从小鼠眼球中激光捕获显微切割高纯度小梁网用于基因表达分析

摘要

本文介绍了一种可重复的激光显微切割（LCM）实验方案，用于分离小梁网（TM）组织以进行后续RNA分析。对小梁网基因表达变化的分析能力将有助于理解与小梁网相关眼病的潜在分子机制。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）技术使得对组织切片中单个细胞及富集细胞群体的基因表达分析成为可能。LCM 是研究细胞分化以及包括青光眼在内的多种疾病发生与进展过程中分子机制的有力工具。青光眼是一组进行性视神经病变，是全球范围内导致不可逆性失明的最常见原因。小梁网（TM）内的结构改变和损伤可导致眼内压（IOP）升高，而眼内压升高是青光眼发病的主要危险因素。然而，其涉及的精确分子机制目前仍不明确。开展基因表达分析的能力对于深入理解这些细胞的功能及其在调控眼内压和青光眼发生中的作用至关重要。为此，需要一种可重复的方法，用于从小鼠眼球冷冻切片中分离高度富集的小梁网，并结合下游基因表达分析方法（如 RT-qPCR 和 RNA-Seq）进行研究。本文所述方法旨在从小鼠眼球中分离高纯度的小梁网，以用于后续的数字 PCR 和微阵列分析。此外，该技术也可轻松适用于分离其他难以从小鼠眼球中获取的高度富集的眼部细胞及细胞区室。LCM 与 RNA 分析的结合将有助于更全面地理解青光眼发生过程中的细胞事件。

引言

青光眼是一组以视神经病变和视网膜病变为特征的疾病，最终可导致不可逆的失明^1,2据估计，到2020年，全球将有超过7000万人患有某种形式的该疾病^3,4,5,6,7原发性开角型青光眼（POAG）是最常见的青光眼类型，其特征是房水（AH）外流减少，导致眼内压（IOP）升高^{8,9,10,11,12,13,143,15}

方案

本研究的所有方法均根据美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）动物研究提案 IIDL 05-46，获得 NIEHS 动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。

1. 激光显微切割的最佳组织采集

1. 取2至3月龄的雄性或雌性C57BL/6小鼠。使用CO₂安乐死至少1分钟，或直至呼吸停止。将动物从笼中取出，并通过颈椎脱位、断头或开胸术确认死亡。
2. 解剖前，确保所有解剖工具清洁且已灭菌。
   注意：摘除眼球时需使用弯头剪刀和带锯齿尖端的镊子（推荐尖端尺寸：0.5 × 0.4 mm）。
3. 将小鼠侧卧于平坦表面上，以便于接触眼睛。用镊子夹住眼角（眼裂处）以固定小鼠，然后使用弯头剪刀，使弯曲方向朝向远离眼球的一侧，沿眼眶轮廓剪开，直至眼球可轻松从眼眶中取出（使用剪刀的弯曲部分而非尖端）。
4. 轻柔牵拉眼球，并用弯头剪刀剪断视神经，使眼球完全脱离眼眶。小心去除眼球周围的非眼组织，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。对对侧眼重复步骤1.3至1.4。
5. 用纸巾轻压眼球以吸去多余水分，再进行包埋。将眼球放入样品模具（25 × 20 × 5 mm³）中，使晶状体与视神经平行于台面，以便获得矢状切面。将眼球包埋于最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂中，置于干冰上速冻。完全冻结后，将组织块储存于-80 °C环境中。

结果

通过激光显微切割（LCM）从4只不同小鼠的巩膜静脉窦（TM）和睫状体中收集RNA，并进行分离，以便分析基因表达，并与来自另外三只小鼠的全眼球、巩膜、虹膜、视网膜、角膜和晶状体中的基因表达进行比较。为确认所分离的TM样本确实高度富集于TM组织，我们在所有收集的组织中检测了TM特异性表达基因MYOC⁴⁸和ACTA2⁴⁹。由于LCM样本中cDNA含量极低，因此采用数字PCR进行检测，该方法已被证明在样本量较少时具有更高的可重复性⁵⁰。使用持家基因HSP90a1对MYOC和ACTA2的表达水平进行标准化后，将各组织与全眼球的表达水平进行比较。结果显示，MYOC（图7A）和ACTA2（图7B）在TM.......

讨论

小梁网（TM）在主动维持眼内压（IOP）稳态中发挥关键作用，其功能障碍被广泛认为是高血压性青光眼的主要致病因素^1,2,19。全基因组关联分析（GWAS）已鉴定出多个基因中的若干单核苷酸多态性，这些多态性与青光眼风险增加以及小梁网处房水（AH）流出阻力升高相关；然而，导致该疾病发生的精确分子机制尚未完全阐明^{21,22,23,24,25}。遗传性小鼠模型是研究青光眼分子机制的有力工具。然而，小鼠小梁网组织体积微小，为从小鼠眼球中分离高度富集的小梁网组织及获取高质量RNA用于基因表达分析带来了巨大挑战。激光显微切割（LCM）是一种可用于分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACTA2 ddPCR 引物 (dMmuCPE5117282)	BioRad	10031252	FAM
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies	G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico 试剂盒	Agilent Technologies	5067-1513
BioRad QX200 微滴数字PCR系统	BioRad
小型毛笔
带电荷玻璃显微镜载玻片	Thermo scientific	4951PLUS-001
醋酸克里西蓝	Sigma Aldrich	C5042
弯头剪刀
伊红Y染料	Thermo scientific	71204
乙醇
镊子			弯头且带锯齿尖端（推荐尖端尺寸：0.5 × 0.4 mm）
HemaCen	American MasterTech	STHEM30
高容量cDNA反转录试剂盒	Applied Biosystems	4368814
Hsp90a ddPCR 引物 (dMmuCPE5097465)	BioRad	10031255	VEX
Leica CM1850 冷冻切片机	Leica
Millex-GS 滤器单元	EMD Millipore	SLGS033SB	0.22 µm
MMI CellCut 紫外切割模型	Molecular Machines & Industries		LCM仪器
MMI CellTools 软件	Molecular Machines & Industries	50202	LCM软件
激光捕获显微切割样本管	ASEE Products	ST-LMD-M-500	分离帽管/由德国Microdissect GmBH生产，ASEE Products经销
激光捕获显微切割样本管（替代品）	Molecular Machines & Industries
改良哈里斯苏木精	Thermo scientific	7211	FAM
MYOC ddPCR 引物 (dMmuCPE5095712)	BioRad	10031252
PBS
膜载玻片，无RNase	ASEE Products	FS-LMD-M-50r	聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜/由德国Microdissect GmBH生产，ASEE Products经销
膜载玻片，无RNase（替代品）	Molecular Machines & Industries	50102
快速固定液	Thermo scientific	6764212	H&E染色
RLT缓冲液	Qiagen	79216	用于LCM样本的裂解缓冲液
RNAseZap	Sigma	R2020	RNase去污染溶液
Protect RNA RNA酶抑制剂	Sigma Aldrich	R7397
RNeasy Micro 试剂盒	Qiagen	74004	RNA提取试剂盒
SMART-Seq v4 超低起始量RNA试剂盒	Takara Clontech	634888	适用于LCM样本的低起始量RNA转cDNA试剂盒
SuperMix（不含dUTP）	BioRad	1863023	数字PCR预混液
Tissue-Tek Cryomold（25 mm × 20 mm × 5 mm）	Sakura	4557
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583
Stratalinker 紫外交联仪	Stratagene	400075
二甲苯	Macron	8668