滤芯的微量移液器吸头	USA Scientific	1122-1830	可以替代其他供应商的等效吸头。
2 mL 微量离心管	USA Scientific	1620-2700	可替换为其他供应商的等效管。
2 mm 土壤筛	林业供应商	60141009	可以用其他供应商的同等产品替代。
200 和微量;L 带滤芯的微量移液器吸头	USA Scientific	1120-8810	可以替代其他供应商的等效吸头。
25 mL 储液槽	VWR International LLC	89094-664	可替代其他供应商的等效储液槽。
50 mL Thermo	Fisher Scientific	352098	锥形瓶可替代其他供应商的等效样品瓶。
500 mL 真空过滤器（0.2 µm 孔径）	VWR International LLC	156-4020
96 孔微孔板	USA Scientific	655900
96 孔 PCR 板	BioRad	HSP9631
Agencourt AMPure XP 珠子	Thermo Fisher Scientific	NC9933872	使用说明： https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf
铝箔	木板路	7124	可以替代其他供应商的同等产品。
分辨率为 0.001 g 的分析秤	Ohaus Pioneer	PA323	可替代其他供应商的等效产品。
Bioruptor Plus 超声仪	Diagenode	B01020001
牛血清白蛋白 （BSA） 20 mg/mL	New England Biolabs	B9000S
离心	Eppendorf	5811000908	包括 50mL 和 96 孔板吊篮适配器
低温手套	Millipore Sigma	Z183490	可以用其他供应商的等效产品替代。
DNeasy PowerClean 套件（可选）	Qiagen Inc.	12877-50	以前的 MoBio
DNeasy PowerSoil 套件	Qiagen Inc.	12888-100	以前的 MoBio
干冰	任何	NA
DynaMag-2 磁铁	Thermo Fisher Scientific	12321D	不要替代
乙醇	VWR International LLC	89125-188	可以用其他供应商的等效物替代。
加仑大小的冷冻袋	Ziploc	NA	可以替代其他供应商的等效袋。
Gemini EM 微孔板读板仪	Molecular Devices	EM	可以使用另一个荧光计，从顶部读取 96 孔板。
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
实验室外套	Workrite	J1367	可以用其他供应商的等效产品替代。
液体 N2	任何	NA	都可以用其他供应商的等效产品替代。
液体 N2 杜瓦	瓶 Thermo Fisher Scientific	4150-9000	可以替代其他供应商的等效产品。
Milli-Q 超纯水净化系统	Millipore Sigma	SYNS0R0WW
微型离心机	Eppendorf	5404000014
分子级水	Thermo Fisher Scientific	4387937	可以替代其他供应商的等效水。
Mortars	VWR International LLC	89038-150	可以替代其他供应商的等效产品。
丁腈手套	Thermo Fisher Scientific	19167032B	可以替代其他供应商的等效手套。
纸巾	VWR International LLC	BWK6212	可以用其他供应商的同等产品替代。
PCR 板密封膜	Thermo Fisher Scientific	NC9684493
PCR 试管	USA Scientific	1402-2700
Pestles	VWR International LLC	89038-166	可以替代其他供应商的等效产品。
塑料刮刀	LevGo， Inc.	17211
Platinum 热启动 PCR 预混液 （2x）	Thermo Fisher Scientific	13000014
PNA - 叶绿体和线粒体	PNA Bio	NA	确保以生物信息学方式验证序列
防护眼镜	Millipore Sigma	Z759015	可以替代其他供应商的等效产品。
Qubit 3.0 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33216
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32854
橡胶槌（可选）	Ace 硬件	2258622	可以替换为其他供应商的等效产品。
剪刀	VWR International LLC	89259-936	可以替代其他供应商的等效产品。
铲	得宝	2597400	可以替换为其他供应商的等效产品。
土芯收集器（小直径：<1 英寸）	Ben Meadows	221700	可以替代其他供应商的等效产品。
喷雾瓶	Santa Cruz Biotechnology	sc-395278	可以替代其他供应商的等效产品。
标准脱盐条形码引物（10 µM）（表 1）	IDT	NA	4 nmole Ultramer DNA Oligo 与标准脱盐。NGS 接头和测序引物（表 1）设计用于使用 v3 化学技术的 Illumina MiSeq。
Fisher Scientific	E950040015	循环仪	可以替代其他供应商的等效产品。
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	可以替代其他供应商的同等产品。
称重船	Spectrum Chemicals	B6001W	可以替代其他供应商的同等产品。