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方法文章

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

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DOI：

10.3791/57561

⸱

2018年5月2日

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

本文内容

摘要

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。

摘要

植物宿主与其相关微生物之间的密切互作在决定植物适应性方面至关重要，并可促进植物对非生物胁迫和病害的耐受性提升。由于植物微生物组可能具有高度复杂性，通常优先选用低成本、高通量的方法（如基于扩增子的16S rRNA基因测序）来表征其微生物组成与多样性。然而，在开展此类实验时，选择合适的方法学对于减少可能影响样本间及研究间分析与比较的偏差至关重要。本方案详细描述了一种从土壤、根际和根组织样本中收集和提取DNA的标准化方法。此外，我们介绍了一个经过充分验证的16S rRNA扩增子测序流程，可用于探究这些样本中细菌群落的组成，并可轻松适配于其他标记基因。该流程已成功应用于多种植物物种，包括高粱、玉米、小麦、草莓和龙舌兰，且有助于克服植物细胞器DNA污染带来的问题。

引言

与植物相关的微生物组由动态且复杂的微生物群落组成，包括细菌、古菌、病毒、真菌以及其他真核微生物。除了在引发植物病害方面已被广泛研究的作用外，与植物相关的微生物还能通过提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性、促进养分有效性以及通过产生植物激素来增强植物生长，从而对植物健康产生积极影响。因此，人们特别关注定殖于植物根内生境、根际以及周围土壤中的微生物类群。尽管部分微生物可在实验室培养基上单独培养，但许多微生物无法实现体外培养，部分原因在于它们可能依赖于与其他微生物的共生关系、生长极为缓慢，或需要实验室环境中难以复制的特定条件。由于基于测序的环境与宿主相关微生物样本系统发育分析无需依赖培养，且具有成本较低、通量较高的优势，已成为研究微生物群落结构的首选方法。

选择适当的测序技术取决于用户需求，这些技术由多种新一代测序（NGS）平台提供1，关键因素包括：所需的覆盖度、扩增子长度、预期的群落多样性，以及测序错误率、读长和每运行/每兆碱基的成本。在基于扩增子的测序实验中，另一个需要考虑的变量是选择扩增哪个基因以及使用哪些引物。在设计或选择引物时，研究人员通常不得不在扩增的通用性与从所得扩增子中获得的分类学分辨率之间进行权衡。因此，这类研究通常会选择能够选择性靶向微生物组特定子集的引物和标记基因。评估细菌群落组成通常通过测序细菌16S rRNA基因的一个或多个高变区来实现2,3。在本研究中，我们描述了一种为NGS平台开发的基于扩增子的测序方案，该方案靶向细菌16S rRNA基因约500 bp的V3-V4区域，既可实现对多种细菌类群的广泛扩增，又能提供足够的变异以区分不同分类单元。此外，该方案还可轻松适配于其他引物组合，例如靶向真菌ITS2标记或真核生物18S rRNA亚基的引物。

尽管其他方法（如宏基因组鸟枪法测序、宏转录组学和单细胞测序）具有各自的优势，包括可获得完整的微生物基因组以及对群落功能进行更直接的测定，但这些技术通常比本文所述的系统发育谱型分析成本更高，且对计算资源的需求更大4。此外，在根部样品上进行宏基因组鸟枪法测序和宏转录组学分析时，会产生大量来源于宿主植物基因组的测序读段，目前针对这一局限性的解决方法仍在开发中5,6。

与任何实验平台一样，基于扩增子的分析可能会引入多种潜在偏差，这些偏差在实验设计和数据分析过程中均需加以考虑。这些偏差包括样本采集方法、DNA提取方法、PCR引物的选择以及文库制备方式。不同的方法会显著影响所产生的可用数据量，也可能阻碍不同研究之间结果的比较。例如，去除根际细菌的方法7，以及不同提取技术或DNA提取试剂盒的选择8,9，已被证明会显著影响下游分析，从而导致关于存在哪些微生物及其相对丰度的不同结论。由于基于扩增子的分析具有可定制性，跨研究之间的比较可能具有挑战性。地球微生物组计划提出，研究植物相关微生物组等复杂系统的研究人员应制定标准化操作流程，以尽量减少因不同研究间采用不同方法所引起的变异性10,11。本文将讨论上述多个主题，并在适当情况下提供最佳实践建议。

该方案演示了采集土壤、根际和根部样品的过程 高粱（Sorghum bicolor） 使用一种成熟的DNA提取试剂盒提取DNA11此外，我们的方案包含一个详细的扩增子测序流程，采用一种常用的高通量测序平台，用于确定细菌群落的结构12,13,14该方案已在最近发表的一项研究中得到验证，适用于18种单子叶植物的根系、根际及关联土壤，涵盖多种植物宿主 高粱（Sorghum bicolor），玉米（Zea mays） 和 Triticum aestivum15该方法也已验证可用于其他标记基因，例如在龙舌兰微生物组研究中成功应用于真菌ITS2标记基因的分析。16,17 以及草莓微生物组18.

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方案

1. 根内菌群、根际及土壤样品的采集与分离

  1. 进入野外前，将超纯水（每份样品至少 90 mL）进行高压灭菌以实现消毒。通过向 1 L 无菌水中加入 6.75 g KH2PO4、8.75 g K2HPO4 和 1 mL Triton X-100，配制附生生物去除缓冲液（每份样品至少 25 mL）。使用孔径为 0.2 µm 的真空滤器对缓冲液进行灭菌。
    1. 在执行步骤 1.2 至 1.5 时，始终佩戴经乙醇灭菌的洁净手套，并在处理每份样品之间更换手套，以防止污染。所有设备均需用 70% 乙醇灭菌，并在样品间擦拭清洁。采样前，确定实验所需的最优采样深度，并在所有土壤和根系采集过程中保持一致。
  2. 采集散装土壤样品时，使用经乙醇灭菌的土壤钻取器，从植株基部约 23 至 30 cm 处采集不含植物根系的土壤。
  3. 将土壤转移至塑料袋中，轻轻振荡使其均质化，然后取一份土壤样品（约 600 mg）装入一个 2 mL 离心管中。立即将该 2 mL 管置于干冰上，或在液氮（N2）中快速冷冻，直至准备进行 DNA 提取（步骤 2）。
    1. 在某些环境中，周围土壤可能含有植物材料。此时，在将土壤放入塑料袋前，应使用经灭菌的 2 mm 筛网将植物残渣与土壤分离。
  4. 为采集根系及根际样品，使用经乙醇灭菌的铲子小心挖出植株，尽可能获取完整的根系。采样深度取决于植物种类：小型植物（如小麦）仅需挖掘数厘米即可取出，而大型植物（如高粱）则可能需要挖掘 30 cm 或更深。轻轻抖动根部以去除多余土壤，直至根表附着约 2 mm 厚的土壤层。
    注意：处理小型植物、根系脆弱的植物或干燥且高黏土含量的土壤时需格外小心。理想情况下，抖落后根部仅应残留一层薄薄的土壤。若仍有较大土团附着，可用橡胶锤轻敲茎基部以松动土壤。若此操作后残留土壤厚度超过或不足 2 mm，应记录其大致厚度。
  5. 对于大型植物，使用无菌剪刀和/或修枝剪切取具有代表性的根系亚区段，并将不少于 500 mg 的根组织放入一个 50 mL 锥形管中。对于较小的禾本科植物，则将整个根系系统放入管中。加入足量的附生生物去除缓冲液以完全浸没根系，随后立即将样品置于干冰上，或在液氮（N2）中快速冷冻。
    注意：注意不要过度填充 50 mL 锥形管，否则会影响后续洗涤步骤。应保留足够的空余空间，使附生生物缓冲液能够流至管底，充分包围根系并覆盖其顶部。由于某些禾本科植物的根系生物量过大，无法完全容纳于 50 mL 锥形管中，因此应仅采集部分根系。但需注意，切割根系可能导致内生细菌被冲洗至根际组分中，因此应尽量减少根系断裂。若样品返回实验室后不能立即处理，可于 -80 °C 保存。
  6. 为分离根际与根系，将根系样品置于冰上解冻，随后在 4 °C 条件下对根系样品进行超声处理，功率 160 W，脉冲 30 秒，间隔 30 秒，持续 10 分钟。使用无菌镊子将根系转移至预冷（4 °C）的洁净 50 mL 离心管中。请勿丢弃含有缓冲液和土壤的原始管，其中内容物即为根际组分（图 1）。
  7. 将含有缓冲液和根际的离心管在 4 °C、4,000 × g 条件下离心 10 分钟。倾去上清液，将含有根际组分的离心管在液氮（N2）中快速冷冻，并于 -80 °C 保存，直至准备进行 DNA 提取（步骤 2）。
  8. 清洗根系时，向根系组分中加入约 20 mL 预冷（4 °C）的无菌水。通过剧烈振荡（手动或使用混合器，持续 15–30 秒）清洗根系，然后排去水分。
  9. 重复此步骤至少两次，直至根系表面无可见土壤残留。若 DNA 提取（步骤 2）不能立即进行，应用无菌铝箔包裹根系，在液氮（N2）中快速冷冻，并于 -80 °C 保存，直至准备进行 DNA 提取。

2. DNA 提取

注意：在步骤2和3的整个过程中，应始终佩戴经乙醇消毒的清洁手套，并在经乙醇消毒的台面上进行所有操作。

  1. 从土壤和根际样品中提取DNA。
    1. 使用无菌刮勺迅速将步骤1.3和1.7中获得的250 mg土壤及根际样品分别转移至专用于土壤DNA提取的商业化DNA提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作说明进行DNA提取。
    2. 使用DNA提取试剂盒提供的洗脱缓冲液洗脱DNA后，将DNA储存于-20 °C，待进行步骤3时取出使用。
  2. 从根部样品中提取DNA。
    1. 使用液氮预冷已灭菌的研钵和研杵2. 称取 600 至 700 mg 根组织，将组织放入研钵中。小心地加入足量液氮2 以覆盖根部。
    2. 将根部研磨成小块。继续添加液氮的过程2 研磨（至少两次，样品间保持一致），直至根部组织成为细粉。确保在此步骤中根组织不发生解冻。
      注意：使用液氮时，应佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和低温手套）。2.
      注意：对于低质量的DNA提取，可将过量的根组织研磨成粉末并储存在-80 °C，以利于后续操作。
    3. 迅速地，在根粉开始解冻之前，使用无菌刮勺将根粉转移至预称重的、置于冰上的1.5 mL离心管中。记录管和粉末的重量。通常转移300 - 400 mg粉末。
    4. 使用无菌刮勺迅速将150 mg根粉转移至专用于土壤样品DNA提取的商业化DNA提取试剂盒所提供的收集管中，随后按照试剂盒供应商提供的操作步骤进行DNA提取。
      注意：对于某些根样品，DNA沉淀中可能残留较高浓度的有机物，这会抑制PCR过程中DNA的扩增，尤其是在采用不同的DNA提取方案时例如，CTAB 提取法）进行提取。如有必要，按照环境 DNA 纯化试剂盒提供的说明对 DNA 进行纯化。
  3. 使用高灵敏度台式荧光计测量所有DNA样品的浓度。
    1. 将每种洗脱的DNA样品各取1 - 20 µL加入dsDNA高灵敏度检测试剂盒提供的试管中。加入荧光计工作液（1:200 染料:缓冲液）至终体积为200 µL。
    2. 另准备两支试管，分别加入10 µL DNA标准品1（0 ng/µL DNA）或10 µL标准品2（100 ng/µL），然后向每支标准品试管中各加入190 µL荧光计工作液。
    3. 测定各标准品和样品的浓度。如果未自动完成，则根据两个标准品的吸光度值通过线性回归计算DNA浓度。

3. 扩增子文库制备与提交

  1. 准备扩增反应所需材料。
    1. 在 4 °C 下解冻 DNA 样品，并在整个步骤 3 中保持样品置于冰上。随机排列 DNA 样品顺序，以尽量减少因样品在 PCR 板上位置不同而产生的偏差（表 2）。
    2. 在 96 孔 PCR 板中，将每个样品的 DNA 用分子级水稀释至总反应体积为 20 µL，浓度为 5 ng/µL。在四个角落孔中各加入 20 µL 分子级水，作为扩增的阴性对照（空白）（表 2）。
    3. 将条形码引物（10 µM）排列在 PCR 条形管或 96 孔板中，以便使用多通道移液器添加（图 2）。
    4. 配制足够的 PCR 主混合液，用于每个 DNA 样品的三重扩增。每份主混合液包含：1.5 µL BSA（20 mg/mL）、37.5 µL 预制的 2x 主混合液（含 PCR 缓冲液、MgCl2、dNTPs 和 Taq DNA 聚合酶）、0.57 µL 叶绿体 PNA（100 µM）、0.57 µL 线粒体 PNA（100 µM）以及 25.86 µL 分子级水。
    5. 将主混合液倒入无菌的 25 mL 多通道移液器储液槽中，使用多通道移液器向新的 96 孔 PCR 板的每个孔中分配 66 µL 主混合液。
      注：计算主混合液试剂用量时，需额外计入每块板上的 4 个空白孔。
    6. 使用多通道移液器，将 6 µL 浓度为 5 ng/µL 的 DNA（来自标准化 DNA 板）加入主混合液板中。然后向主混合液板中加入 1.5 µL 浓度为 10 µM 的正向引物，使每一列具有不同的正向条形码；再加入 1.5 µL 浓度为 10 µM 的反向引物，使每一行具有不同的反向条形码（图 2）。
      注：在添加引物之前，若使用不同的引物，可将已随机化的板和主混合液用于扩增 ITS 或 ITS2 真菌基因。若如此操作，可采用类似的引物设计。
    7. 将 PCR 板短暂离心（3,000 x g）。使用多通道移液器轻轻混匀，然后将反应混合液分装至三块新板中，每孔 25 µL。
      注：尽管三重重复并非绝对必要，但可降低技术变异的影响。
  2. 使用设定为以下条件的热循环仪对每块板中的 DNA 进行扩增：98 °C 预变性 180 秒，进行 30 个循环（98 °C 变性 45 秒，78 °C PNA 退火 10 秒，55 °C 引物退火 60 秒，72 °C 延伸 90 秒），随后在 72 °C 延伸 600 秒，最后 4 °C 保存。扩增完成后，将三块重复板的产物合并至一块 96 孔板中。
  3. 使用高灵敏度荧光计试剂，在 96 孔板读数仪中定量 DNA。
    1. 向 96 孔微孔板中每孔加入 2 µL PCR 产物，并加入 98 µL 荧光计工作液（染料:缓冲液 = 1:200），共 100 µL。设置 4 个标准品孔：分别加入 5 µL DNA 标准品 1（0 ng/µL DNA）、1 µL 标准品 2（10 ng/µL）、2 µL 标准品 2（20 ng/µL）和 5 µL 标准品 2（50 ng/µL），再补加荧光计工作液至终体积为 100 µL。
      注：若无板式读数仪，可使用台式荧光计按步骤 2.3 所述方法单独测量每个样品。
    2. 根据四个标准品的吸光度值进行线性回归，计算 DNA 浓度。
    3. 对于成功扩增的带条形码产物（浓度高于 15 ng/µL 的样品），将每个样品取 100 ng 汇集至一个 1.5 mL 离心管中（表 2）。
    4. 使用电子表格程序中的 =AVERAGE() 函数计算加入混合样品的平均体积。将"空白" PCR 产物的体积也加入混合样品中。
      注：由于"空白" PCR 产物具有独特的条形码组合，可用于测序以检测实验室中的任何污染源。
  4. 使用台式荧光计（如步骤 2.3 所述）测定混合产物的浓度，取 600 ng DNA，用分子级水稀释至终体积为 100 µL，置于 1.5 mL 管中。将剩余的混合产物储存于 -20 °C。
  5. 按照既定的 PCR 纯化流程，使用磁性纯化珠在 96 孔板格式下对 600 ng DNA 分装样品进行洗涤，仅作少量调整。
    1. 新鲜配制 600 µL 70% 乙醇。轻轻振荡磁珠瓶，使沉降于底部的磁珠重新悬浮。
    2. 向 600 ng DNA 分装样品中加入 1 倍体积（100 µL）的磁珠溶液，通过移液吹打 10 次充分混匀。室温孵育 5 分钟。
    3. 将管置于磁力架上 2 分钟（或直至溶液澄清），使磁珠与溶液分离。在管仍置于磁力架上的情况下，小心吸除上清液，避免触碰磁珠，并弃去上清液。
      注：此时扩增产物已结合在磁珠上。若在吸除过程中扰动或丢失磁珠，将导致 DNA 损失。
    4. 保持管在磁力架上，向管中加入 300 µL 70% 乙醇，室温孵育 30 秒。吸除乙醇并弃去。重复此步骤一次，并在第二次洗涤后彻底去除所有乙醇。将管从磁力架上取下，室温晾干 5 分钟。
    5. 向干燥的磁珠中加入 30 µL 分子级水，通过移液吹打 10 次混匀。室温孵育 2 分钟。将管放回磁力架静置 1 分钟，使磁珠与溶液分离。将上清液转移至新管中。
      注：磁珠不会影响后续反应。
  6. 使用台式荧光计（如步骤 2.3 所述）测定纯化后混合 DNA 的最终浓度。取一份样品稀释至 10 nM，终体积为 30 µL，或根据测序机构要求调整至其推荐的浓度和体积。
  7. 送样至测序机构，使用高通量测序平台（NGS）进行 2 x 300 bp 双端测序。

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结果

执行推荐的实验方案后，应获得一组带有索引的双端测序数据，这些数据可回溯至各个样本，并根据下游分析方法被归类为细菌可操作分类单元（OTU）或精确序列变体（ESV，也称为扩增子序列变体（ASV）和亚可操作分类单元（sOTU））。为了获得高质量的序列数据，在样本处理和文库构建的每一步都必须注意保持样本间的一致性，并尽量减少任何潜在偏差的引入。在完成样本采集、处理及DNA提取（步骤1和步骤2）后，所得洗脱液应呈透明状态，不含可能抑制扩增反应的有机污染物。虽然可通过微量分光光度计测定各DNA样本的纯度，但我们发现土壤DNA提取试剂盒能够可靠地去除所有污染物。由于DNA质量具有可预测性，因此相较于基于紫外吸收的定量方法，使用特异性结合DNA的荧光染料进行定量更为合适19,20,21。在PCR扩增前，土壤和根际样本的DNA浓度平均约为10 ng/µL，而根组织样本的平均浓度通常约为30 ng/µL（<...

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讨论

本方案展示了一条从田间取样到样品处理及后续测序的成熟流程，用于研究根内生圈、根际及土壤微生物群落组成。研究根际相关微生物组面临独特挑战，部分原因在于土壤取样的固有困难。土壤在物理和化学性质上具有高度变异性，不同土壤条件之间的距离可能仅有几毫米28,29。这可能导致从相邻取样点采集的样品在微生物群落组成和活性方面存在显著差异30,31。因此，在DNA提取前使用土壤钻取器和铲子以保持取样深度一致并进行均质化处理，对于根微生物组研究的可重复性至关重要。高效分离根际与根组织组分同样关键；采用过于剧烈的根表面灭菌方法可能在DNA提取前导致根内内生菌裂解，而过于温和的冲洗则可能无法完全去除根表面附着的微生物7。另一个可能对测序结果产生负面影响或造成干扰的因素是细菌污染，污染来源多样，有时难以与环境样品中的目标细菌区分32<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国农业部农业研究局（USDA-ARS，项目编号：CRIS 2030-21430-008-00D）资助。TS 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（NSF Graduate Research Fellowship Program）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1-10/20 µL 过滤吸头USA Scientific1120-3810可替换为其他供应商的等效产品。
1.5 mL 微量离心管USA Scientific1615-5510可替换为其他供应商的等效产品。
10 µ多通道移液器Eppendorf3122000027可替换为其他供应商的等效产品。
10 µ升，100 µL，和1000 µL 微量移液器Eppendorf3120000909可替换为其他供应商的等效产品。
100 µ多通道移液器Eppendorf3122000043可替换为其他供应商的等效产品。
1000 µL 过滤型微量移液器吸头USA Scientific1122-1830可替换为其他供应商的等效产品。
2 mL 微量离心管USA Scientific1620-2700可替换为其他供应商的等效产品。
2 mm 土壤筛林业供应商60141009可替换为其他供应商的等效产品。
200 µL 过滤型微量移液器吸头USA Scientific1120-8810可替换为其他供应商的等效产品。
25 mL 储液槽VWR International LLC89094-664可替换为其他供应商的等效产品。
50 mL 锥形瓶Thermo Fisher Scientific352098可替换为其他供应商的等效产品。
500 mL 真空滤器（0.2 µm 孔径）VWR International LLC156-4020
96孔微孔板USA Scientific655900
96孔PCR板BioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP 磁珠赛默飞世尔科技NC9933872使用说明：
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
铝箔木板路7124可使用其他供应商的等效产品替代。
分析天平，精度为 0.001 gOhaus PioneerPA323可替换为其他供应商的等效产品。
Bioruptor Plus 超声波破碎仪DiagenodeB01020001
牛血清白蛋白（BSA）20 mg/mLNew England BiolabsB9000S
离心Eppendorf5811000908包括50 mL和96孔板桶适配器
低温手套Millipore SigmaZ183490可替换为其他供应商的等效产品。
DNeasy PowerClean 试剂盒（可选）Qiagen Inc.12877-50先前的 MoBio
DNeasy PowerSoil 试剂盒Qiagen 公司12888-100先前的 MoBio
干冰任何NA
DynaMag-2 磁力架赛默飞世尔科技12321D请勿替换
乙醇VWR International LLC89125-188可替换为其他供应商的等效产品。
加仑尺寸冷冻袋ZiplocNA可替换为其他供应商的等效产品。
Gemini EM 微孔板读板仪Molecular DevicesEM可使用另一种从顶部读取96孔板的荧光计。
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
实验服WorkriteJ1367可替换为其他供应商的等效产品。
液氮2任何NA可替换为其他供应商的等效产品。
液氮2 杜瓦瓶Thermo Fisher Scientific4150-9000可替换为其他供应商的等效产品。
Milli-Q超纯水净化系统Millipore SigmaSYNS0R0WW
微型离心机Eppendorf5404000014
分子级水Thermo Fisher Scientific4387937可替换为其他供应商的等效产品。
研钵VWR International LLC89038-150可替换为其他供应商的等效产品。
腈基手套赛默飞世尔科技19167032B可替换为其他供应商的等效产品。
纸巾VWR International LLCBWK6212可替换为其他供应商的等效产品。
PCR板封膜Thermo Fisher ScientificNC9684493
PCR条形管USA Scientific1402-2700
研钵VWR International LLC89038-166可替换为其他供应商的等效产品。
塑料刮勺LevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA - 叶绿体和线粒体PNA BioNA务必通过生物信息学方法对序列进行验证
防护眼镜Millipore SigmaZ759015可替换为其他供应商的等效产品。
Qubit 3.0 荧光仪Thermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32854
橡胶锤（可选）Ace Hardware2258622可替换为其他供应商的等效产品。
剪刀VWR International LLC89259-936可替换为其他供应商的等效产品。
铲子家得宝2597400可替换为其他供应商的等效产品。
土壤钻取器（小直径： &小于1英寸Ben Meadows221700可替换为其他供应商的等效产品。
喷雾瓶Santa Cruz Biotechnologysc-395278可替换为其他供应商的等效产品。
标准去盐带条形码引物（10 µM)（表1）IDTNA4 nmol Ultramer DNA 寡核苷酸，标准脱盐。NGS 接头和测序引物（表 1）针对使用 v3 化学的 Illumina MiSeq 平台设计。
PCR扩增仪Thermo Fisher ScientificE950040015可替换为其他供应商的等效产品。
Triton X-100Sigma-AldrichX100可替换为其他供应商的等效产品。
称量舟Spectrum ChemicalsB6001W可替换为其他供应商的等效产品。

参考文献

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

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