本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。
本文内容
摘要
摘要
吞噬作用在宿主防御以及组织发育和维持中发挥关键作用，其过程涉及肌动蛋白细胞骨架的快速、受体介导的重排，以捕获、包裹并内吞大颗粒物质。尽管已鉴定出吞噬受体、下游信号通路以及效应分子（如Rho GTP酶），但特定受体介导的吞噬事件中细胞骨架动态重塑的具体机制仍不明确。四十年前，通过扫描电子显微镜鉴定出两种不同的吞噬机制，分别以Fcγ受体（FcγR）介导和补体受体（CR）介导的吞噬作用为代表。免疫球蛋白G（IgG）包被的颗粒与FcγR结合后，会触发细胞膜伸出细长的突起，最初在颗粒周围形成所谓的吞噬杯，随后颗粒被完全包裹并内化至细胞内。相比之下，补体包被的颗粒在与补体受体结合后似乎直接“沉入”吞噬细胞内部。这两种吞噬模式——吞噬杯形成与“沉入”模式——已在文献中被广泛确立。然而，近年来有报道指出补体受体介导的吞噬作用也可能诱导多种膜突起，使两种模式之间的界限变得模糊。随着高分辨率成像技术的发展，亟需建立能够实时三维（三维）可视化特定吞噬受体如何介导单个颗粒摄取的吞噬实验方法。目前研究吞噬作用更常用的方法，例如终点法检测，无法捕捉颗粒与吞噬细胞界面发生的动态过程。本文中，我们描述了利用延时旋转盘共聚焦显微镜进行的吞噬实验，可实现对单个吞噬事件的三维成像。此外，我们还介绍了能够明确区分Fcγ受体介导或补体受体介导吞噬作用的成像实验方法。
引言
在梅奇尼科夫观察海星幼虫中吞噬性间充质细胞的二十年前，即1882年，以及随后提出吞噬作用理论1之前，恩斯特·海克尔已于1862年描述了掠食性海蛞蝓物种 Thetis fimbris（Tethys fimbria）血细胞对不溶性染料颗粒的吞噬现象（Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862）。他明确描述了细胞膜突起包裹颗粒的过程，这些颗粒随后被摄入胞质，并在细胞核周围聚集。一百多年后，Kaplan 的一项开创性研究提出，吞噬作用至少存在两种形态学上不同的机制2。Kaplan 通过扫描电子显微镜观察发现，小鼠腹腔巨噬细胞利用细长的膜突起接触并紧密包裹经 IgG 调理的绵羊红细胞，最初形成杯状结构。吞噬杯的形成依赖于肌动蛋白的聚合，因为可穿透细胞的真菌毒素细胞松弛素 B（已知可阻断肌动蛋白动态）能够抑制该过程3。相比之下，经补体调理的绵羊红细胞则似乎直接“沉入”巨噬细胞内，而无需形成明显的膜突起；尽管在某些图像中，可在下沉颗粒附近的局部区域观察到膜皱褶。与吞噬杯形成不同，补体受体介导的“沉入”过程对细胞松弛素 B 处理不敏感2。在 Kaplan 描述的实验中，补体调理是通过将免疫球蛋白 M（IgM）标记的绵羊红细胞与补体 C5 缺陷型小鼠的血清共同孵育完成的，这种方法可避免补体 C5 依赖的终末补体复合物引发的溶血。
卡普兰（Kaplan）所发现的吞噬作用的两种模式——吞噬杯形成与内陷吞噬——已成为该领域的公认观点4,5,6,7,8,9然而，Kaplan 的原始研究中所使用的超高分辨率图像2，以及Munthe-Kaas开展的一项类似研究 等10，仅能提供吞噬事件的快照。在最近的一篇综述中，Rougerie 等11 强调指出，FcγR介导和CR介导的吞噬作用之间的形态学差异仍有待阐明，此外，在补体受体介导的颗粒摄取过程中已观察到膜皱褶的形成2活细胞成像技术可对单个吞噬事件从颗粒捕获到内吞的全过程进行实时观察，结合基因修饰小鼠模型，将极大增进我们对吞噬细胞如何捕获并摄取颗粒的理解。一种可行的方法是采用快速原子力显微镜（AFM），该技术能够实现对活细胞表面超高清分辨率（10–20 nm）的形貌成像。近期，一种快速AFM系统12 已开发出一种适用于快速、低噪声成像细胞表面的技术。该技术的优势在于，能够在较短时间间隔（数秒）内连续测量活细胞的高分辨率形貌及力学参数，而扫描电子显微镜则需对细胞进行固定和临界点干燥处理，无法实现此类动态观测。另一种方法是延时三维共聚焦显微镜技术，该技术应用广泛，但在记录过程中存在光毒性和荧光漂白等限制因素。该方法具有高度的灵活性，可实现高空间分辨率的光学切片，并能利用多种荧光探针进行标记，包括基因编码的荧光蛋白，标记方式极为多样。本文描述了利用延时转盘共聚焦显微镜进行吞噬作用检测的方法，可实现对特定受体介导的吞噬事件的高时空分辨率动态观察。
方案
本方案遵循本单位人类研究伦理委员会以及动物护理指南的相关规定。
1. 分离小鼠腹腔常驻巨噬细胞
- 处死小鼠（3–4 月龄，性别不限）； 例如 C57BL/6 品系）通过过量挥发性麻醉剂异氟烷（isoflurane）实施安乐死>5% 空气）或二氧化碳13，随后实施颈椎脱位。麻醉诱导的成功可通过翻正反射的消失 readily 进行评估。14以及足爪回缩反射的消失。
- 用80%乙醇水溶液清洁小鼠腹部后，沿中线做皮肤切口，暴露下方的腹壁。
- 将一根24号塑料导管插入腹膜腔，用2×4.5 mL冰冷的不含钙的Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗腹腔2+ 和 Mg2+通过5 mL塑料注射器注入。注射时，保留约0.5 mL的HBSS残液（即注入5–4.5 mL，剩余0.5 mL），以防组织被吸入导管尖端，需将其排出。将抽吸所得的悬液转移至14 mL聚丙烯圆底管中，于300 × g离心 g 室温下持续6.5分钟。
注意：塑料导管的尖端为钝头，与针头相比，可最大限度地减少对腹腔内容物的损伤。通常在轻柔按摩腹部后，可从腹腔中回收约8 mL腹腔细胞悬液。 - 弃去上清液，将腹腔细胞重悬于1 mL不含碳酸氢盐的RPMI 1640培养基中，该培养基含有20 mM Hepes、10%热灭活胎牛血清以及抗生素（如青霉素（100 单位/mL）和链霉素（100 µg/mL），通过将100倍浓度的青霉素/链霉素以1:100比例稀释制备。这通常得到约6 × 106 细胞/毫升
注意：分离的腹腔细胞中约有30%为巨噬细胞，其余较小的细胞主要为淋巴细胞，尤其是B细胞。
2. 在通道载玻片中接种腹膜细胞
- 用移液器将细胞悬液上下吹打以减少结团后，移取100 µL 悬液加入预填充通道（体积，100 µL）纤维连接蛋白包被的通道载玻片（100 µL型通道的尺寸（长×宽×高）为：50 mm × 5 mm × 0.4 mm。
- 通过向通道载玻片的两个储液槽之一加入1 mL含血清的RPMI 1640（Hepes）培养基，倾斜载玻片，然后从下游储液槽中吸出培养基，以预填充腔室。图1).
- 通过向两个储液槽之一加入1–2 mL培养基，拧紧储液槽盖，然后用拇指有节奏地按压盖子以排出通道内的气泡或长条状空气，必要时可倾斜载玻片。排尽空气后，在移除盖子前，将未加盖（且含有培养基）的储液槽朝下倾斜载玻片，以避免空气被重新吸入通道。
- 通过向通道载玻片的两个储液槽之一加入1 mL含血清的RPMI 1640（Hepes）培养基，倾斜载玻片，然后从下游储液槽中吸出培养基，以预填充腔室。图1).
- 将接种有细胞的通道载玻片置于湿润的孵育盒中，在37℃下孵育2 h °无 CO 条件下的 C2 （CO2 由于HCO并非必需3-/CO2 缓冲体系被替换为HEPES。通道载玻片可方便地放置在可容纳八个载玻片的支架上。通常每只小鼠可制备6–8个载玻片，但也可制备10个或更多。
- 移去支架，将每张载玻片中的 RPMI 1640 (Hepes) 培养基更换为含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基，并补充 10% 胎牛血清以及青霉素/链霉素。
- 倾斜载玻片，先从下部储液池吸出培养基，再从上部储液池吸出培养基。随后，向其中一个储液池加入1 mL新鲜培养基，倾斜载玻片，待培养基流经通道后，从下游储液池吸出培养基。
- 完成此洗涤（更换培养基）步骤后，通过向其中一个储液池中加入 1 mL 培养基，填充通道载玻片。
注意：使用通道载玻片进行洗涤步骤在溶液置换和去除非黏附细胞方面非常简便且高效。注意，RPMI 1640（碳酸氢盐）培养基通常需预先在5% CO₂中孵育2 过夜以确保达到热平衡和pH平衡。
- 在 37℃ 下将细胞孵育过夜 °在含5% CO₂的湿润化培养箱中2次日进行实验。
3. 人红细胞的分离
- 在第2天（实验的第二天；分离的腹腔巨噬细胞过夜孵育后），从健康供体采集1–2 mL外周静脉血至含肝素的试管中。取1 mL转移至圆底2.0 mL（聚丙烯）微量离心管中，在18℃下以300 × g离心5分钟 °C（经验设定），并移除上清液（血浆和白细胞层）。
- 轻轻吸出100 µ将沉淀的红细胞取 L，与等体积的改良 RPMI 1640 (Hepes) 培养基（如下所述）在圆底 2.0 mL 微量离心管中混匀。标记该管 "1:1".
注意：在分离细胞后第2天（用于实验）所使用的RPMI 1640（Hepes）培养基中，除含有10%热灭活胎牛血清外，还包含青霉素（100单位/mL）、链霉素（100 µg/mL）和 1 mM N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸（以减少光毒性）。此后，该培养基简称为 "改良的" RPMI 1640 (Hepes) 培养基 - 移液器 4 µ将1:1稀释的红细胞悬液各1 L加入预先分装于2.0 mL微量离心管中的2 mL改良RPMI 1640（Hepes）培养基中（重复此步骤， 即 准备2个管子）。标记每根管子 "4:2000". 放置 "1:1" 和 "4:2000" 冰上放置的试管。
4. 巨噬细胞质膜的标记
- 从 CO₂ 培养箱中取出已接种的通道载玻片2 孵育箱中，将每张载玻片中的 RPMI 1640（碳酸氢盐）培养基更换为改良 RPMI 1640（HEPES）培养基。随后，将细胞置于 37 ℃ 湿润 chamber 中 °C 在无 CO 的情况下2.
注意：经过过夜孵育和洗涤后，大部分淋巴细胞被从通道中去除。剩余的贴壁细胞主要为巨噬细胞，可通过形态学特征或使用抗F4/80抗体进行免疫荧光染色来鉴定。约95%的小鼠腹腔常驻巨噬细胞为F4/80阳性。 - 将荧光绿色标记的抗小鼠 F4/80 抗体（储存于 4 °C）用 PBS 稀释至 1 μg/mL °C) 1:40 稀释于改良 RPMI 1640 (Hepes) 培养基中。取一张载玻片，倾斜放置，用移液器逐滴加入 100 µ将抗体混合物的 L 加入 100 的开口中 µ载玻片的L通道（参见 图1吸出流入下游储液槽的培养基。将细胞在37℃下孵育20分钟。 °C（加湿环境，无CO₂）2在孵育期间，标记人红细胞（见第5节）。
注意：如上所述，CO2 由于HCO3-/CO2 缓冲体系被替换为 Hepes。 - 孵育20分钟后（此期间人红细胞被染色并完成调理），向其中一个储液池中加入1 mL改良RPMI 1640（Hepes）培养基，倾斜载玻片使培养基流经通道，随后吸出废液以洗涤载玻片。加入1 mL培养基用于短期保存，或直接进行后续实验。即， 通过移液加入包被的红细胞颗粒，并利用延时旋转盘共聚焦显微镜成像吞噬过程。
5. 人红细胞质膜的标记
- 在将巨噬细胞爬片与绿色荧光标记的抗F4/80抗体孵育后（第4.2节之后），立即开始人红细胞的标记。轻轻混匀后，取400 µL 来自其中一个 "4:2000" 试管（见第3.3节），并将其分装至一个（圆底）2.0 mL 微量离心管中。静置一段时间，使悬液温度升至约37 °C（见下文段落）。加入0.4 µL 橙红色荧光质膜染料（分装后于 -20 ℃ 保存） °℃），混合并在37℃孵育 °C，5 分钟。
注意：在准备载玻片时，将加热的铝块放置于超净工作台内，有助于减少热量散失。试管可插入加热块的孔洞中，另设或集成的加热铝板可用作操作工作面。 - 5分钟孵育期后，通过加入1600 μL预冷的DPBS开始第一次洗涤步骤 µL-修饰的RPMI 1640（Hepes）培养基（用于填充2.0 mL微量离心管）。
- 将试管以 300 x g 5 分钟，18 °C（经验设定）。管壁上应可见一个致密的红色沉淀物。即， 将管底的沉淀物（位于偏心位置）旋转至朝上，使用1–1.5 mL移液器吸头分两步依次小心吸除全部上清液。
- 吸去上清液后，加入 2,000 µL-修改的 RPMI 1640（Hepes）培养基，混合（用于重悬细胞），并重复上述离心和吸除上清液步骤。
- 将沉淀（经血浆膜染色并洗涤两次的红细胞）重悬于 400 µL 的改良 RPMI 1640（Hepes）培养基。将试管标记为 PMS（质膜染料的缩写）。
注意：也可使用对 pH 敏感的罗丹明衍生物的琥珀酰亚胺酯（在酸性 pH 下荧光更强）来标记人红细胞。在此情况下，荧光强度还可作为颗粒内化后吞噬体成熟的指标。
6. 使用小鼠免疫球蛋白 G（IgG）对人红细胞进行调理（标记）
- 向标记为 PMS 的试管（参见第 5.2–5.5 节）中加入 1 µL 小鼠（IgG2b）单克隆抗体（克隆 HIR2）抗人 CD235a（1 mg/mL，储存于 -20 °C），该试管中含有悬浮于 400 µL 培养基中并经质膜染色的人红细胞。CD235a（亦称为血型糖蛋白 A）是一种红系谱系特异性的膜唾液酸糖蛋白。
- 在 37 °C 下孵育 8 分钟。请注意，用人 IgG 包被人红细胞会导致凝集（细胞成团）。尽管凝集可作为包被的视觉指示，但其不利于单个吞噬效应的成像。为避免凝集，可使用例如设定为 200 µL 的可调 20–200 µL 移液器，每隔 1 分钟反复混匀细胞悬液。
- 在 8 分钟孵育即将结束时，如需要，可用 1 mL 改良 RPMI 1640（Hepes）培养基洗涤已与绿色荧光标记的抗 F4/80 抗体孵育的巨噬细胞载玻片。洗涤步骤后，确保通道载玻片的两个储液池中均无残留培养基。
7. 成像经质膜染色和IgG包被的人红细胞的吞噬作用
- 在与抗-CD235a抗体孵育8分钟后（第6.2节），用移液器将含有质膜染色且经IgG调理的人红细胞的100 µL悬液加入到已接种有绿色荧光标记抗F4/80抗体的巨噬细胞的通道玻片中（步骤4）。因此，将红色荧光、经IgG调理的人红细胞加入至绿色荧光的吞噬细胞（巨噬细胞）中。
- 一旦加入人红细胞，立即将通道玻片安装至旋转盘共聚焦显微镜上（载物台培养箱设定为37 °C），开始成像，例如使用60倍/1.49数值孔径的油浸物镜。应尽快开始成像，因为颗粒在1分钟内即开始沉降。
注意：使用直径为100 nm的荧光微球，我们通过点扩散函数分析测得XY方向的分辨率分别为x = 0.22 µm、y = 0.23 µm（488 nm激光）和x = 0.27 µm、y = 0.27 µm（561 nm激光）。然而，为了减少活细胞时间序列三维成像过程中的光漂白和光毒性，我们采用2×2像素合并（binning）以牺牲空间分辨率为代价。像素合并可提高灵敏度（改善信噪比）和允许更高的帧率，但会降低空间分辨率。 - 使用完美对焦系统（或类似系统）以防止记录过程中焦点漂移。激活完美对焦系统后，使用偏移控制将焦点对准通道玻片盖玻片（见下文注释）上方的巨噬细胞片状伪足突出部分。此焦点水平对应Z = 0 µm。以0.8 µm为步长，采集从-1 µm到+16 µm的Z轴层扫图像，共22个Z层面。例如，可每15秒采集一次Z栈（每个通道），持续16分钟。
注意：较长的记录时间会因光漂白而导致图像质量下降。对两个通道分别采集Z栈：使用488 nm激光（绿色通道）成像巨噬细胞，使用561 nm激光（红色通道）成像人红细胞。通过该方法，可获得巨噬细胞在不同时间点吞噬IgG调理人红细胞的多种视图（例如，参见图2）。
注意：系统典型设置（采用2×2像素合并）如下：绿色通道（激光功率20.5%（50 mW；488 nm），灵敏度101（范围0–255），曝光时间200 ms）；红色通道（激光功率10.5%（50 mW；561 nm），灵敏度101（范围0–255），曝光时间98 ms）。
注意：通道玻片的底部为一种聚合物材料，其厚度与#1.5玻璃盖玻片相同，光学性质也与玻璃相似，但值得注意的是，该材料具有气体通透性的优势。
8. 成像经质膜染色并包被补体的人红细胞的吞噬作用
- 用补体调理经质膜染色的以及经IgG调理的人类红细胞，方法与第5和第6节类似，但与第3.3节所述不同：不是将4 µL 1:1稀释的红细胞悬液加入2 mL改良RPMI 1640（Hepes）培养基中，而是将4 µL加入1 mL改良RPMI 1640（Hepes）培养基中，并相应地将试管标记为4:1,000。因此，人类红细胞的浓度提高了一倍。
- 继续执行第4和第5节中的步骤，但起始使用4:1,000稀释度而非4:2,000稀释度的人类红细胞储备液（4:1,000和4:2,000指的是第3.1和3.2节中所述初始1:1稀释的人类红细胞的后续稀释倍数）。
- 通过吸入>> 5%异氟烷（空气中浓度）并随后断头处死C5缺陷型小鼠（e.g., B10.D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ；Jackson Laboratory），收集血液。我们通常在吸入异氟烷并断头后立即滴入约0.8 mL血液至一个圆底14 mL塑料管中。
- 1小时后，当血液完全凝固时，将剩余液体转移至一个2.0 mL微量离心管中，在室温下以300 x g离心5分钟。随后，小心收集淡黄色血清。通常，我们可获得至少200 µL的C5缺陷型血清。将C5缺陷型血清置于冰上。
- 在质膜染色的人类红细胞与IgG孵育4分钟后，再加入1 µL抗CD235a抗体（终浓度为2倍浓缩），然后取50 µL细胞悬液，与另一个2.0 mL微量离心管中含有的50 µL C5缺陷型血清混合。继续像第6.2节中那样，通过上下吹打每1分钟重复混匀一次，持续4分钟。因此，经过此步骤后，人类红细胞与抗CD235a抗体的总孵育时间达到8分钟。
注：与C5缺陷型血清孵育4分钟足以激活经典补体级联反应，并使人类红细胞被C3b调理，随后C3b被因子I裂解为iC3b。
9. 人红细胞IgG和C3b包被的确认
- 通过将人红细胞与偶联绿色或红色荧光染料的羊抗小鼠（二抗）IgG抗体孵育，确认人红细胞是否已被小鼠抗CD235a IgG（IgG2b；见第6.1节）抗体调理。
- 向400 µL人红细胞悬液中加入1 µL小鼠抗CD235a IgG抗体和1 µL荧光标记的抗小鼠二抗，37 °C孵育8分钟。随后洗涤两次（方法见第5.2–5.5节）。
- 用400 µL改良RPMI 1640（Hepes）培养基重悬细胞沉淀，取100 µL悬液加入通道载玻片（见图1C），用于共聚焦荧光成像。
注意：洗涤并重悬后细胞会出现聚集（凝集），但洗涤步骤对于降低未结合二抗造成的背景荧光是必要的。
- 使用例如大鼠抗小鼠C3b/iC3b/C3c抗体及相应的二抗（如偶联绿色荧光染料的羊抗大鼠IgG抗体），对预先标记了小鼠IgG并经C5缺陷小鼠血清孵育的人红细胞，确认其是否被C3b/iC3b调理。
- 使用未染色的人红细胞重复第8节中的步骤。
- 向100 µL混合液（50 µL IgG标记的人红细胞 + 50 µL C5缺陷小鼠血清）中加入0.25 µL荧光标记的抗小鼠C3b/iC3b/C3c抗体，37 °C孵育8分钟。
- 洗涤两次，将沉淀用100 µL改良RPMI 1640（Hepes）培养基重悬，并将悬液转移至通道载玻片（见图1C），用于共聚焦荧光成像。
结果
用于延时旋转共聚焦显微镜成像观察吞噬作用的通道式载玻片示意图见图1。人红细胞（hRBCs）用红色荧光质膜标记物CellMask Orange染色，而分离的小鼠腹腔常驻巨噬细胞（Ms）则用绿色荧光Alexa Fluor 488标记的抗F4/80抗体标记（图2），该抗体既作为小鼠巨噬细胞的特异性标志物，也用于标记质膜。人红细胞可通过与IgG（或IgM）抗CD235a抗体共孵育而被小鼠IgG（mIgG）或小鼠IgM（mIgM）调理；CD235a又称血型糖蛋白A，是人红细胞特异性表达的蛋白。通过延时三维成像观察绿色荧光巨噬细胞与红色荧光人红细胞的相互作用，可实现对单颗粒吞噬事件的可视化（图2）。对单个吞噬事件的细致观察可揭示颗粒捕获与摄入过程的细节。例如，可观察到巨噬细胞的丝状伪足（一种细长的指状突起）捕获经mIgG调理的人红细胞的过程（图3A；另见Horsthemke et al.15）。此外，还可观察到人红细胞在吞噬杯形成过程中的挤压现象（图3A）。当加入新鲜小鼠血清后，经mIgG或mIgM调理的人红细胞可激活经典补体级联反应，最终形成溶血性膜攻击复合物。通过使用CellMask Orange与Calcein双标记染色并进行成像，可测量补体介导溶血的动力学过程。在溶血过程中，绿色荧光胞质染料Calcein会迅速从细胞中释放（图3B）。
图1：纤维连接蛋白包被通道载玻片的操作。（A）通道载玻片由两个储液池通过一个尺寸为 50 mm × 5 mm × 0.4 mm 的通道连接而成。初始时可通过向其中一个储液池加入 1–2 mL 培养基并倾斜载玻片来预充满通道。（B）可在孵育前将盖帽安装至储液池上。这些盖帽可方便地用于在向通道接种细胞前排出不需要的气泡。（C）可通过直接将培养基用移液器加至通道口，从而填充无气泡的 100 µL 通道。此步骤可用于例如将巨噬细胞接种到载玻片中，或加入荧光素（绿色荧光）标记的抗 F4/80 抗体，后者既可作为膜标记物，也可作为小鼠巨噬细胞的标志物。（D）将颗粒（如调理素化的人红细胞）加入已接种荧光标记巨噬细胞的通道后，可将载玻片置于倒置显微镜载物台上，进行延时旋转盘共聚焦显微成像。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：吞噬作用的时间推移3D成像。（A）示意图显示经血浆膜染色（红色荧光）的人类红细胞（hRBCs）通过小鼠抗CD235a免疫球蛋白G（mIgG）抗体进行调理，并将标记的hRBCs呈递给经绿色荧光染料偶联的抗F4/80抗体标记（绿色荧光）的小鼠巨噬细胞（Ms）。（B）通过转盘共聚焦显微镜获取的时间推移图像（XZ视图），显示mIgG调理的hRBCs形成吞噬杯并被吞噬的过程。比例尺 = 10 µm。（C）3D重建图像显示巨噬细胞吞噬mIgG调理的hRBCs。对应的三个时间点的XZ视图见B。网格间距为5.07 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：丝状伪足捕获颗粒的过程。 通过转盘共聚焦显微镜获取的延时图像，显示小鼠巨噬细胞通过丝状伪足（上图中的箭头所示）这一指状突起，捕获经小鼠免疫球蛋白G（mIgG）包被的人红细胞（hRBC）。请注意，在吞噬杯形成早期，红细胞即失去其锯齿状边缘。此外，吞噬杯似乎对包裹的红细胞产生挤压作用（下图箭头所示）。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
绝大多数吞噬作用检测方法，尤其是终点法和高通量检测方法，无法可视化颗粒被实际捕获、包裹和内化的过程。20世纪70年代，Munthe-Kaas 等10 和 Kaplan2 的开创性研究指出，在IgG调理化颗粒与补体调理化颗粒（如绵羊红细胞）的吞噬过程中，细胞骨架发生了显著不同的重组。本文中，我们描述了利用转盘共聚焦显微镜进行的吞噬作用检测方法，可实现对单个吞噬事件的高分辨率、实时成像。我们的模型吞噬细胞为小鼠腹腔常驻巨噬细胞，该细胞易于分离且操作最少，我们使用新鲜分离的人红细胞作为颗粒。然而，该吞噬检测方法也可适用于其他吞噬细胞，例如小鼠骨髓来源的巨噬细胞或中性粒细胞、小鼠巨噬细胞系、人单核细胞来源的巨噬细胞或人外周血中性粒细胞。对于人吞噬细胞或小鼠中性粒细胞，需使用其他荧光标记抗体，例如荧光标记的抗CD14抗体（人单核细胞/巨噬细胞）16 或抗Gr-1（Ly-6G）抗体（小鼠中性粒细胞）。
未致敏的人类红细胞与传统使用的绵羊红细胞类似，在某种程度上是惰性的，因为这些细胞通常不会（或极少）被小鼠腹腔巨噬细胞吞噬。这确保了与聚苯乙烯微球相比具有较低的背景活性。可方便地使用针对CD235a（血型糖蛋白A）的小鼠IgG或IgM单克隆抗体对人类红细胞进行免疫球蛋白致敏，CD235a是人类红细胞（红血球）及红系前体细胞的特异性标志物17,18。在平行实验中，可应用荧光标记的抗小鼠IgG或IgM二抗以确认致敏效果。IgG和IgM抗体类别属于血凝素，即能够引起红细胞凝集的物质（抗体）。为避免凝集，在与抗CD235a抗体孵育的8分钟期间，我们间歇性地混匀细胞悬液，随后将混合后的悬液直接加入含巨噬细胞的通道载玻片（纤维连接蛋白包被的载片）中，无需洗涤步骤。洗涤步骤通常需要通过离心使红细胞沉淀，而这会显著促进凝集反应的发生。在对人类红细胞进行致敏之前，我们使用一种亲脂性的橙红色荧光探针标记其质膜。该探针在延时成像开始时荧光强烈，但信号会逐渐减弱，可能主要归因于光漂白19。此外，在成像过程中，巨噬细胞以及载玻片上的纤维连接蛋白涂层也可能呈现微弱的橙红色荧光。这一问题可能源于红细胞标记后洗涤不充分。除了使用亲脂性荧光质膜标记物外，还可利用其胺反应性琥珀酰亚胺酯将人类红细胞标记一种pH敏感型罗丹明衍生物15,20。这种方法的优势在于可实现吞噬体成熟过程的可视化，因为荧光强度随pH降低而增强15,20；但其缺点在于，此类活性酯制剂目前价格昂贵，且在水溶液中重组后不稳定。
经IgG包被的人红细胞通过Fcγ受体（FcγR）被吞噬，这一过程可使用从NOTAM21或Fcer1g-/-（Fcer1g基因敲除）小鼠分离的腹腔巨噬细胞加以验证。NOTAM巨噬细胞能够结合IgG包被的人红细胞，但缺乏诱导吞噬作用所必需的ITAM（基于免疫受体酪氨酸的活化基序）介导的信号通路；而Fcer1g基因敲除巨噬细胞则不表达表面Fcγ受体。IgG或IgM包被的人红细胞可通过与补体C5缺陷型小鼠的新鲜分离血清孵育，进一步包被C3b（随后被裂解为iC3b）（野生型血清会引起溶血）。包被抗体IgG和IgM可激活经典补体级联反应，导致膜攻击复合物（孔道结构）形成并引发细胞裂解。在缺乏补体C5的小鼠中，补体级联反应可进行至补体C3的裂解，但C5转化酶因缺乏底物而无法催化终末通路。我们开发了简单的检测方法以测量补体级联反应的动力学。简而言之，人红细胞可同时用红色荧光的质膜标记物和绿色荧光的胞质荧光染料进行标记。当由补体成分C5-C9形成的膜攻击复合物产生时，胞质荧光染料会在数秒内迅速从胞质中丢失。对补体级联反应终末效应（细胞溶解）功能的观察表明，4分钟的孵育时间足以实现人红细胞的C3b/iC3b包被。在平行实验中，可通过加入抗小鼠C3b抗体与荧光标记的二抗混合物后，简便地评估人红细胞表面C3b/iC3b的包被情况。此情况下需进行洗涤步骤以去除未结合的荧光抗体。尽管洗涤步骤涉及通过离心使细胞沉淀，可能促进凝集，但仍可通过共聚焦显微镜清晰评估包被效果。补体受体介导的吞噬作用可通过将IgG/iC3b包被的人红细胞施加于NOTAM或Fcer1g-/-巨噬细胞，或将IgM/iC3b包被的人红细胞施加于野生型巨噬细胞来进行成像观察。IgM包被的血细胞不能被含有ITAM的Fcγ受体（FcγRI、FcγRIII和FcγRIV）识别，因此无法介导IgG包被颗粒所依赖的吞噬作用22。
为观察吞噬事件，可用绿色荧光染料标记的抗F4/80抗体对巨噬细胞的质膜进行标记，该抗体同时也是小鼠巨噬细胞的特异性标志物。如上所述，人红细胞可通过与橙色/红色荧光质膜染料孵育而呈现红色荧光。这种亲脂性质膜染料可避免基于抗体标记可能带来的干扰效应。经或未经调理的红色荧光人红细胞可直接用移液器加入通道载玻片的100 µL通道中，并使用转盘共聚焦（或类似）显微镜，分别采用488 nm和561 nm激光线，通过60X/1.49油浸（或类似）物镜进行三维时间序列成像。尽管高分辨率成像具有吸引力，但在约16分钟内重复采集Z轴堆栈图像可能导致显著的光漂白和光毒性。我们选择使用2×2 binning模式，以提高信噪比，并允许降低激发光强度和/或曝光时间，尽管会牺牲光学分辨率。此外，为减少光毒性，我们在培养基中添加活性氧清除剂。在后续研究中，该检测方法可进一步改进以用于成像人红细胞凋亡后的吞噬过程。Ca²⁺2+ 离子载体（如 A23187）可用于诱导磷脂酰丝氨酸外翻23，一个 "吃我" 早期凋亡的信号与标志24,25.
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG，Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，项目编号为 HA 3271/4-1 和 HA 3271/4-2，以及由 DFG 资助的卓越集群 1003（EXC 1003，“运动中的细胞”，Cells in Motion，CiM）项目编号 FF-2016-05 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 G 塑料导管 | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | 用于腹腔灌洗 |
| 不含 Ca’s 缓冲盐溶液2+ 和 Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | 用于腹腔灌洗 |
| 14 mL 聚丙烯圆底管 | BD Falcon | 352059 | 用于收集腹腔细胞 |
| 含 20 mM Hepes 的 RPMI 1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R7388 | 检测的基础培养基 |
| 热灭活胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | 用作 RPMI 1640 培养基的补充物 |
| 100 倍浓度的青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 用作 RPMI 1640 培养基的补充物 |
| 纤维连接蛋白包被的 µ-Slide I 型腔室载片 | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | 用于检测的通道式载片 |
| µ-Slide（阳极氧化铝）支架 | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | 可高压灭菌的可堆叠通道载片支架 |
| 含碳酸氢盐的 RPMI 1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | 用于过夜培养的培养基 |
| N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸 | Sigma-Aldrich | M6635 | 活性氧清除剂 |
| Alexa Fluor 488 标记的大鼠（IgG2a）单克隆（克隆号 BM8）抗小鼠 F4/80 抗体 | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | 小鼠巨噬细胞标志物及质膜标记物 |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | 红色荧光质膜染料 |
| pHrodo 的琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fisher Scientific | P36600 | pHrodo 的胺反应性琥珀酰亚胺酯 |
| 小鼠（IgG2b）单克隆（克隆号 HIR2）抗人 CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | 用于用人 IgG 包被人红细胞 |
| Alexa Fluor 594 标记的 山羊抗小鼠（二抗）IgG 抗体 | Abcam | Ab150116 | 用于确认人红细胞被小鼠 IgG 包被 |
| 大鼠抗小鼠 C3b/iC3b/C3c 抗体 | Hycult Biotech | HM1065 | 用于确认人红细胞被 C3b/iC3b 包被 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗大鼠 IgG 抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | 作为二抗用于确认 C3b/iC3b 包被 |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 用于将 Calcein 负载至人红细胞 |
| UltraVIEW Vox 3D 活细胞成像系统 | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | 转盘共聚焦显微镜系统 | |
| Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜 | Nikon, Japan | 倒置显微镜 | |
| CSU-X1 转盘扫描仪 | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow 转盘单元 | |
| 14 位 Hamamatsu C9100-50 电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）帕尔贴冷却相机 | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | 转盘共聚焦显微镜系统的 EM-CCD 相机 | |
| 488 nm 固态激光器，50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | 转盘共聚焦显微镜系统的 488 nm 激光光源 | |
| 561 nm 固态激光器，50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | 转盘共聚焦显微镜系统的 561 nm 激光光源 |
参考文献
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