基于琼脂糖的组织模拟光学仿体用于漫反射光谱分析

摘要

本文展示了如何制备基于琼脂糖的仿组织光学模型，并介绍了如何利用配备积分球的传统光学系统测定其光学特性。

摘要

本方案描述了如何制备基于琼脂糖的仿组织体模，并演示了如何使用配备积分球的传统光学系统测定其光学特性。测量系统用于获取漫反射和总透射光谱，该系统由宽带白光光源、导光管、消色差透镜、积分球、样品 holder、光纤探头和多通道光谱仪组成。通过两个矩形丙烯酸片和一个U形丙烯酸片构成的丙烯酸模具，可制备含有全血的表皮层体模和真皮层体模。将连二亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）溶液作用于真皮层体模，可使分布于其中的红细胞内血红蛋白脱氧。利用光谱仪结合积分球测得的漫反射和总透射光谱，进行逆向蒙特卡罗模拟，以确定各层体模的吸收系数光谱 µ_a(λ) 和约化散射系数光谱 µ_s'(λ)。此外，通过将表皮层体模叠加在真皮层体模之上，构建了模拟人体皮肤组织漫反射特性的双层体模。

引言

光学仿体是模拟生物组织光学特性的物体，在生物医学光学领域得到了广泛应用。其设计目标是使光学特性（如光散射系数和吸收系数）与活体人或动物组织的特性相匹配。光学仿体通常用于以下目的：模拟光在生物组织中的传输过程、校准新开发的光学系统设计、评估现有系统的质量与性能、比较不同系统之间的性能差异，以及验证光学方法量化组织光学特性的能力^1,2,3,4,5。因此，制备光学仿体需要具备易于获取的材料、简单的制备工艺、高重复性以及良好的光学稳定性。

已有文献报道了多种以不同基础材料制成的光学 phantom，包括水性悬浮液⁶、明胶凝胶⁷、琼脂糖凝胶^8,9,10、聚丙烯酰胺凝胶¹¹、树脂^{12,13,14,15,16}以及室温硫化硅橡胶¹⁷。研究表明，基于明胶和海藻酸盐的凝胶适用于构建具有非均质结构的光学 phantom¹⁸。海藻酸盐 phantom 具备良好的机械稳定性和热稳定性，适合用于评估光热效应，例如激光消融研究和基于激光的热疗研究¹⁸。琼脂糖凝胶能够构建非均质结构，且其机械和物理性质长期稳定¹⁸。高纯度琼脂糖凝胶浊度极低，光学吸收微弱，因此基于琼脂糖的 phantom 可通过添加适当的光散射剂和吸收剂，方便地设计其光学特性。最近，苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯（SEBS）嵌段共聚物¹⁹和聚氯乙烯（PVC）凝胶²⁰也被报道为光学和光声技术中具有潜力的 phantom 材料。

聚合物微球^7,12,21,22、二氧化钛粉末¹以及脂质乳剂^23,24,25,26（如牛奶和脂质乳剂）被用作光散射剂，而黑色墨水^27,28和分子染料^29,30则被用作光吸收剂。大多数活体器官的漫反射光谱主要受红细胞中氧合与脱氧血红蛋白吸收特性的影响。因此，在用于漫反射光谱和多光谱成像的仿体中，常使用血红蛋白溶液^31,32和全血^8,9,10,33,36作为光吸收剂。

本文所述方法用于创建模拟生物组织中光传输的光学仿体，并表征其光学特性。以模拟人类皮肤组织光学特性的双层光学仿体为例进行了演示。与替代技术相比，该方法的优势在于能够再现活体生物组织在可见光至近红外波长范围内的漫反射光谱，同时利用易得的材料和常规光学仪器即可简便制备。因此，采用此方法制备的光学仿体将有助于基于漫反射光谱和多光谱成像的光学技术的开发。

方案

1. 常规漫反射和总透射光谱系统的构建

注意：使用宽带白光源、导光管、消色差透镜、积分球、样品架、光纤和多通道光谱仪构建漫反射和总透射光谱的测量系统。光陷阱的作用是从反射光谱中去除镜面反射成分。积分球的样品架由安装板以及带有燕尾槽和弹簧加载夹具的组件构成，后者用于将样品固定在端口处。将燕尾槽和弹簧加载夹具组件从样品架上移除，改用聚苯乙烯泡沫制成的自制立方基座固定在安装板上。构建漫反射测量和总透射测量系统时，可分别参考图1a和1b所示的光学元件布局。

1. 使用提供的通用串行总线（USB）电缆将光谱仪与个人计算机连接。
2. 将端口适配器连接至积分球的探测器端口。使用光纤将光谱仪与积分球的端口适配器连接。连接150 W卤素灯光源与导光管。
3. 将样品支架连接至积分球的样品端口。进行漫反射测量时，将光陷阱连接至积分球的适当端口。打开卤素灯光源以照射样品。 通过 导光管和消色差透镜。
4. 打开光谱仪的操作软件。

2. 丙烯酸模具的制备

注意：使用由两块矩形丙烯酸板和一块U形丙烯酸板组成的丙烯酸模具来制备单层凝胶仿体。该构建过程可参考图2。

1. 从一块 2 毫米厚的亚克力板上切割出两块矩形亚克力片，尺寸可选。
2. 从一块 1 毫米厚的亚克力板上切割出一块亚克力片，尺寸可选。将该 1 毫米厚的亚克力片切割成 U 形，用于制作 1 毫米厚的表皮仿体模具。
3. 从一块 5 毫米厚的亚克力板上切割出一块亚克力片，尺寸可选。将该 5 毫米厚的亚克力片切割成 U 形，用作制作 5 毫米厚的真皮仿体模具。
4. 使用金属锉刀去除每块亚克力片上的毛刺。
5. 将 1 毫米厚的 U 形亚克力片夹在两块 2 毫米厚的矩形亚克力片之间，并用五个回形夹固定，制成表皮仿体模具。
6. 将 5 毫米厚的 U 形亚克力片夹在两块 2 毫米厚的矩形亚克力片之间，并用五个回形夹固定，制成真皮仿体模具。

3. 基底材料的制备

1. 取500 mL含0.9% (w/v) NaCl的标准生理盐水置于容器中。在搅拌的同时缓慢加入5 g琼脂糖粉末，以避免结块。
2. 使用功率为1,000 W的电热炉加热琼脂糖粉末与生理盐水的混合物，持续5分钟。
3. 待混合物沸腾后，调至小火继续加热3分钟。
4. 将混合物冷却至约70 °C，然后倒入容器中，并在制作模型前将其置于60 °C恒温水浴中保温30分钟。

4. 仿生皮肤光学模型的制备

注意：使用咖啡溶液来模拟黑色素的吸收光谱。咖啡溶液含有一种称为类黑精的棕色色素。据报道，类黑精的吸收光谱与黑色素相似¹⁰。

1. 制备表皮仿体
   1. 将 100 mL 纯水倒入咖啡机水箱中。在咖啡机滤篮中放置一个滤纸。向滤纸中加入 24 g 咖啡粉。打开咖啡机并按下冲泡按钮开始冲泡。
   2. 将 4 mL 冲泡好的咖啡与 16 mL 生理盐水加入玻璃瓶中，配制成咖啡溶液。
   3. 将 5 mL 脂质乳剂（例如，10% Intralipid）和 10 mL 咖啡溶液加入透明塑料杯中。在搅拌的同时缓慢加入 35 mL 基质材料。
   4. 用注射器吸取混合物，并缓慢注入表皮仿体模具中，避免产生气泡。将含有混合物的丙烯酸模具在 5 °C 下冷却 20 分钟。
   5. 从模具上取下回形夹。将其中一块丙烯酸板向外滑动并从模具中取出。将模具中 1 mm 厚的凝固凝胶仿体取出，并使用手术刀切割至所需尺寸。
   6. 将凝胶仿体置于两片载玻片之间并固定。
2. 制备含氧合血的真皮仿体
   1. 取 5.0 mL 脂质乳剂和 0.4 mL 血细胞比容为 45% 的马全血，加入透明塑料杯中。在搅拌的同时缓慢加入 44.6 mL 基质材料。
   2. 用注射器吸取混合物，并缓慢注入真皮仿体模具中，避免产生气泡。将含有混合物的丙烯酸模具在 5 °C 下冷却 20 分钟。
   3. 从模具上取下回形夹。将其中一块丙烯酸板向外滑动并从模具中取出。将模具中 5 mm 厚的凝固凝胶仿体取出，并使用手术刀切割至所需尺寸。
   4. 将凝胶仿体置于两片载玻片之间并固定。
3. 制备含脱氧血的真皮仿体
   1. 将含有氧合血的真皮凝胶仿体（来自步骤 4.2.3）放置于玻璃培养皿上。
   2. 在玻璃瓶中将 1 g 连二亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）溶解于 20 mL 生理盐水中。
   3. 使用注射器将 0.05 g/mL 的 Na₂S₂O₄ 溶液滴加到仿体表面，以使仿体中的血液脱氧。
   4. 将仿体置于两片载玻片之间并固定，以防止其干燥。
4. 制备双层仿体
   1. 在真皮仿体上滴加 0.1 mL 生理盐水，以确保表皮层与真皮层之间的光学耦合。将表皮仿体放置在真皮仿体上方。
   2. 若两层之间存在气泡，可用手指轻抚双层仿体表面将其推出。
   3. 将双层仿体置于两片载玻片之间并固定，以防止其干燥。

5. 漫反射光谱的采集

1. 暗光谱的获取
   注意：光谱仪中的电荷耦合器件（CCD）传感器可根据入射光产生的电信号来估算光强度。然而，存在与光子产生的信号无关但与设备温度相关的暗噪声³⁷，即使传感器未检测到光时也会存在。为了准确测量光的光谱强度，应测量暗电流信号作为暗光谱，并从样品光谱中减去该暗光谱。暗光谱是指在光路被遮挡时采集的光谱。
   1. 将积分球置于漫反射测量的最佳位置（图1a）。
   2. 关闭卤素灯光源，使用端口塞或遮光板阻断进入光谱仪的光路。
   3. 从文件菜单中选择存储暗光谱命令，以保存一条暗光谱。
   4. 从文件菜单中选择减去暗光谱命令，将暗光谱从测得的样品光谱中扣除（见下文）。
2. 参考光谱的获取
   注意：本实验中使用的光学元件（如光源、导光管、消色差透镜、光纤和光谱仪）具有各自的波长依赖性。因此，应测量通过这些光学元件的光的光谱强度作为参考光谱。在漫反射光谱测量中，参考光谱是指在光源照射下，使用标准白色漫射体所采集的光谱。
   1. 按下电源按钮开启卤素灯光源。在采集参考光谱前，至少预热光源10分钟。
   2. 将标准白色漫射体（例如，Spectralon）放置在积分球的样品端口处。
   3. 在光谱仪操作软件的下拉列表中选择合适的值，调节光谱仪的积分时间，使峰值信号强度约为光谱仪最大强度的75%。
   4. 从文件菜单中选择存储参考光谱命令，以保存一条参考光谱。
3. 样品光谱的获取
   注意：使用相同的采集条件获取并保存样品漫反射光谱至个人计算机的硬盘中。
   1. 将夹在两片载玻片之间的表皮仿体置于样品端口处。从文件菜单中选择保存命令，将漫反射光谱保存为文件。
   2. 对真皮仿体和双层仿体重复步骤5.3.1。

6. 总透射光谱的获取

1. 暗光谱的获取
   注意：光谱仪中的传感器可根据入射光产生的电信号来估算光强。然而，即使传感器未检测到光，仍存在与光子信号无关但与设备温度相关的暗噪声。为了准确测量光的光谱强度，应测量暗电流信号作为暗光谱，并从样品光谱中扣除。暗光谱是指在光路被遮挡时采集的光谱。
   1. 将积分球置于总透射率测量的最佳位置（图1b）。
   2. 从积分球的端口移除光阱，并在端口上安装端口堵头。
   3. 关闭卤素灯光源，使用端口堵头或遮光板阻断进入积分球的光路。
   4. 从文件菜单中选择存储暗光谱命令，以保存一条暗光谱。
   5. 从文件菜单中选择扣除暗光谱命令，将暗光谱从测得的样品光谱中扣除（见下文）。
2. 参考光谱的获取
   注意：本实验所用组件（如光源、导光管、消色差透镜、光纤和光谱仪）的光学特性均具有波长依赖性。因此，应将光通过这些组件后的光谱强度测量为参考光谱。在总透射率光谱的测量中，参考光谱是指光源发出的光直接通过样品端口进入积分球时采集的光谱。
   1. 按下电源按钮开启卤素灯光源。在采集参考光谱前，至少预热光源10分钟。
   2. 通过光谱仪操作软件中的积分时间下拉列表选择合适的值，调节光谱仪的积分时间，使最强光强的信号约为最大值的75%。
   3. 从文件菜单中选择存储参考光谱命令，以保存一条参考光谱。
3. 样品光谱的获取
   注意：样品的总透射率光谱在相同的采集条件下获取，并保存至个人计算机的硬盘中。
   1. 将夹在两片载玻片之间的表皮模拟体置于样品端口处，从文件菜单中选择保存命令，将总透射率光谱保存为文件。
   2. 对真皮模拟体和双层模拟体重复步骤6.3.1。

7. 估算吸收和光散射特性

注意：将漫反射光谱和总透射光谱数据集保存至个人计算机硬盘，并进行离线分析。随后通过逆向蒙特卡罗模拟^8,38,39,40来估算吸收系数光谱µ_a(λ)和约化散射系数光谱µ_s’(λ)。在此逆向蒙特卡罗模拟中，在假设各向异性因子g为0的条件下，所估算的散射系数µ_s被视为约化散射系数µ_s’。单次模拟运行同时使用反射率和透射率数据。本方案所采用的详细算法已在先前文献中报道^8,39。我们根据从表皮层获得的漫反射光谱和总透射光谱数据集，估算了表皮层的吸收系数光谱µ_a(λ)和约化散射系数光谱µ_s’(λ)。同样地，我们根据从真皮层获得的漫反射光谱和总透射光谱数据集，估算了真皮层的µ_a(λ)和µ_s’(λ)。

1. 打开用于蒙特卡罗模拟的输入文件。
2. 在输入数据文件中，填写在400至700 nm波长范围内以10 nm为间隔的测量漫反射率和总透射率的数值。在输入数据文件中填写模型厚度的数值。
3. 在输入数据文件中，将某一层的折射率 n 设置为适当值（例如，在550 nm处n = 1.33）。在输入数据文件中将各向异性因子 g 的值设为0。
4. 在输入数据文件中，将吸收系数 µ_a 和散射系数 µ_s 的初始值设置为适当的数值（例如，µ_a = 0.01，µ_s = 0.1）。
5. 运行逆向蒙特卡罗模拟程序。
6. 输入输入文件的文件名，然后启动模拟。
7. 打开输出文件，检查迭代模拟终止后得到的 µ_a 和 µ_s 的最终值。
8. 对其他所需波长重复执行步骤7.1–7.7。

结果

图3 显示了表皮仿体和真皮仿体的约化散射系数与吸收系数的代表性估计光谱。图中所示结果 图3 是反射光谱和透射光谱各十次测量的平均值。约化散射系数 µ_s' 具有宽广的散射光谱，在较短波长处表现出更高的强度。其光谱特征与软组织典型的散射光谱相对应。吸收系数 µ_a 表皮幻影的吸收系数随波长增加呈指数衰减，这与黑色素的吸收光谱相似。表皮幻影层的吸收系数光谱与黑色素的吸收系数光谱⁴¹ 通过指数函数进行拟合，形式如下：

讨论

本方案中最关键的步骤是基质材料的温度控制。基质材料应维持在 58 至 60 °C 的温度范围内。若温度超过 70 °C，脂质乳剂和全血均会发生变性，从而导致模型的光学特性恶化。若温度低于 40 °C，基质材料将发生不均匀凝胶化，导致光散射剂和吸收剂在模型中分布不均。尽管基质材料保持在 60 °C，但使用注射器抽吸时会导致其温度下降。当基质材料加入血液溶液时，其温度会降至 50 °C。

本文所述的光学仿体使用寿命较短，通常不超过一天。可通过将仿体与基底材料封装于密闭容器中，或使用防腐剂来延长其可用寿命。表皮层仿体的厚度为1 mm，比人体表皮厚度大一个数量级。然而，在本实验方案中使用丙烯酸模具时，难以制备出厚度小于0.5 mm的层。为了降低该厚度对仿体测得的漫反射光谱可能产生的影响，调节了表皮仿体的散射系数和吸收系数，使其漫反射光谱与人体皮肤的光谱相似。旋涂法⁴²在制备厚度小于0.5 mm的层方面具有良好的应用前景。文献中已报道了人体皮肤的µ_a (λ) 和 µ

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
150 W 卤素灯光源	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LA-150SAE
导光管	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japan	LGC1-5L1000
积分球	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	RT-060-SF
端口适配器	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	PA-050-SMA-SF
光陷阱	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	LTRP-100-C
具有 99% 漫反射率的 Spectralon 白色标准板	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020
光纤	Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, USA	P400-2-VIS-NIR
微型光纤光谱仪	Ocean Optics Inc., Dunedin, Florida, USA	USB2000
消色差透镜	Chuo Precision Industrial Co.,Ltd, Tokyo, Japan	ACL-50-75M
脂肪乳	Fresenius Kabi AB, Uppsala, Sweden	Intralipid 10%
咖啡 （Blendy 摩卡混合普通咖啡）	Ajinomoto AGF, Inc. Tokyo, Japan	不可用
全血	Nippon Bio-Test Laboratories Inc. Saitama, Japan	0103-2
琼脂糖	Nippon Genetics Co., Ltd, Tokyo, Japan	NE-AG02
电热炉	TOSHIBA CORPORATION Tokyo, Japan	HP-103K