已有研究表明，脑内区域的瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）在脑功能中发挥一定作用。本文介绍了一种在小鼠中通过脑室内注射树脂毒素以实现脑内TRPV1去敏感化的实验方案。同时，还提供了若干疼痛检测实验的操作步骤。
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摘要
摘要
瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）是一种对温度敏感的阳离子通道，已知可引发外周神经中的疼痛反应。除了其在外周的功能外，TRPV1参与脑功能的作用也已被提出。树脂毒素（Resiniferatoxin, RTX）是一种极强效的TRPV1激动剂，已知可诱导TRPV1的长期脱敏，而这种脱敏已成为研究表达TRPV1细胞生理相关性的替代方法。本文描述了一种在小鼠中进行脑室内（i.c.v.）注射RTX的实验方案。随后介绍了检测外周TRPV1刺激（RTX测试）和机械刺激（尾部压力测试）所致伤害感受的实验操作流程。尽管接受脑室内注射RTX的小鼠对外周刺激的伤害感受反应与对照组相当，但这些小鼠对对乙酰氨基酚的镇痛作用不敏感，提示脑室内给予RTX可诱导中枢神经系统选择性的TRPV1脱敏。该小鼠模型可作为研究TRPV1在脑/高级中枢功能中作用的便捷实验体系。这些技术也可应用于其他药物中枢作用的相关研究。
引言
动物通过外周神经上的感受器接收来自环境的各种物理和化学刺激。瞬时受体电位香草素亚型1（TRPV1）是一种热敏感的非选择性阳离子通道，可作为温度感受器1,2，已知在正常和炎症状态下，TRPV1的激活和/或调节是伤害性感受的关键步骤3。尽管其整体表达模式尚存争议，但已有研究提示TRPV1在脊髓上区域也有表达，并参与多种脑功能活动（包括伤害性感受4、体温调节5、焦虑6、注意缺陷多动障碍7和癫痫8）。此外，最近有研究表明，广泛使用的止痛药对乙酰氨基酚可通过激活中枢TRPV1来发挥其镇痛作用9,10。
向动物施用过量的TRPV1激动剂（包括辣椒素和树脂毒素（RTX））可导致TRPV1阳性神经元死亡，并对TRPV1激动剂产生持久性脱敏11,12。结合局部给药方式（鞘内13,14、小脑延髓池内15,16,17和神经节内18），这种化学消融方法为研究TRPV1的生理功能提供了替代手段。我们近期报道了脑室内（i.c.v.）注射RTX可抑制对乙酰氨基酚在小鼠中的镇痛作用，提示存在脊髓上选择性TRPV1脱敏效应19。在本论文中，我们提供了i.c.v.注射及后续疼痛检测的精确操作方案。
将药物直接注射到脑室中，可以在最小化外周效应的同时研究其中枢作用。本文介绍的脑室内（i.c.v.）注射方法是对Haley和McCormick20报道的方法进行的改良。该方法 操作简便，通过冠状缝插入注射针至侧脑室，无需任何特殊设备或手术插管操作。
外周局部应用TRPV1激动剂可引发烧灼样疼痛感和神经源性炎症。全身性给予RTX处理的小鼠以及TRPV1基因敲除小鼠对该刺激不敏感13。我们通过足底注射RTX（RTX试验）来确认RTX-i.c.v.小鼠外周TRPV1功能的保留情况。该方法是对传统福尔马林试验的一种改良21。
已有报道称，经RTX全身处理的小鼠以及TRPV1基因敲除小鼠对机械刺激的反应阈值正常11,13,22。本文介绍了一种用于检测对乙酰氨基酚镇痛效果变化的尾部压力测试方法。
这些方法均为常规且通用的技术，可应用于其他药物的研究。
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方案
本研究所采用的所有实验方案均经武藏野大学动物护理与使用委员会批准。雄性ddY小鼠（SLC，日本静冈）在实验前于12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养至少7天，自由饮水并随意进食。实验使用5周龄或6周龄的小鼠。
1. 药物的制备
- RTX
注意：含酒精的 RTX 溶液可能导致严重的皮肤灼伤和眼部损伤。操作时务必佩戴橡胶手套和护目镜进行防护。该储备溶液可使用 6 个月。- 向 1 mg RTX 中加入 500 µL 乙醇。
- 向上述溶液中加入 500 µL 聚氧乙烯（20）山梨醇单油酸酯，并充分涡旋混匀。
- 向混合液中加入 4 mL 生理盐水，并充分涡旋混匀。
- 将溶液分装为每管 40 µL 至 1.5 mL 螺口管中，于 -40 °C 保存。
- 对乙酰氨基酚
- 用 20% w/v 丙二醇溶液配制浓度为 30 mg/mL 的对乙酰氨基酚溶液，并使用超声仪溶解。由于对乙酰氨基酚在溶解后数小时于室温下可能析出，因此应现用现配，或在使用前保持溶液温热。
2. RTX的皮下或脑室内注射
- 将上述步骤1.1中制备的储备液解冻，并用生理盐水或人工脑脊液（ACSF）稀释至20 µg/mL，ACSF的成分为（单位：mM）：119 NaCl、2.5 KCl、1 NaH2PO4、26 NaHCO3、11 葡萄糖、1.3 MgSO4、2.5 CaCl2，并用95% O2和5% CO2平衡（pH 7.2）。
- 使用戊巴比妥钠（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，并检查翻正反射是否消失。
- 对于皮下（s.c.）给药，将RTX（20 µg/mL）以0.1 mL/10 g体重的体积注射至小鼠颈背部。对照组以相同方式注射溶剂（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单油酸山梨醇酯和80%生理盐水）。
- 对于脑室内（i.c.v.）给药，向右侧脑室注射5 µL RTX（20 µg/mL）。对照组以相同方式注射溶剂（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单油酸山梨醇酯和80% ACSF）。
- 将一次性27号针头穿过金属套管（内径0.8 mm），使针头露出3.0–3.5 mm的尖端（图1A）。
- 用70%酒精对小鼠头部进行消毒，并用手指牢固夹住小鼠的鳞状骨（图1B）。
注：注意鳞状骨突起的位置，因为这些突起将作为注射的定位标志。 - 在头皮上横向移动针头，当针尖钩住矢状缝时即可定位该缝线。
- 将针尖向右移动约1 mm，再向前移动针尖，参照步骤2.4.3的方法定位冠状缝（图1B）。
- 缓慢垂直插入针头，约10秒内注入RTX溶液，随后留针约10秒。
- 缓慢拔出针头，将小鼠放回其饲养笼。通常出血极少或无出血。若发生明显出血，应考虑更换另一只小鼠。
- 将预处理后的小鼠分配为RTX测试或尾部加压测试的实验对象（分别对应步骤3和4）。
3. RTX 检测
注意：测试在上午10:00至下午5:00之间进行。测试房间的光照强度保持在200勒克斯，温度保持在24-26 °C。
- 在使用RTX进行预处理后一周（步骤2.），将小鼠转移至测试室，至少在测试开始前60分钟放入。
- 在测试开始前至少30分钟，称重后将每只小鼠单独放置于一个有机玻璃笼子（29.5 × 17.5 × 13.5 cm3 高度）中，以适应环境。
注意：不同预处理组之间的测试顺序应进行交叉平衡。 - 在测试前20分钟，通过腹腔注射给予小鼠对乙酰氨基酚（300 mg/kg）。
- 将小鼠轻轻固定于小布袋中，将30号针头插入右后足的足跟部位，皮下推进针头至行走垫附近，注射20 µL RTX溶液（0.05 µg/mL）。
- 记录每5分钟时间段内，受累足部无毛区域舔舐或啃咬行为的持续时间。
4. 尾部压力测试
注意：使用Randall-Selitto型压力计评估急性机械性伤害感受的阈值。测试在上午10:00至下午5:00之间进行。测试房间的光照强度保持在200勒克斯，温度维持在24-26 °C。
- 在RTX预处理一周后（步骤2），将小鼠转移至测试室，称重后将每只小鼠单独放入一个聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）笼中。
- 在距尾根部1.5 cm和2.5 cm处做标记。
- 将小鼠松松地包裹在小布袋中，用钝头探针在标记处施加压力。
注意：设定250 g为压力上限，以避免组织损伤。 - 确定引发逃避行为（如甩尾、扭转和吱叫）所需的压力，并通过取两处测量压力的平均值计算伤害性感受阈值。
- 每15分钟重复一次步骤4.3至4.4。
- 获得基线数据后，向小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚（300 mg/kg）。给药后，每15分钟重复一次步骤4.3和4.4。
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结果
脑室内给药处理的小鼠在外观、自发活动、体重19和核心体温方面均未表现出明显异常（溶剂对照组：38.4 ± 0.3 °C，n = 6；RTX处理组：38.7 ± 0.2 °C，n = 6）。
图2A-B展示了皮下注射（s.c.）或脑室内注射（i.c.v.）处理的小鼠对足底注射RTX的反应性。溶剂处理小鼠在注射后前10分钟内表现出显著的舔咬行为19。尽管皮下预处理小鼠完全未表现出舔咬行为，但脑室内预处理小鼠对RTX足底注射仍表现出正常反应。此外，如图2B所示，腹腔注射对乙酰氨基酚（300 mg/kg）可减轻溶剂-脑室内处理小鼠的舔咬行为，但对RTX-脑室内处理小鼠的舔咬行为无明显影响。
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讨论
这些实验中最关键的步骤是脑室内注射（i.c.v.注射）的成功。此处使用的i.c.v.注射技术虽然较为简单，但需要一定的练习。在正式实验前，建议先使用染料（例如生理盐水中含0.5%台盼蓝）进行练习。如果注射操作正确，应在冠状缝处可见针尖痕迹，且注入的染料应出现在对侧脑室和第三脑室。此外，注射过程中应避免用力插入。若针尖正确放置于冠状缝位置，针头应能顺利穿透颅骨。
这种脑室内给药技术也可应用于清醒、未麻醉的小鼠，我们已报道过利用该技术检测药物的急性中枢作用23,24。尽管当前操作方法的优势在于无需特殊的插管设备，但脑室内注射仅能进行一次。若需重复给药，则必须进行插管处理。
本文介绍的RTX检测是一种易于使用的评估外周TRPV1功能的方法3,19。伤害性行为在注射1–10 ng RTX剂量时表现最为明...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 树脂毒素 | LKT Laboratories | R1774 | 用于皮下/脑室内预处理及RTX测试 |
| 对乙酰氨基酚 | IWAKI SEIYAKU | 由IWAKI SEIYAKU赠送 | |
| 戊巴比妥钠盐 | Tokyo Chemical Industry | P0776 | 用于麻醉 |
| 乙醇（99.5） | 和光纯药工业 | 057-00456 | 用于溶解RTX |
| 聚氧乙烯（20）山梨醇单油酸酯 | 和光纯药工业 | 161-21621 | 用于溶解RTX |
| 25 μL 微量注射器 | Hamilton | 1702LT | 用于脑室内注射 |
| 100 μL 微量注射器 | Hamilton | 1710LT | 用于足底注射 |
| 26号一次性针头 | TERUMO | NN-2613S | 用于脑室内注射 |
| 30号一次性针头 | NIPRO | 01134 | 用于足底注射 |
| 压力计 | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | 用于尾部加压测试 |
参考文献
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