本实验方案的目的是利用细胞外电子受体，通过分光光度法监测跨质膜电子传递，并分析这些细胞外电子受体可能发生的酶促相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
跨质膜电子传递（tPMET）在保护细胞免受胞内还原应激以及胞外氧化剂损伤方面发挥重要作用。这种将电子从胞内还原剂传递至胞外氧化剂的过程尚未被充分阐明。本文介绍了利用C2C12成肌细胞进行分光光度法检测tPMET的方法，所用的胞外电子受体包括水溶性四氮唑盐-1（WST-1）和2,6-二氯酚靛酚（DPIP或DCIP）。通过检测这些电子受体的还原程度，可实现对该过程的实时分析。在检测体系中加入抗坏血酸氧化酶（AO）和超氧化物歧化酶（SOD），可分别确定tPMET中由抗坏血酸外排或超氧阴离子生成所贡献的部分。实验结果显示，WST-1具有背景信号低且结果稳定的特点，而DPIP在加入AO和SOD后可被重新氧化，该现象通过分光光度分析得以证实。该方法是一种实时、多孔板、快速的分光光度检测法，在监测tPMET方面相较于其他方法（如铁氰化物（FeCN）和高铁细胞色素c还原法）具有优势。
引言
纯化质膜还原电子受体的能力表明，质膜具有内在的氧化还原能力1。跨质膜电子传递（tPMET）这一过程此前已在真菌、植物和动物中被观察到，是多种生物共有的现象2,3,4,5。具体而言，该过程已在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、胡萝卜细胞、红细胞、淋巴细胞、骨肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞以及中性粒细胞中得到证实2,3,4,5,6,7。tPMET通过将电子跨质膜转运以还原胞外氧化剂，参与多种细胞功能，包括：细胞生长5,8、细胞活力9<....
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方案
注意：关键步骤的示意图参见图1。
1. WST-1 还原测定法
- 采用标准的细胞培养方法培养和分化C2C12贴壁细胞7 在96孔板的A-F行中进行。
- 使用含有2%马血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为分化培养基。将细胞在37 °5% CO₂ 条件下 37 °C培养2.
- 监测抗坏血酸在tPMET中的作用时，向分化培养基中添加100 µM 抗坏血酸。将细胞置于分化培养基中孵育约 24–48 小时。
- 配制WST-1和PMS储备液。
- 配制10 mM的WST-1储备液：将0.033 g WST-1（分子量（FW）：651.34 g/mol）溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 ℃保存 °C.
- 要配制5 mM的PMS储备液，将0.0023 g PMS（分子量：306.34 g/mol）溶解于1.5 mL去离子H2O (二氢2O）。储存于 -20 °C 并避光。
- 向 11.4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）或 HE....
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结果
采用 RStudio 统计软件进行重复测量方差分析（ANOVA）进行统计学分析25。样本量在图注中予以标明。
为监测跨质膜电子传递（tPMET），实验采用C2C12成肌细胞管状结构，并结合细胞外电子受体WST-1和DPIP。使用抗坏血酸氧化酶（AO）以确定WST-1和DPIP还原中由抗坏血酸外排所贡献的部分，使用超氧化物歧化酶（SOD）以确定WST-1还原因细胞外超氧阴离子释放所占的部分。如图2所示，C2C12成肌细胞管状结构能够进行tPMET，表现为WST-1的还原。加入AO后，WST-1的还原被抑制约30%，表明约30%的tPMET由抗坏血酸外排所致（图2A）。加入SOD后，WST-1的还原被抑制约70%，表明约70%的tPMET由细胞外超氧阴离子释放所致（
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讨论
我们介绍了两种利用细胞外电子受体WST-1和DPIP的分光光度法检测技术，用于监测C2C12成肌细胞中的跨质膜电子转移（tPMET）。通过标准培养方法培养细胞系，并使用分光光度计微孔板读板仪，即可在简单的微孔板检测中利用这些电子受体监测tPMET。WST-1的还原反应在同一次检测的各个孔之间具有良好的重复性，但存在日间变异。以PBS作为缓冲液时，日间变异系数（CV）为0.18；以HBS作为缓冲液时，CV为0.23。
根据先前使用 mPMS 和 WST-1 的文献，我们对该方案进行了修改，特别是针对 PMS 的使用。因此，故障排查包括确定适用于所述肌管细胞的 PMS 和 WST-1 的合适浓度。我们还发现，温度（在 23–37 °C 范围内）对该检测并非关键因素，而在每次吸光度读数前振荡培养板则十分重要。然而，这些因素在将该检测应用于其他细胞系时仍需进一步验证。关于 SOD 和 AO 能够直接氧化还原型 WST-1 的研究结果提示，在故障排查过程中，对新检测组分是否具有此类性质进行筛选是一个关键环节。
我们的数据表明，应将PMS.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Thomas Bell、Lyn Mattathil、Mark Mannino 和 Neej Patel 提供的技术支持。本研究由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）通过美国公共卫生服务奖 R15DK102122 资助 Jonathan Fisher。本论文的内容完全由作者负责，不一定代表 NIDDK 或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C2C12 成肌细胞 | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基 - 低葡萄糖 | Sigma | D6046 | |
| 胎牛血清动物血清复合物 | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | 516106 | |
| 马血清 | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma | D8537 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm 培养皿 | TPP | 93150 | |
| 96 孔培养板 | TPP | 92096 | |
| 2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐 (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| 吩嗪硫酸甲酯 | Sigma | P9625 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A5960 | |
| 抗坏血酸氧化酶 | Sigma | A0157 | |
| 超氧化物歧化酶 | Sigma | S5395 | |
| 2,6-二氯靛酚钠盐 | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7528 | |
| HEPES 钠盐 | Sigma | H3784 | |
| 氯化钠 | Sigma | S7653 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | BP366 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma | M5921 | |
| 二水合氯化钙 | Sigma | C7902 | |
| 磷酸钾 | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I 分光光度计 | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 分光光度计 | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96 孔微孔板，F 型底，透明，未处理，非无菌 | MidSci | 781602 | |
| 四水合氯化亚铁 | Sigma | 220299 | |
| 七水合硫酸亚铁 | Sigma | 215422 | |
| 次黄嘌呤 | Sigma | H9636 | |
| 黄嘌呤氧化酶 | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
参考文献
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
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重印与许可
