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方法文章

从小鼠眼球中激光捕获显微切割高纯度小梁网用于基因表达分析

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DOI：

10.3791/57576

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2018年6月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种可重复的激光显微切割（LCM）实验方案，用于分离小梁网（TM）组织以进行后续RNA分析。对小梁网基因表达变化的分析能力将有助于理解与小梁网相关眼病的潜在分子机制。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）技术使得对组织切片中单个细胞及富集细胞群体的基因表达分析成为可能。LCM 是研究细胞分化以及包括青光眼在内的多种疾病发生与进展过程中分子机制的有力工具。青光眼是一组进行性视神经病变，是全球范围内导致不可逆性失明的最常见原因。小梁网（TM）内的结构改变和损伤可导致眼内压（IOP）升高，而眼内压升高是青光眼发病的主要危险因素。然而，其涉及的精确分子机制目前仍不明确。开展基因表达分析的能力对于深入理解这些细胞的功能及其在调控眼内压和青光眼发生中的作用至关重要。为此，需要一种可重复的方法，用于从小鼠眼球冷冻切片中分离高度富集的小梁网，并结合下游基因表达分析方法（如 RT-qPCR 和 RNA-Seq）进行研究。本文所述方法旨在从小鼠眼球中分离高纯度的小梁网，以用于后续的数字 PCR 和微阵列分析。此外，该技术也可轻松适用于分离其他难以从小鼠眼球中获取的高度富集的眼部细胞及细胞区室。LCM 与 RNA 分析的结合将有助于更全面地理解青光眼发生过程中的细胞事件。

引言

青光眼是一组以视神经病变和视网膜病变为特征的疾病，最终可导致不可逆的失明1,2据估计，到2020年，全球将有超过7000万人患有某种形式的该疾病3,4,5,6,7原发性开角型青光眼（POAG）是最常见的青光眼类型，其特征是房水（AH）外流减少，导致眼内压（IOP）升高8,9,10,11,12,13,143,15,16,17,18若不加以治疗，持续升高的眼内压（IOP）将导致视网膜和视神经乳头进行性且不可逆的损伤，最终引发放射状视野缺损。1,2,19目前所有延缓青光眼进展的方法均旨在降低眼内压（IOP），途径包括减少睫状体房水（AH）的生成速率或促进其外流1,8,9,10,11,12,13,14小梁网（TM）在主动调节主要的房水流出通路中起着至关重要的作用，其功能异常是高血压性青光眼的致病因素之一。1,2,19然而，与小梁网功能障碍相关的分子机制及其如何调控房水引流的过程尚未完全阐明，目前仍是青光眼研究的主要焦点1,2,19,20尽管多项全基因组关联研究（GWAS）已将多个基因与青光眼及小梁网（TM）处房水流出阻力增加相关联，但导致该疾病的确切分子机制尚未完全阐明。21,22,23,24,25.

动物模型极大地增进了我们对青光眼疾病进展的现有认识（已在文献中广泛综述3,15,16,26,27,28,29,30,31,32,33）。研究人员已开发出多种开创性方法用于研究小梁网（TM）34,35,36，这些方法已被广泛应用于推动我们对正常及病变组织的当前理解。然而，利用基因修饰小鼠模型研究小梁网功能障碍分子机制的领域尚未得到充分探索。针对与小梁网相关基因的转基因敲入和基因敲除小鼠研究，例如Myocilin（Myoc）37,38和Cyp1b139，已成为研究小梁网功能分子机制的主要工具。可以理解的是，小鼠小梁网体积微小，构成了研究该组织时必须克服的重大障碍。小鼠模型是研究疾病遗传学和分子机制的有力工具，而激光捕获显微切割（LCM）技术的进步则提供了必要的手段，使得对包括小梁网在内的最小且最精细组织的研究成为可能。

本报告描述了一种稳健且可重复的方法，用于从小鼠眼球中高效富集小梁网（TM）组织，并进行后续的RNA提取和扩增，以用于下游表达分析。类似的方法已成功应用于小鼠其他类型眼组织的分离40,41,42,43,44，本文所报道的方法也可推广至眼部其他独立组织，用于RNA、微小RNA（microRNA）、DNA和蛋白质的研究。尤为重要的是，该技术使得利用基因修饰小鼠更深入地理解小梁网功能障碍在青光眼及眼病中的分子发病机制成为可能3,15,16,17,18,26,31,45,46。通过激光显微切割（LCM）技术分离小鼠眼球小梁网的能力，将成为深入探究多种眼病分子机制的一项有力工具。

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方案

本研究的所有方法均根据美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）动物研究提案 IIDL 05-46，获得 NIEHS 动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。

1. 激光显微切割的最佳组织采集

  1. 取2至3月龄的雄性或雌性C57BL/6小鼠。使用CO2安乐死至少1分钟，或直至呼吸停止。将动物从笼中取出，并通过颈椎脱位、断头或开胸术确认死亡。
  2. 解剖前，确保所有解剖工具清洁且已灭菌。
    注意：摘除眼球时需使用弯头剪刀和带锯齿尖端的镊子（推荐尖端尺寸：0.5 × 0.4 mm）。
  3. 将小鼠侧卧于平坦表面上，以便于接触眼睛。用镊子夹住眼角（眼裂处）以固定小鼠，然后使用弯头剪刀，使弯曲方向朝向远离眼球的一侧，沿眼眶轮廓剪开，直至眼球可轻松从眼眶中取出（使用剪刀的弯曲部分而非尖端）。
  4. 轻柔牵拉眼球，并用弯头剪刀剪断视神经，使眼球完全脱离眼眶。小心去除眼球周围的非眼组织，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。对对侧眼重复步骤1.3至1.4。
  5. 用纸巾轻压眼球以吸去多余水分，再进行包埋。将眼球放入样品模具（25 × 20 × 5 mm3）中，使晶状体与视神经平行于台面，以便获得矢状切面。将眼球包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，置于干冰上速冻。完全冻结后，将组织块储存于-80 °C环境中。

2. 激光显微切割用冰冻切片的制备

  1. 使用前，将聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜载玻片置于紫外交联仪中，以最大功率照射45分钟。
  2. 将RNase去污染溶液喷洒在刷子、镊子、耦合罐和样品夹上，彻底擦拭。用无核酸酶水冲洗并干燥。用100%乙醇擦拭冷冻切片机，以避免交叉污染。
  3. 将冷冻切片机温度调节至-18 °C。每次从-80 °C冰箱中取出一个冷冻组织块，并用干冰运送至冷冻切片机。让组织块在冷冻切片机内至少平衡10分钟，使其温度与仪器环境一致。
  4. 挤少量O.C.T.包埋剂至样品夹上（图1A），将组织块从模具中取出，小心放置于样品夹上（图1B）。待组织块在样品夹上完全冻结后，将其安装至冷冻切片机的样品头（图2A）。
  5. 调节冷冻切片机以切取8 µm厚的切片，小心切过O.C.T.包埋块直至暴露组织样本。一旦观察到组织，停止切片，使用洁净的剃须刀片修整冷冻块的四周，保留组织周围3–4 mm的O.C.T.以方便用画笔操作（图2B）。每次更换样本时，应使用新的洁净画笔，避免使用滚轮装置，以防样本交叉污染。
  6. 快速切取眼球组织。每隔第三个切片，用一步法苏木精-伊红（H&E）染色液浸润载玻片60秒，自来水冲洗，空气干燥，透明剂透明，盖上盖玻片后封固于带电荷的玻璃载玻片上。在显微镜下观察，继续切片直至小梁网（TM）在切片中清晰可见。
  7. 当小梁网（TM）开始出现时，切取2个切片并转移至带电荷的玻璃载玻片上，进行常规H&E染色，作为后续激光显微切割（LCM）的定位图谱。
    注：有关图谱制作和染色的详细步骤，请参见第3节。
  8. 在获得第一张H&E染色定位图谱载玻片后，继续在冷冻切片机中切取并排列6张连续的8 µm厚切片，并同时转移至PET膜载玻片上（图3A，B）。戴上手套后用拇指背面轻轻滑过膜背面，使组织贴附牢固。切片转移后，立即将PET膜载玻片放入装有干冰的载玻片盒中。
    注：可减少切片数量，但建议一次性转移多个切片，以减少各切片在室温空气中暴露的时间，从而降低RNA降解风险。
  9. 继续切取眼球组织，每完成两张各含6个切片的PET膜载玻片后，收集两个切片至带电荷的玻璃载玻片上，制备另一张H&E染色图谱载玻片。持续切片，共约100张连续的8 µm厚切片，直至小梁网（TM）不再可见。可通过快速染色一张玻璃载玻片上的切片进行确认（见步骤2.6）。
  10. 将所有PET膜载玻片储存于-80 °C，以备后续激光显微切割（LCM）使用。

3. H&E 染色切片染色方案及形态学评估

  1. 为在带电玻璃载玻片上可视化和复查组织切片图谱，立即将组织转移至含有100 mL快速固定液的染色缸中固定7秒。将载玻片在蒸馏水中浸洗10–20次，随后将载玻片转移至装有洁净蒸馏水的耦合缸中。
  2. 从水中取出载玻片，用纸巾轻轻吸干边缘。每张切片上加入200 µL改良过滤的哈里斯苏木精染液，室温孵育30秒。小心地在流动自来水下冲洗载玻片，直至水流清澈。在每一步骤之间（步骤3.2至3.5之间均需如此），用纸巾轻吸载玻片末端以去除多余液体。
  3. 将载玻片置于1×PBS溶液中，室温孵育30秒。随后，在流动自来水下小心冲洗载玻片30秒。
  4. 将载玻片在95%乙醇溶液中浸洗3–4次。加入足量伊红Y染液，覆盖载玻片上的组织，室温孵育15秒。
  5. 在95%乙醇溶液中快速浸洗两次，每次10–20次快速浸入；随后在100%乙醇溶液中同样快速浸洗两次，每次10–20次。最后，在二甲苯溶液中浸洗两次，每次10–20次快速浸入。
  6. 在组织上滴加树脂封片剂，小心加盖盖玻片以避免产生气泡，并在通风橱中过夜干燥。
  7. 通过肉眼观察或使用数字切片扫描仪检查H&E染色切片。识别出肿瘤组织（TM）清晰可见且便于切割的图谱切片，并在这些图谱切片之间使用PET膜载玻片进行激光显微切割（LCM）。

4. 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜玻片处理与染色方案

  1. 从冰箱中取出PET切片前，先配制焦油紫贮存液：将0.3 g焦油紫乙酸盐溶解于20 mL 75%乙醇中，置于摇床摇动2 h。使用0.22 µm无菌滤器过滤溶液，4 °C保存，保存时间不超过6个月。
  2. 用新鲜的75%乙醇按1:4比例配制伊红Y醇溶液。准备固定液（75%乙醇）和脱水液（75%、95%、 & 100% 乙醇）加入无菌、无核酸酶的 50 mL 圆锥形聚丙烯管中，置于冰上。向每种溶液中加入 RNase 抑制剂。
  3. 从-80 °C冰箱中取出含有冷冻组织切片的载片盒，置于干冰上。每次处理一张载片。将载片立即浸入预冷的75%乙醇中固定30秒。
  4. 轻轻将切片浸入无核酸酶水中 10–15 秒，以溶解 O.C.T. 包埋剂，同时不干扰组织切片。
  5. 用移液器小心地将300 µL的1.5%乙酸克里西蓝溶液直接滴加到切片上，在室温下孵育45秒。随后将切片放入75%乙醇溶液中洗涤一次，持续30秒。再向切片上滴加200 µL伊红Y溶液，孵育3–5秒。
  6. 将切片依次放入75%乙醇、95%乙醇和100%乙醇中各30秒以脱水。每一步之间用纸巾轻轻擦拭切片末端，去除多余液体。将切片置于通风橱中完全空气干燥5分钟。干燥后，立即进行激光显微切割（LCM）。
    注意：建议避免在此步骤中使用二甲苯，因为它可能导致组织切片与膜载玻片的结合不充分，并降低组织捕获效率。

5. 使用紫外激光进行激光显微切割

  1. 打开计算机并等待其启动。打开显微镜白光电源。打开紫外激光钥匙，黄色LED灯将亮起。启动LCM软件，等待其完全加载，实时视频将显示出来。按下控制器盒上的激光按钮，绿色LED灯将亮起。
  2. 将一张新的玻璃载玻片放入显微镜载物台上，然后将PET膜载玻片有染色组织的一面朝下，直接放置在玻璃载玻片上方。确保膜和玻璃载玻片在显微镜载物台上紧密贴合。
  3. 通过首先设定载玻片范围来启动LCM。在物镜面板中选择最低的4X放大倍数（图4）。然后通过移动显微镜的xy载物台，使金属与膜交界处的左上角在实时视频中可见，按下"Limit 1"按钮，路线图上将出现一个红色矩形。接着将xy载物台移至对角，按下"limit 2"按钮。按下"scan"按钮，生成设定范围内膜和组织的路线图图像。
  4. 在路线图中靠近某一眼部切片的小梁网（TM）区域附近双击，TM通常位于虹膜角膜角的顶端附近（图5A）。确认TM位置后，将放大倍数调至10X，并手动对焦于TM。依次使用20X和40X物镜重复操作。当使用40X物镜对TM清晰对焦后（图5B），移动至附近空白区域（可能需要轻微调整焦距），选择"自由手绘工具"，在组织的空白区域画一条长线。
  5. 设置激光参数，使"cut velocity"为34%，"focus"为58%，"power"为70%（图4），然后按下"cut"按钮。微调激光的速度、焦距和功率参数，直至观察到清晰且精细的切割线（见图5C）。为实现精确切割，确保切割路径沿所绘制的线条进行。
  6. 将分离管盖装入盖子支架中并打开管子。将支架固定在盖子提升装置上，并确保管子处于倒置状态。确保粘性盖材料突出于盖子尖端之外，以保证目标组织被有效捕获。
  7. 在软件面板中选择"Manual"解剖模式。仔细确认小梁网（TM）（图5B）正位于分离管正下方。设置白平衡并调节亮度，以获得最佳图像质量（图4）。
  8. 开始切割时，手动调整焦距，并使用自由手绘工具画线，确保收集帽仍处于上升位置，尚未接触膜。在TM与巩膜交界处附近绘制两个半圆形（图5C），然后按下"cut"。完成首次切割后，将盖子移至下降位置并重新调整焦距，然后在开放或空白区域画两条线，连接两个半圆，形成围绕TM的完整圆圈，再按下"cut"按钮，从切片中收集组织，确保TM已被显微切割盖捕获（图5D-F）。
  9. 将盖子重新移回上升位置，并在其余切片上重复步骤（5.2 - 5.8）。轻微调整盖子位置，使所有分离的样本均能容纳在盖子上且不重叠（图5G）。为保持一致性，每张载玻片的操作时间窗口为20分钟。若需要更多时间从所有切片中分离TM，可减少每张PET膜上的切片数量。对于下一张PET膜，插入新的分离管并重复第5节操作。

6. 显微切割的巩膜组织的裂解

  1. 新鲜配制RNA裂解缓冲液以裂解LCM分离的组织。每1 mL裂解缓冲液中加入10 µL β-巯基乙醇。含β-巯基乙醇的裂解缓冲液于室温保存不得超过1个月。
  2. 从显微切割开始后20分钟内，将分离管从帽架上取下。肉眼观察帽表面，确保已捕获小梁网组织（TM）。
  3. 小心地将10 µL裂解缓冲液用移液器滴加至收集管盖内表面，确保裂解缓冲液完全覆盖显微切割的小梁网组织。轻轻合上粘性盖，将收集管倒置，于室温孵育10分钟。孵育结束后，在800 × g下离心2分钟，并将裂解液置于干冰上。将裂解液在-80 °C保存，用于后续纯化与分析。

7. RNA 提取与质量分析

  1. 在室温下解冻样本，通过分析RNA质量。将来自同一只小鼠的所有样本合并至一个无RNase的1.5 mL离心管中。
    注意：例如，每个生物学重复生成10 - 12管显微解剖获得的肾小球，每管含有10 µL裂解液，然后将所有裂解液转移至同一管中，以获得每个生物学重复共计100 - 120 µL裂解液。
  2. 加入与裂解液等体积的新鲜配制的70%乙醇（使用无RN酶的水配制）至各裂解液中。随后按照RNA提取试剂盒的使用说明书纯化总RNA。确保从每个RNA样本中去除基因组DNA。
    注意：基因组DNA可能会干扰下游的RNA分析。
  3. 通过合并每只小鼠的样本并分析核糖体RNA完整性，测定从TM中分离的RNA的质量图6A).
    注意：由于TM样本量较小，核糖体RNA峰可能无法观察到（图6B) 对RNA质量谱的影响（在1,000 - 4,000 bp之间观察到两个峰） 图6A，C）用于计算RNA完整性数值（RIN）47.
    1. 通过从膜片上更丰富的残留组织中分离RNA，获得更准确的RNA完整性测量结果。为获得具有代表性的RIN，使用移液器将10 µL裂解缓冲液加至膜片上的一个组织切片，从眼组织中分离RNA并进行RNA提取。分析RNA质量并计算RIN（图6C).
  4. 对于下游RNA应用，使用低起始量RNA建库试剂盒进行测序和cDNA文库构建，可从低至80片LCM分离的TM组织中获得可重复的结果。

8. 分析

  1. 为了验证所采集的组织确实富含小梁网（TM）相关基因，从3只不同的小鼠中分别显微解剖获取整个眼球、巩膜、虹膜、视网膜、角膜和晶状体的额外RNA样本。将这些RNA与来自4只不同小鼠的激光捕获显微切割（LCM）分离的小梁网和睫状体所获得的RNA联合使用。
  2. 使用cDNA反转录试剂盒将显微解剖样本的RNA转化为cDNA。对于LCM分离的样本RNA，使用低起始量RNA转cDNA试剂盒进行扩增并转化为cDNA。
  3. 通过数字PCR分析所有RNA样本中小梁网表达基因——肌苷蛋白聚糖（MYOC）和α-肌动蛋白-2（ACTA2）的表达水平，并以看家基因HSP90a1进行归一化处理（图7A-B）。

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结果

通过激光显微切割（LCM）从4只不同小鼠的巩膜静脉窦（TM）和睫状体中收集RNA，并进行分离，以便分析基因表达，并与来自另外三只小鼠的全眼球、巩膜、虹膜、视网膜、角膜和晶状体中的基因表达进行比较。为确认所分离的TM样本确实高度富集于TM组织，我们在所有收集的组织中检测了TM特异性表达基因MYOC48和ACTA249。由于LCM样本中cDNA含量极低，因此采用数字PCR进行检测，该方法已被证明在样本量较少时具有更高的可重复性50。使用持家基因HSP90a1对MYOC和ACTA2的表达水平进行标准化后，将各组织与全眼球的表达水平进行比较。结果显示，MYOC（图7A）和ACTA2（图7B）在TM...

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讨论

小梁网（TM）在主动维持眼内压（IOP）稳态中发挥关键作用，其功能障碍被广泛认为是高血压性青光眼的主要致病因素1,2,19。全基因组关联分析（GWAS）已鉴定出多个基因中的若干单核苷酸多态性，这些多态性与青光眼风险增加以及小梁网处房水（AH）流出阻力升高相关；然而，导致该疾病发生的精确分子机制尚未完全阐明21,22,23,24,25。遗传性小鼠模型是研究青光眼分子机制的有力工具。然而，小鼠小梁网组织体积微小，为从小鼠眼球中分离高度富集的小梁网组织及获取高质量RNA用于基因表达分析带来了巨大挑战。激光显微切割（LCM）是一种可用于分...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACTA2 ddPCR 引物 (dMmuCPE5117282)BioRad10031252FAM
Agilent 2100 生物分析仪Agilent TechnologiesG2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒Agilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 微滴数字PCR系统BioRad
小型毛笔
带电荷玻璃显微镜载玻片Thermo scientific4951PLUS-001
醋酸克里西蓝Sigma AldrichC5042
弯头剪刀
伊红Y染料Thermo scientific71204
乙醇
镊子弯头且带锯齿尖端（推荐尖端尺寸：0.5 × 0.4 mm）
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
高容量cDNA反转录试剂盒Applied Biosystems4368814
Hsp90a ddPCR 引物 (dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Leica CM1850 冷冻切片机Leica
Millex-GS 滤器单元EMD MilliporeSLGS033SB0.22 µm
MMI CellCut 紫外切割模型Molecular Machines & IndustriesLCM仪器
MMI CellTools 软件Molecular Machines & Industries50202LCM软件
激光捕获显微切割样本管ASEE ProductsST-LMD-M-500分离帽管/由德国Microdissect GmBH生产，ASEE Products经销
激光捕获显微切割样本管（替代品）Molecular Machines & Industries
改良哈里斯苏木精Thermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR 引物 (dMmuCPE5095712)BioRad10031252
PBS
膜载玻片，无RNaseASEE ProductsFS-LMD-M-50r聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜/由德国Microdissect GmBH生产，ASEE Products经销
膜载玻片，无RNase（替代品）Molecular Machines & Industries50102
快速固定液Thermo scientific6764212H&E染色
RLT缓冲液Qiagen79216用于LCM样本的裂解缓冲液
RNAseZapSigmaR2020RNase去污染溶液
Protect RNA RNA酶抑制剂Sigma AldrichR7397
RNeasy Micro 试剂盒Qiagen74004RNA提取试剂盒
SMART-Seq v4 超低起始量RNA试剂盒Takara Clontech634888适用于LCM样本的低起始量RNA转cDNA试剂盒
SuperMix（不含dUTP）BioRad1863023数字PCR预混液
Tissue-Tek Cryomold（25 mm × 20 mm × 5 mm）Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Sakura4583
Stratalinker 紫外交联仪Stratagene400075
二甲苯Macron8668

参考文献

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