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方法文章

通过C2C12成肌细胞测量跨质膜电子传递

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DOI：

10.3791/57565

⸱

2018年5月4日

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Louis University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是利用细胞外电子受体，通过分光光度法监测跨质膜电子传递，并分析这些细胞外电子受体可能发生的酶促相互作用。

摘要

跨质膜电子传递（tPMET）在保护细胞免受胞内还原应激以及胞外氧化剂损伤方面发挥重要作用。这种将电子从胞内还原剂传递至胞外氧化剂的过程尚未被充分阐明。本文介绍了利用C2C12成肌细胞进行分光光度法检测tPMET的方法，所用的胞外电子受体包括水溶性四氮唑盐-1（WST-1）和2,6-二氯酚靛酚（DPIP或DCIP）。通过检测这些电子受体的还原程度，可实现对该过程的实时分析。在检测体系中加入抗坏血酸氧化酶（AO）和超氧化物歧化酶（SOD），可分别确定tPMET中由抗坏血酸外排或超氧阴离子生成所贡献的部分。实验结果显示，WST-1具有背景信号低且结果稳定的特点，而DPIP在加入AO和SOD后可被重新氧化，该现象通过分光光度分析得以证实。该方法是一种实时、多孔板、快速的分光光度检测法，在监测tPMET方面相较于其他方法（如铁氰化物（FeCN）和高铁细胞色素c还原法）具有优势。

引言

纯化质膜还原电子受体的能力表明，质膜具有内在的氧化还原能力1。跨质膜电子传递（tPMET）这一过程此前已在真菌、植物和动物中被观察到，是多种生物共有的现象2,3,4,5。具体而言，该过程已在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、胡萝卜细胞、红细胞、淋巴细胞、骨肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞以及中性粒细胞中得到证实2,3,4,5,6,7。tPMET通过将电子跨质膜转运以还原胞外氧化剂，参与多种细胞功能，包括：细胞生长5,8、细胞活力9、铁代谢10、细胞信号转导11,12,13，以及对活性氧物质的防护12,14,15。由于tPMET参与多种细胞功能，其失衡被认为可能与某些严重健康状况的发生有关，包括癌症16、心血管疾病17和代谢综合征18。

监测电子跨质膜转移的方法有多种，但最广泛使用的技术是通过比色法检测胞外电子受体的还原情况。常用的胞外电子受体包括四氮唑盐、DPIP、FeCN 和高铁细胞色素 c19,20。其中最常用的四氮唑盐是一种被称为 WST-1 的第二代盐19。由于含有两个磺酸基团，WST-1 的水溶性更高，因此在比色测定中比第一代四氮唑盐更易于使用21。WST-1 与中间电子受体 1-甲氧基-吩嗪甲基硫酸盐（mPMS）联用时，可通过两次单电子转移反应被还原。该还原过程使原本颜色较浅的氧化态 WST-1 转变为颜色更深的黄色甲臜产物20,22。WST-1 的摩尔消光系数高达 37 × 103 M-1cm-1，因而具有很高的检测灵敏度21,22。DPIP 也被用作胞外电子受体以监测跨质膜电子转移（tPMET）。研究表明，DPIP 可在无需中间电子受体辅助的情况下被 tPMET 直接在胞外还原23,24。由于不需要中间电子受体，DPIP 能够直接从质膜获取电子，而 WST-1 则不能24。与 DPIP 类似，FeCN 也被证明可在无中间电子受体参与的情况下被 tPMET 在胞外还原为亚铁氰化物19,24。然而与 WST-1 和 DPIP 不同，FeCN 的摩尔消光系数较低，导致其检测灵敏度较低9。另一种常用于监测 tPMET 的胞外电子受体是高铁细胞色素 c。与 WST-1 相似，高铁细胞色素 c 的还原效率在使用中间电子受体 mPMS 时会提高22。但与 WST-1 不同的是，由于本底信号较高且摩尔消光系数较低，高铁细胞色素 c 法的灵敏度较低22。

本文介绍了一种通过分光光度法实时分析跨质膜电子转移（tPMET）的方法。该方法采用细胞外电子受体WST-1和DPIP，二者均具有较高的摩尔消光系数，且成本低于其他常用的细胞外电子受体（如高铁细胞色素c）。我们使用吩嗪甲基硫酸盐（PMS）代替mPMS，因为两者化学结构相似，而PMS的成本显著更低。尽管mPMS具有光化学稳定性，这对于需要较长保质期的商用试剂盒而言是一个重要特性，但我们在每次实验中均新鲜配制PMS，因此稳定性不会成为问题。此外，我们还提供了一种评估细胞外电子受体与可能参与tPMET过程的酶之间潜在相互作用的方法（见图1），可用于进一步表征tPMET机制。具体而言，抗坏血酸氧化酶（AO）和超氧化物歧化酶（SOD）可用于判断tPMET中由抗坏血酸转运或细胞外超氧阴离子释放所贡献的部分，这两种机制是电子跨质膜转运的常见途径。

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方案

注意：关键步骤的示意图参见图1。

1. WST-1 还原测定法

  1. 采用标准的细胞培养方法培养和分化C2C12贴壁细胞7 在96孔板的A-F行中进行。
    1. 使用含有2%马血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为分化培养基。将细胞在37 °5% CO₂ 条件下 37 °C培养2.
    2. 监测抗坏血酸在tPMET中的作用时，向分化培养基中添加100 µM 抗坏血酸。将细胞置于分化培养基中孵育约 24–48 小时。
  2. 配制WST-1和PMS储备液。
    1. 配制10 mM的WST-1储备液：将0.033 g WST-1（分子量（FW）：651.34 g/mol）溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 ℃保存 °C.
    2. 要配制5 mM的PMS储备液，将0.0023 g PMS（分子量：306.34 g/mol）溶解于1.5 mL去离子H2O (二氢2O）。储存于 -20 °C 并避光。
  3. 向 11.4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）或 HEPES 缓冲盐水（HBS；20 mM HEPES 钠盐，140 mM NaCl，5 mM KCl，2.5 mM MgSO₄）中加入 0.0108 g 葡萄糖，使其终浓度为 5 mM。4，1 mM CaCl2。加入480 µL 的 10 mM WST-1，使其终浓度为 400 µ和 48 µ20 微摩尔终浓度的 5 毫摩尔 PMS 溶液 µM.
  4. 在监测抗坏血酸参与tPMET时，将溶液分为两份各6 mL的等分试样。向其中一份等分试样中加入6 µL of 二氢2O，并向另一份等分试样中加入6 µ2 kU/mL AO 的 L，终浓度为 2 U/mL。
  5. 在监测超氧化物参与tPMET时，将溶液均分为两份6 mL等分试样。向其中一份试样中加入55 µ0.1 M KPO 的 L4 缓冲液，向另一等分试样中加入 55 µ6.5 kU/mL SOD 的 L，终浓度为 60 U/mL。
  6. 用 PBS 洗涤细胞。吸去培养基后，加入 150 µL PBS。然后吸除 PBS。
    注意：该实验使用已贴壁的培养细胞进行，因此在洗涤过程中无需离心或使用胰蛋白酶。
  7. 加入100 µL 的 WST-1 溶液（不含 SOD 或不含 AO）加入第 1–6 列，并加入 100 µL 的 WST-1 溶液（+）SOD 或（+）AO 加入 96 孔板的第 7–12 列。以 G 行和 H 行作为背景对照即，用于监测无细胞孔中仅试剂的吸光度变化。
  8. 每10分钟使用分光光度计在438 nm处测量一次吸光度值，持续1小时。
  9. 读取后，吸出培养基，每孔用150 µL PBS。然后吸除 PBS。
  10. 通过从每个孔在任意时间点的吸光度中减去该孔的初始吸光度，计算每个孔的吸光度变化值。并根据背景孔中观察到的吸光度变化（如有）对该变化值进行校正。即，含有检测溶液但无细胞的孔。
  11. 分析时，将吸光度数据归一化至60分钟对照组测量值，或用PBS或HBS洗涤孔板，然后进行二辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测。
  12. 加入2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）标准品（范围为0.5–2） µ根据细胞汇合度，向空孔（G行和H行）中加入相应体积的L（用于标准曲线），然后向所有孔中加入BCA试剂。
  13. 通过每纳米摩尔 WST-1 还原来量化数据 µg 蛋白质。使用 37 mM-1 厘米-1 22 以438 nm处还原型WST-1的消光系数。

2. DPIP 还原测定法

  1. 采用与步骤 1.1 相同的程序培养和分化 C2C12 贴壁细胞。
  2. 按如下方法配制 10 mM DPIP 储存液：将 0.029 g DPIP（分子量：290.08 g/mol）溶解于 10 mL 去离子 H2O 中。使用分光光度计在 600 nm 处测定吸光度以确认 DPIP 浓度，还原型 DPIP 在 600 nm 处的消光系数为 1 mM-1 cm-1 23。4 °C 保存。
  3. 将 0.0108 g 葡萄糖加入 11.880 mL PBS 中，终浓度为 5 mM；再加入 120 µL 10 mM DPIP，终浓度为 100 µM。
  4. 当监测抗坏血酸在 tPMET 中的作用时，将溶液均分为两份，每份 6 mL。向其中一份加入 6 µL 去离子 H2O，向另一份加入 6 µL 2 kU/mL AO，终浓度为 2 U/mL。
  5. 当监测超氧阴离子在 tPMET 中的作用时，将溶液均分为两份，每份 6 mL。向其中一份加入 55 µL 0.1 M KPO4 缓冲液，向另一份加入 55 µL 6.5 kU/mL SOD，终浓度为 60 U/mL。
  6. 吸除培养基，用 150 µL PBS 洗涤细胞。吸除 PBS 后，在 96 孔板中向第 1–6 列加入 100 µL DPIP 溶液（-）SOD 或（-）AO，向第 7–12 列加入 100 µL DPIP 溶液（+）SOD 或（+）AO。使用 G 和 H 行作为背景对照（i.e.，用于监测无细胞孔中试剂自身吸光度的变化）。
  7. 使用分光光度计每 10 分钟测定一次 600 nm 处的吸光度，持续 1 小时。参照步骤 1.9–1.13 的方法，在 60 分钟时相对于对照定量吸光度的变化。

3. 确定还原型电子受体是否为 AO 或 SOD 的底物

  1. 向 5.436 mL 的 PBS 或 HBS 中加入 240 µL 的 10 mM WST-1，终浓度为 400 µM，以及 24 µL 的 5 mM PMS，终浓度为 20 µM。
    1. 对于 DPIP，向 5.940 mL 的 PBS 或 HBS 中加入 60 µL 的 10 mM DPIP，终浓度为 100 µM。
  2. 将 100 µL 溶液加入无细胞的平底 96 孔板的每个孔中，并在分光光度计中于 438 nm（WST-1）或 600 nm（DPIP）处测定吸光度。
  3. 向一半的孔中加入 1 µL 的 10 mM 抗坏血酸，终浓度为 100 μM。监测吸光度直至其稳定。
  4. 待吸光度稳定后，向每个孔中加入 1 µL 的 200 U/mL 抗坏血酸氧化酶（AO），终浓度为 2 U/mL，或加入 1 µL 的 6 kU/mL 超氧化物歧化酶（SOD），终浓度为 60 U/mL，并持续监测吸光度 1 小时。

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结果

采用 RStudio 统计软件进行重复测量方差分析（ANOVA）进行统计学分析25。样本量在图注中予以标明。

为监测跨质膜电子传递（tPMET），实验采用C2C12成肌细胞管状结构，并结合细胞外电子受体WST-1和DPIP。使用抗坏血酸氧化酶（AO）以确定WST-1和DPIP还原中由抗坏血酸外排所贡献的部分，使用超氧化物歧化酶（SOD）以确定WST-1还原因细胞外超氧阴离子释放所占的部分。如图2所示，C2C12成肌细胞管状结构能够进行tPMET，表现为WST-1的还原。加入AO后，WST-1的还原被抑制约30%，表明约30%的tPMET由抗坏血酸外排所致（图2A）。加入SOD后，WST-1的还原被抑制约70%，表明约70%的tPMET由细胞外超氧阴离子释放所致（

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讨论

我们介绍了两种利用细胞外电子受体WST-1和DPIP的分光光度法检测技术，用于监测C2C12成肌细胞中的跨质膜电子转移（tPMET）。通过标准培养方法培养细胞系，并使用分光光度计微孔板读板仪，即可在简单的微孔板检测中利用这些电子受体监测tPMET。WST-1的还原反应在同一次检测的各个孔之间具有良好的重复性，但存在日间变异。以PBS作为缓冲液时，日间变异系数（CV）为0.18；以HBS作为缓冲液时，CV为0.23。

根据先前使用 mPMS 和 WST-1 的文献，我们对该方案进行了修改，特别是针对 PMS 的使用。因此，故障排查包括确定适用于所述肌管细胞的 PMS 和 WST-1 的合适浓度。我们还发现，温度（在 23–37 °C 范围内）对该检测并非关键因素，而在每次吸光度读数前振荡培养板则十分重要。然而，这些因素在将该检测应用于其他细胞系时仍需进一步验证。关于 SOD 和 AO 能够直接氧化还原型 WST-1 的研究结果提示，在故障排查过程中，对新检测组分是否具有此类性质进行筛选是一个关键环节。

我们的数据表明，应将PMS...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Thomas Bell、Lyn Mattathil、Mark Mannino 和 Neej Patel 提供的技术支持。本研究由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）通过美国公共卫生服务奖 R15DK102122 资助 Jonathan Fisher。本论文的内容完全由作者负责，不一定代表 NIDDK 或美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C2C12 成肌细胞American Type Culture Collection CRL-1772
杜氏改良伊格尔培养基 - 低葡萄糖SigmaD6046
胎牛血清动物血清复合物Gemini Bio-Products 100-602
青霉素-链霉素Sigma516106
马血清Gibco Technologies16050-130
杜氏磷酸盐缓冲液SigmaD8537
胰蛋白酶-EDTASigmaT4049
15 cm 培养皿TPP93150
96 孔培养板TPP92096
2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑钠盐 (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
吩嗪硫酸甲酯 SigmaP9625
L-抗坏血酸SigmaA5960
抗坏血酸氧化酶 SigmaA0157
超氧化物歧化酶 SigmaS5395
2,6-二氯靛酚钠盐 ICN Biomedicals215011825
D-(+)-葡萄糖SigmaG7528
HEPES 钠盐SigmaH3784
氯化钠SigmaS7653
氯化钾Fisher Scientific BP366
七水合硫酸镁SigmaM5921
二水合氯化钙SigmaC7902
磷酸钾Fisher Scientific BP363
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒Thermo Scientific23225
Powerwave X-I 分光光度计Biotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 分光光度计Thermo Scientific336001
PureGrade 96 孔微孔板，F 型底，透明，未处理，非无菌MidSci781602
四水合氯化亚铁Sigma220299
七水合硫酸亚铁Sigma215422
次黄嘌呤SigmaH9636
黄嘌呤氧化酶SigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

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