组织工程应用中植物组织去细胞的两种方法

Summary

在这里, 我们介绍, 并对比两个协议用于 decellularize 植物组织: 洗涤剂为基础的方法和无洗涤剂的方法。这两种方法都留下了植物组织的细胞外基质, 然后可以用作组织工程应用的支架。

Abstract

目前用作组织置换支架的自体、人工合成和动物衍生的移植物由于可用性低、生物兼容性差和成本高而受到限制。植物组织具有良好的特性, 使其独特的适合作为脚手架, 如高表面积, 优良的水传输和保留, 相互连通的孔隙率, 现有的血管网络, 和广泛的机械性能。本文介绍了两种用于组织工程应用的植物去细胞的成功方法。第一种方法是基于洗涤剂浴去除细胞物质, 这与以前建立的用于清除哺乳动物组织的方法相似。第二种是一种无洗涤剂的方法, 它适应于一种隔离叶脉的协议, 包括使用加热漂白剂和盐浴清除叶子和茎。这两种方法都能产生类似机械性能和低细胞代谢影响的脚手架, 从而使用户能够选择更适合其预期应用的协议。

Introduction

组织工程出现在二十世纪八十年代, 以创建活体组织替代品, 并有可能解决重大器官和组织短缺¹。一种策略是使用支架刺激和引导身体再生缺失的组织或器官。尽管先进的制造方法, 如3维印刷生产的脚手架具有独特的物理性能, 但能够制造具有多种可实现的物理和生物特性的脚手架仍然是一个挑战^2,3. 此外, 由于缺乏功能性血管网络, 这些技术在再生3维组织方面受到限制。使用瓣膜动物和人体组织作为支架帮助规避此问题^4,5,6,7。但是, 高成本、批处理可变性和有限的可用性可能限制了瓣膜动物支架的广泛使用⁸。还有人担心潜在的疾病传播给病人和免疫反应的一些瓣膜哺乳动物组织⁹。

纤维素, 来源于植物和细菌来源, 已广泛用于产生生物材料的广泛应用于再生医学。一些示例包括: 骨骼^10、11、软骨^12、13、14和伤口愈合¹⁵。由纤维素组成的脚手架有一个额外的好处, 因为它们是耐用的, 并耐被哺乳动物细胞分解。这是由于哺乳动物细胞不产生分解纤维素分子所必需的酶。相比之下, 使用大分子从胞外基质 (如胶原蛋白) 生产的脚手架容易被分解为¹⁶ , 可能不适合于长期应用。胶原支架可以通过化学交联来稳定。然而, 由于影响到支架的生物相容性的交叉连接器的固有毒性, 有一个权衡 17.反之, 纤维素有可能长期留在植入地点, 因为它不受哺乳动物细胞的酶降解^18,19,20。通过水解预处理和与多种纤维素^酶21 的协同提供, 可以改变降解速率。在小鼠²²的研究中也证明了瓣膜植物衍生纤维素支架的生物相容性在体内。

经过数以百万年的进化, 植物改良了它们的结构和组成, 以提高流体输送和保持的效率。植物血管容器通过分枝成较小的血管来最小化水力阻力, 类似于根据默里定律²³的哺乳动物血管。去细胞后, 该植物的复杂网络的船只和互联毛孔保持。考虑到大量不同种类的植物, 植物衍生的支架有可能克服目前影响组织工程中支架的设计限制^24,25。例如, Modulevsky et表明, 当瓣膜苹果组织植入在鼠标²²的背面时, 血管生成和细胞迁移发生。同样, Gershlak et表明, 内皮细胞可以在瓣膜叶的血管内生长²⁴。在一个单独的实验中, Gershlak et 等人也能够表明心肌细胞可以生长在叶子表面, 并且能够收缩²⁴。

植物还包括从细胞到宏观尺度的复杂组织, 即使用迄今为止开发的最先进的制造技术, 也很难实现。植物组织的复杂层次设计使它们比其成分的总和²⁶强。植物拥有大量不同的机械性能, 从刚性和坚韧的成分, 如茎, 更灵活和柔韧的, 如叶²⁷。叶片的大小、形状、断裂强度、血管化程度等不同种类的不同, 并可进行多种亲水性。总的来说, 这些植物的特性表明, 瓣膜植物可以作为独特和功能强大的医疗设备, 包括组织工程支架。

本议定书的重点是两种方法, decellularize 植物组织, 如叶和茎, 用作支架在组织工程。第一种方法是以洗涤剂为基础的技术, 使用一系列的浴池来去除 DNA 和细胞物质, 这已经从广泛使用的技术 decellularize 哺乳动物和植物组织中进行了调整^{6,22,25 ,28,29,30}。第二种方法是无洗涤剂的, 它适应于通常用于去除叶子的软组织的 "骨架" 协议³¹。先前的工作表明, 在漂白和碳酸氢钠溶液中煨的叶子促进了从周围的软组织分离的血管³¹。该技术可引回到 17^th和 18^th世纪进行的实验, 例如 Albertus 塞巴³²和爱德华帕里什³³的工作。这些实验围绕着离开植物物质, 如叶子和水果, 在水中浸泡了很长一段时间 (几周到几个月), 让柔软的组织自然腐烂。这里的 "骨架" 方法适合使用较温和的条件, 如较长的潜伏期在较低的温度, 以消除细胞残留, 并避免严重扰乱软组织结构。在此详细的实验中, 使用了三种植物类型:榕刚毛、 Pachira aquatica和一个藤黄的种类。对这两种方法的 DNA 定量、力学测试和对细胞代谢活动的影响进行了描述。

Protocol

1. 用洗涤剂为基础的方法去细胞植物组织

1. 使用新鲜或冻结的F. 刚毛, 叶样本。冻结未使用的新鲜样品在一个-20 °c 冷藏库和存储, 以供将来使用 (最多一年)。
   注: 使用几乎任何所需植物的茎或叶组织。延长贮存时间会对组织造成损害。
   1. 根据样品的预期用途确定要处理的样品的尺寸和形状 (即切成条的样品非常适合于机械测试应用, 同时8毫米圆盘样品在多井培养应用中很有用。).在室温下 (20-25 °c) 去离子 H₂O, 用锋利的、干净的活检冲床将叶子切成8毫米的圆盘。
      注: 本协议可用于全叶和茎。然而, 较小的样本将 decellularize 更快。
   2. 将样品在室温 (20-25 °c) 去离子 H₂O 上孵育5-10 分钟, 设置为低速设置以清洗和/或解冻。使用足够的去离子 H₂O 确保所有样品都被彻底润湿。
2. 在去离子 H₂中制备 10% (w/v) 月桂酸钠 (SDS) 的溶液在合适的容器中放置样品 (玻璃或塑料碟是理想的), 并添加 SDS 解决方案, 完全覆盖样品。在室温 (20-25 °c) 上孵育5天的样品, 设置为低速以防止样品损坏。
   注意: 不要过度拥挤容器, 因为这会减慢去细胞过程, 并导致 SDS 不均匀的处理。在这一步骤中, 样品应获得棕色色调。
   1. 5天后, 用去离子 H₂取代 SDS 溶液, 在摇板上孵化样品, 以彻底冲洗任何残留的 sds 溶液。
3. 在 10% (v/v) 漂白剂溶液中制备 1% (v/v) 非离子表面活性剂。为使500毫升溶液, 混合5毫升的非离子表面活性剂与50毫升漂白剂, 然后添加445毫升的去离子 H₂o 淹没样品在新鲜准备的解决方案。
   注: 非离子表面活性剂/漂白剂溶液不具有较长的保质期, 因此, 应在48小时内使用准备。
4. 将非离子表面活性剂/漂白剂溶液每24小时更换一次, 直到完全清除样品 (参照图 1A进行可视比较)。然后在2分钟的摇动板上用去离子水孵化样品, 冲洗掉多余的非离子表面活性剂/漂白剂溶液。将摇板设置为低设置以防止损坏样品。
   注: 清除所用样品所需的时间因植物的种类和种类而异。完全褪色的样品表明完全去细胞 (执行 DNA 量化, 以确保彻底清除)。
   1. Lyophilize 样品保存一年 (使用液氮的闪光冷冻是优选的, 冷冻样品在-80 °c 也是可接受的) 并且存放他们在室温 (20-25 °c) 在低湿气。
   2. 重建样品在三 HCl (10 毫米, pH 值 8.5) 使用足够的涂层样品。在使用前用微在无血清介质中2-3 次冲洗样品 (即使用150-300 µL 每次冲洗, 在标准24井板)。
      注: 三盐酸缓冲液和无血清培养基 (即DMEM, 但任何基本细胞培养基均可替代) 更有效地降低对 SDS 治疗样品的细胞活力的影响, 而不是仅以去离子 H₂O 治疗。

2. 使用无洗涤剂去细胞方法制备样品

注意: 此过程的初始步骤与步骤 1.1-1.1. 2 (见上文) 一致。

1. 准备 5% (v/v) 漂白剂 (次氯酸钠) 和 3% (瓦特/v) 碳酸氢钠 (NaHCO 3) 解决方案.将溶液在通风罩中加热至60-70 摄氏度, 用于F. 刚毛叶片样品在热板上搅拌时切成8毫米的圆盘。
   注: 碳酸氢钠可替代碳酸钠 (Na₂CO₃), 或氢氧化钠 (氢氧化钠)。所需的温度变化很大 (从室温到90°c), 应根据所用样品的性能进行调整。
2. 一旦溶液达到所需的温度范围, 淹没样品并降低搅拌速度, 以避免损坏它们。在明显清除示例后 (参阅图 1B进行可视比较), 请仔细地从浴缸中移除。在去离子 H₂O 上孵化一次样品, 1-2 分钟, 以去除多余的漂白剂溶液。
   注: 清除样品所需的时间可能会有很大差异。例如, 切香菜可以清除10-15 分钟, 而厚和/或较大的样品, 如整个叶子或茎可能需要数小时的高温浴完全清除。
3. Lyophilize 样品并存放在室温下 (20-25 摄氏度) 的低湿度。

Results

这两种方法都产生了适合细胞培养和组织工程应用的支架。图 1显示了去细胞过程的一般工作流, 该流程使用完整的叶为洗涤剂的方法和切割样品 (8 毫米直径) 为无洗涤剂的方法。成功去细胞的榕刚毛组织后, 这两种方法产生了清晰和完整的样本 (图1A 和 1B). 可以 decellularize 整个植物组织 (图 1A);然而, 较小的样品似乎能够更快、更有效地清除。以洗涤剂为基础的方法所观察到的一个潜在问题是由于非离子表面活性剂浴的过早去除 (图 1C) 而导致异构去细胞。无洗涤剂方法的缺点是, 由于在加热的浴缸中长时间孵化 (图 1D), 损坏可能会发生。

Discussion

本文介绍了两种 decellularize 植物组织的方法。这里提出的结果, 加上先前研究的结果²⁵, 表明所提出的协议可能适用于广泛的植物种类, 可以在茎和叶上进行。这些程序是简单的, 不需要专门的设备, 所以植物去细胞可以在大多数实验室进行。值得注意的是, 去细胞后, 支架必须具有功能性, 以促进哺乳动物细胞黏附。不同的功能化技术, 使哺乳动物细胞黏附和生长的植物组织已被描述在其他地方²⁵ , 并不是当前手稿的主题。

这里提出的两个去细胞协议的最后一步 (图1) 对它们的成功至关重要。当执行任一方法时, 不过度拥挤浴缸, 因为这会导致不均匀的清除。这些方法可应用于全叶和茎;但是, 这将增加清除它们所需的时间长度。确保样品完全浸没在整个样品中保持清洁一致。理想情况下, 去细胞应该清除大多数细胞物质的植物组织, 同时尽量减少结构损伤。这是可能的无洗涤剂的方法可以根据需要修改, 以配合所需的标本。较高的浴缸温度可能会导致较快的清除...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
十二烷基硫酸钠	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals， LLC	807426	论文中引用的非离子表面活性剂。非常粘稠的试剂，有助于在吸取移液器吸头时切开移液器吸头的末端。
浓漂白剂（8.25% 次氯酸钠）	Clorox	项目 #： 31009	标准浓漂白剂。
碳酸氢钠	Acros Organics	217120010	可以用氢氧化钠或碳酸钠代替。
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	切割适合 24 孔板的样品
Belly Dancer-Shake 台	Stovall 生命科学	BDRAA115S	使用低速，以免损伤组织。可以使用任何型号/品牌的摇床。
Isotemp 热/搅拌板	Fisher Scientific		可以使用任何样式/品牌的热/搅拌板。
烧杯	Any		可以使用任何尺寸的烧杯，只要它适合您的样品并且不会过度拥挤。
Tris 盐酸盐	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM 康	宁	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA 检测	Life Technologies	P11496	可以使用手头的任何 dsDNA 定量方法。