用于组织工程应用的植物组织脱细胞两种方法

摘要

本文介绍并对比了两种用于植物组织脱细胞的实验方案：基于去污剂的方法和无去污剂的方法。这两种方法均能保留所用植物组织的细胞外基质，该基质随后可作为组织工程应用中的支架材料。

摘要

目前用作组织替代支架的自体、合成及动物来源移植物，由于来源有限、生物相容性差以及成本较高，存在诸多局限性。植物组织具有多种有利特性，使其非常适合作为支架材料，例如高比表面积、优异的水分运输与保持能力、相互连通的孔隙结构、预先存在的维管网络，以及广泛的力学性能。本文介绍了两种用于组织工程应用的植物去细胞化方法。第一种方法基于洗涤剂浸泡以去除细胞成分，类似于此前已建立的清除哺乳动物组织的方法。第二种方法为无洗涤剂法，改编自一种分离叶片维管系统的方案，通过加热的次氯酸钠与盐溶液处理来清除叶片和茎部。两种方法获得的支架均具有相似的力学性能和较低的细胞代谢影响，因此使用者可根据具体应用需求选择更适合的方案。

引言

组织工程于20世纪80年代兴起，旨在创造活体组织替代物，以应对严重的器官和组织短缺问题¹。其中一种策略是利用支架材料来刺激并引导机体再生缺失的组织或器官。尽管3D打印等先进制造技术已能制备出具有独特物理特性的支架，但制造具备多样化物理和生物学特性的支架仍面临挑战^2,3。此外，由于缺乏功能性血管网络，这些技术在再生三维组织方面受到限制^4,5,6,7。利用去细胞化的动物和人体组织作为支架有助于克服这一难题。然而，去细胞化动物支架存在成本高、批次间差异大以及供应有限等问题，可能限制其广泛应用⁸。此外，还存在向患者传播疾病的风险，以及对某些去细胞化哺乳动物组织产生免疫反应的担忧⁹。

纤维素来源于植物和细菌，已被广泛用于制备再生医学中多种应用的生物材料。例如：骨^10,11软骨^12,13,14 以及伤口愈合¹⁵由纤维素构成的支架具有一项额外优势，即其具有良好的耐久性，并且不易被哺乳动物细胞降解。这是因为哺乳动物细胞无法产生分解纤维素分子所需的酶。相比之下，使用细胞外基质中的大分子（如胶原蛋白）制备的支架则容易被降解¹⁶ 且可能不适用于长期应用。胶原支架可通过化学交联进行稳定，但由于交联剂本身具有毒性，会影响支架的生物相容性，因此存在权衡。¹⁷相反，纤维素有可能在植入部位长期存留，因为它对哺乳动物细胞的酶降解具有抗性。^18,19,20通过水解预处理调节降解速率，并结合纤维素酶共递送支架，可实现对此的调控。²¹脱细胞植物源性纤维素支架的生物相容性 体内 在一项针对小鼠的研究中也已得到证实²².

经过数亿年的进化，植物不断优化其结构和组成，以提高液体运输和保持的效率。根据默里定律（Murray's law）²³，植物维管束通过分支形成更细的导管，以最小化流体阻力，其结构类似于哺乳动物的血管系统。去细胞化后，植物复杂的导管网络和相互连通的孔隙结构得以保留。鉴于自然界中大量可获取的植物物种，植物来源的支架有望克服当前组织工程中支架设计所面临的诸多限制^24,25。例如，Modulevsky 等 研究表明，将去细胞化的苹果组织植入小鼠背部皮下后，可观察到血管生成和细胞迁移现象²²。同样，Gershlak 等 证实内皮细胞可在去细胞化叶片的维管系统内生长²⁴。在另一项独立实验中，Gershlak 等 还证明心肌细胞可在叶片表面生长并实现收缩功能²⁴。

植物从细胞到宏观尺度都具有复杂的结构层次，即使是目前最先进的制造技术也难以实现这种复杂性。植物组织的复杂层级结构使其强度超过其各组分单独性能的总和²⁶。植物具有多种多样的力学特性，从茎等坚硬且强韧的结构，到叶片等柔韧性和可塑性更高的部分²⁷。叶片在不同物种间存在差异，其大小、形状、断裂强度、维管化程度以及亲水性程度各不相同。总体而言，这些植物特性表明，去细胞化植物可作为独特且高度功能化的医疗器械，例如用于组织工程的支架材料。

本方案重点介绍两种用于脱细胞化植物组织（如叶片和茎）的方法，以将其用作组织工程中的支架材料。第一种方法是基于去垢剂的技术，通过一系列浸泡溶液去除DNA和细胞物质，该技术借鉴自一种广泛用于脱细胞化哺乳动物和植物组织的常用方法。^{6,22,25,28,29,30}第二种方法无需使用去污剂，源自一种 "去骨化" 去除叶片软组织的常用实验方案³¹先前的研究表明，将叶片在漂白剂和碳酸氢钠溶液中缓慢加热有助于分离维管组织与周围的软组织。³¹该技术可追溯至17世纪进行的实验。^th 和 18^th 几个世纪以来，例如阿尔伯图斯·塞巴的工作³² 和 Edward Parrish³³这些实验主要将植物材料（如叶片和果实）浸没在水中较长时间（数周至数月），使其较柔软的组织自然腐解。此处的 "去骨化" 该方法采用更温和的条件，例如在较低温度下延长孵育时间，以去除细胞残留物，同时避免对软组织结构造成显著破坏。在本研究详述的实验中，共使用了三种植物类型： Ficus hispida, Pachira aquatica 和一种 藤黄属描述了两种方法的DNA定量结果、力学测试结果以及对细胞代谢活性的影响。

方案

1. 使用基于去污剂的方法对植物组织进行脱细胞处理

1. 使用新鲜或冷冻的 F. hispida，叶片样品。将未使用的 Fresh 样品置于 -20 °C 冰箱中冷冻保存，以备后续使用（最长一年）。
   注意：可使用几乎所有所需植物的茎或叶组织。长时间储存可能导致组织受损。
   1. 根据样品的预期用途确定待处理样品的大小和形状（即 将样品切成条状非常适用于机械测试应用，而8 mm的圆片样品则适用于多孔培养应用。在室温（20–25 °C）去离子水下，使用锋利洁净的活检打孔器将叶片切割成8 mm的圆片。₂O.
      注意：本方案可用于完整的叶片和茎段，但较小的样品脱细胞速度更快。
   2. 在室温（20–25 °C）下将样品孵育 5–10 分钟，使用去离子 H₂在低速摇床上振荡，以洗涤和/或解冻样品。使用足量的去离子水₂O 以确保所有样品完全润湿。
2. 配制10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）的去离子水溶液₂O. 将样品置于合适的容器中（玻璃或塑料培养皿最为理想），加入SDS溶液以完全覆盖样品。将样品在室温（20–25 °C）下于摇床中孵育5天，摇床设置为低速以防止样品受损。
   注意：容器内样本不可过密，否则会减缓脱细胞进程，并导致SDS处理不均匀。此步骤中，样本应呈现棕色。
   1. 5 天后，将 SDS 溶液更换为去离子 H₂O. 将样品在摇床平台上继续孵育10-15分钟，以充分洗去残留的SDS溶液。
3. 配制1%（v/v）非离子型表面活性剂的10%（v/v）次氯酸钠溶液。制备500 mL溶液时，将5 mL非离子型表面活性剂与50 mL次氯酸钠混合，再加入445 mL去离子H₂O。₂将样品浸入新配制的溶液中。
   注意：非离子型表面活性剂/次氯酸钠溶液的保存期限较短，因此应在配制后48小时内使用。
4. 每24小时更换一次非离子型表面活性剂/漂白剂溶液，直至样品完全透明（参见 图1A 用于视觉对比）。随后将样品置于去离子水中，在摇床中孵育2分钟，以洗去多余的非离子表面活性剂/漂白剂溶液。将摇床调至低速设置，以防止样品受损。
   注意：清除样本所需时间因植物种类和物种而异。样本完全褪色表明去细胞化已彻底完成（可通过DNA定量检测以确认清除效果）。
   1. 将样品冻干后保存，可储存长达一年（推荐使用液氮速冻，也可在-80 °C条件下冷冻），并置于室温（20–25 °C）、低湿度环境中保存。
   2. 在 Tris-HCl（10 mM，pH 8.5）中重悬样本，用量以能够包被样本为宜。使用前用无血清培养基轻轻冲洗样本 2–3 次，每次用移液器操作即 使用150-300 µL进行清洗，适用于标准的24孔板。
      注意：Tris-HCl 缓冲液和无血清培养基（即 DMEM，但任何基础细胞培养基均可替代）在降低SDS处理样本对细胞活力的影响方面，比经去离子水处理的样本更有效₂O alone。

2. 采用无去垢剂脱细胞方法制备样品

注意：本实验步骤的初始部分与步骤 1.1-1.1.2 相同（见上文）。

1. 配制含5% (v/v) 次氯酸钠（NaClO）和3% (w/v) 碳酸氢钠（NaHCO₃）的溶液。在通风橱中将溶液置于加热板上加热并搅拌，使其温度升至60–70 °C，用于处理切成8 mm圆片的 F. hispida 叶片样品。
   注意：碳酸氢钠可用碳酸钠（Na₂CO₃）或氢氧化钠（NaOH）替代。所需温度变化范围较大（从室温至90 °C），应根据所用样品的特性进行调整。
2. 当溶液达到目标温度范围后，将样品浸入其中，并降低搅拌速度以避免损伤样品。待样品明显透明化后（可参考 图1B 进行视觉对比），小心将其从溶液中取出。随后将样品在去离子水（H₂O）中浸泡一次，持续1–2分钟，以去除残留的漂白液。
   注意：样品透明化所需时间差异较大。例如，切碎的欧芹可在10–15分钟内完成透明化，而较厚或较大的样品（如整片叶片或茎段）在高温溶液中可能需要数小时才能完全透明。
3. 将样品进行冷冻干燥，并在低湿度条件下于室温（20–25 °C）保存。

结果

两种方法均获得了适用于细胞培养和组织工程应用的支架。图1展示了使用完整叶片进行基于去污剂的方法以及使用切割样品（直径8 mm）进行无去污剂方法的脱细胞过程总体流程。采用两种方法对Ficus hispida组织进行脱细胞均成功获得了透明且结构完整的样品（图1A和1B）。可以实现对整个植物组织的脱细胞处理（图1A）；然而，较小的样品脱细胞速度更快且效果更佳。基于去污剂的方法存在一个潜在问题，即由于过早从非离子表面活性剂溶液中取出，导致脱细胞不均一（图1C）。无去污剂方法的一个缺点是，在加热浴中长时间孵育可能导致样品损伤（图1D）。

讨论

本文描述了两种植物组织脱细胞的方法。此处展示的结果，结合先前研究的结果²⁵，表明所提出的方案可能适用于多种植物物种，并可在茎和叶上实施。这些操作步骤简单，无需特殊设备，因此植物脱细胞可在大多数实验室中进行。值得注意的是，脱细胞后的支架必须经过功能化处理，以促进哺乳动物细胞的黏附。其他文献中已描述了多种可在植物组织上实现哺乳动物细胞黏附与生长的不同功能化技术²⁵，但这些内容不在本论文的讨论范围之内。

本文所介绍的两种脱细胞化方案的最后一步（图1）对其成功至关重要。在实施任一方法时，切勿使容器内样本过于密集，否则会导致透明不均匀。这些方法可用于整片叶片和茎段，但会延长完全透明所需的时间。务必确保样本完全浸没，以保证整个样本的透明过程一致。理想的脱细胞化应尽可能清除植物组织中的大部分细胞成分，同时将结构损伤降至最低。无洗涤剂方法很可能可根据所需样本的特性进行适当调整。较高的水浴温度可能缩短透明时间，但如果孵育过度，也可能导致样本损伤加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
十二烷基硫酸钠	Sigma Life Science	75746-1KG
曲拉通 X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	论文中引用的非离子型表面活性剂。该试剂黏度较高，吸取时可将移液器吸头尖端剪去一段以便操作。
浓缩漂白剂（8.25% 次氯酸钠）	Clorox	Item #: 31009	标准的浓缩漂白剂。
碳酸氢钠	Acros Organics	217120010	可用氢氧化钠或碳酸钠替代。
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	适用于切割适合放入24孔板的样品。
Belly Dancer-Shake 摇床	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	应使用低速以避免损伤组织。可使用任意型号或品牌的摇床。
Isotemp 加热/搅拌板	Fisher Scientific		可使用任意类型或品牌的加热/搅拌板。
烧杯	任意		可使用任意尺寸的烧杯，只要能容纳样品且不造成过度拥挤即可。
Tris 盐酸盐	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA 检测试剂盒	Life Technologies	P11496	可使用任何现有的双链DNA定量方法。