Method Article

β-aminopropionitrile 诱发主动脉瘤和解剖小鼠模型 Aortopathy 的定量显微 CT 分析

DOI:

10.3791/57589

⸱

July 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Division of Vascular Surgery, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

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本文描述了一个详细的方法, 使用显影铅基硅橡胶灌注小鼠血管的主动脉直径量化的主动脉瘤和解剖模型。

Abstract

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主动脉瘤和解剖与人口中严重的发病率和死亡率有关, 而且可能具有极高的致死性。虽然存在主动脉疾病的动物模型, 但在体内成像的血管已经受到限制。近年来, 微电脑断层扫描 (微 CT) 已成为一种在体内和体外成像大、小血管的首选方式. 结合血管铸型的方法, 我们成功地利用微 CT 来表征β-aminopropionitrile 治疗 C57/Bl6 小鼠主动脉病变的频率和分布。这种方法的技术局限性包括: 不良动物制剂所引入的灌注质量的变化, 适用于容器尺寸量化的适当方法, 以及本程序的不可生存性。本文详细介绍了一种以铅为基础的显影硅橡胶血管内灌注的方法, 用于 aortopathy 在动脉瘤和解剖小鼠模型中的定量表征。除了可视化的主动脉病理, 该方法可用于检查其他血管床在体内或血管床切除后的尸体。

Introduction

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主动脉夹层的发生率为3例, 每10万年1。在美国, 主动脉夹层和动脉瘤性疾病每年超过1万人死亡, 占 1-2% 的死亡在西方国家2。主动脉夹层是由血管内膜层撕裂引起的, 在生理压力下通过主动脉壁层的血液传播而引发。患者脉压升高与解剖和并发症发生率增高有关。增加壁面剪应力与主动脉壁扩张有关, 导致动脉瘤形成3,4。主动脉夹层的后果包括阻塞血液流向远端器官, 包括大脑, 肾脏, 内脏和四肢, 形成慢性动脉瘤, 破裂, 或死亡5,6,7。

目前, 在主动脉瘤和解剖的启动和进展中所涉及的生物化学和细胞过程尚不清楚。可再生动物模型的主动脉瘤和解剖是了解其病理生理学的关键。β-aminopropionitrile (BAPN) 是一种赖氨酰氧化酶抑制剂, 它可以防止弹性蛋白和胶原蛋白的交联, 并已被证明大大改变了血管壁细胞外基质的结构及其生物力学完整性6, 8。用 BAPN 治疗的啮齿动物被用作主动脉瘤和解剖9、10的常见动物模型。

血管成像方法有助于识别血管病理, 确认血管通畅, 评价器官灌注。近年来, 微计算机断层扫描 (显微 CT) 已被用来研究小鼠和类似大小动物的血管。与骨不同的是, 血管的轴向成像是有限的, 因为腔内血液本身相对阴性。然而, 当与血管造影剂结合时, 微 CT 可以对动物 vasculatures 进行详细的三维重建, 用于研究宏观解剖血管病理学11。

所选的对比剂 (见材料表) 是一种含有铬酸铅和硫酸铅的显影硅橡胶。在催化剂的存在下灌注时, 它很快硬化形成一个血管的投射, 在血管的宏观解剖结构中最小的改变, 使血管高度显影与背景组织对比时,检查 x 线。这种造影剂是有利的, 因为它易于处理和避免组织退化和船舶损失由于断裂经常与血管铸型腐蚀有关。由于它治愈的最低萎缩12, 血管清除的血液仍然是专利, 并允许准确评估动物宏观血管在非生存实验。以前的工作已经成功地使用了显影硅橡胶-对比在各种动物研究。具体来说, 在可视化冠状动脉, 肾小球, 胎盘和脑循环11,12,13,14,15的适用性已经显示。本文详细介绍了以铅为基础的显影硅橡胶血管内灌注的开放性左心室穿刺方法, 以定量表征 BAPN 诱导的小鼠主动脉病变的显微 CT 表现。

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Protocol

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《动物处理议定书》由马里兰州马里兰大学机构动物护理和使用委员会 (0116024 号动物议定书) 批准, 并按照 AAALAC 国际标准进行。

1. 试剂的制备

  1. 肝 素
    1. 稀释250µL 的 1000年 U/毫升肝素硫酸酯50毫升的磷酸盐缓冲盐水, 使最终浓度的 5 U/毫升。
    2. 温暖的血气 (5 U/毫升) 磷酸盐缓冲盐水, 这将取代血液在血管中的水浴设置为37°c。
    3. 通过连接所需油管和2个空10毫升注射器, 1 血气盐缓冲液和1用于造影剂, 准备压力控制泵。
    4. 用温暖的血气磷酸盐填充油管, 从压力泵的油管中取出气泡。
  2. 对比剂
    注: 请参阅对比剂套件成分的材料表。
    1. 将色素化合物与稀释剂混合, 以达到1:6 染料稀释率。
    2. 在使用前 (步骤 2.3.12), 添加200µL 的固化剂, 每5毫升整除稀释色素化合物和混合他们好 (4% 按体积)。
      注: 制造商报告工作时间为40分钟。当硅橡胶造影剂在添加固化剂后开始聚合20分钟后, 在输液前立即准备溶液是很重要的。
  3. BAPN 饮用水
    1. 在饮用水中溶解β-aminopropionitrile (BAPN), 以创建最终浓度为3克/升 (根据文献中先前描述的协议改编)9,16,17。
    2. 将含 BAPN 的饮用水管理到一组小鼠, 一旦它们4周的年龄, 直到微 CT 灌注的时间。

2. 手术方法

  1. 动物制剂
    1. 在3周的时间里, 将老鼠戒掉, 维持在12小时 light/12 的黑循环, 并喂养他们标准的啮齿动物周。对于 BAPN 治疗组, 管理新鲜准备 BAPN 饮用水 16-26 周广告随意。为控制动物提供标准的饮用水广告随意。
  2. 麻醉技术
    注:24 h 在 CT 分析前, 执行以下步骤。手术程序的制定, 以准备标本的死后心脏灌注。
    1. 通过一个精确的蒸发器提供 100% O2和3% 异氟醚的感应罐进行麻醉。麻醉诱导后, 停止异氟醚, 并冲洗室与 O2。用 2-2.5% 异氟醚和1升/分2通过鼻锥维持麻醉。
    2. 将感应室和面罩连接到木炭清除剂中, 用于废气吸附保护人员。通过证明没有对有害刺激 (脚趾捏) 的反应, 确保足够的麻醉飞机。
    3. 准备一个由手术托盘和必要的手术器械组成的手术场。
    4. 将动物转移到手术领域, 并将其定位在背卧床。
  3. 手术技术
    1. 使用剪刀, 使中线切口通过皮肤和软组织从中间的耻骨联合到胸骨切口, 延伸通过皮肤和软组织覆盖胸骨。
    2. 使用剪刀, 在剑突过程中的隔膜上创建一个孔进入胸腔。
    3. 用剪刀解剖腹侧胸壁的隔膜, 双边。
    4. 穿过肋软骨, 将肋骨从胸骨的右胸骨边界分开。
    5. 在胸骨尖端 (靠近剑突的过程) 应用一个细止血钳, 移动止血 cranially, 使其定位在鼠标头上。这将收回胸腺和胸骨远离心脏, 暴露心脏和伟大的血管进一步操纵。
    6. 尖锐地解剖心脏和胸壁之间的任何附着物。
    7. 将27口径 IV 导管针连接至注射器预装10毫升的血气磷酸盐缓冲盐水 (5 U/毫升), 并填写所有油管与缓冲, 以消除空气气泡从管的压力泵。
    8. 当液体线上的气泡在准备液体时使用小心可能会阻碍较小容器的填充。限制在动物准备过程中损坏的船只数量, 因为这会导致造影剂泄漏出被切断的容器, 改变完整填充所需的体积, 并将工件引入最终成像。
    9. 用直角钳固定的27口径针刺穿左心室。立即切开右心室或下腔静脉, 排出肝素溶液和血液。
      注: 肝素可作为抗凝剂, 防止动物死后血管凝固。
    10. 用单个注射器泵灌注动物以2毫升/分钟的恒定速率。注意器官的可见烫漂。继续灌注, 直到灌流液从静脉循环排出的血液没有血 (约 5-6 毫升)。停止泵。
    11. 从10毫升注射器中拔下静脉注射导管, 注意不要干扰针在左心室的位置。
    12. 在完全放血后立即将造影剂溶液分离成5毫升整除数, 并在此时添加固化剂 (见步骤 1.2)。把它们搅拌好。将5毫升的造影剂混合成一个10毫升的注射器, 并用它灌注动物。
    13. 对于完整的血管充填 (动脉和静脉), 继续输液通过点, 当它可以看到退出静脉解决方案。寻找成功灌注的迹象, 包括在冠状动脉、肺动脉、肠道和肝脏血管中的铸造剂的可视化。
    14. 造影剂在室温下大约20分钟后会痊愈。固化后, 根据需要, 收获各器官, 并将其固定在10% 中性缓冲福尔马林中。如果样品不用于第二天的显微 CT 扫描, 则修复整个尸体。如果尸体将在随后的一天使用, 把他们放置在一个金属托盘, 并把他们放在冰箱4摄氏度, 以治愈过夜。

3. 显微 CT 扫描及参数

注意: 特定的图像采集参数将取决于使用的机器。

  1. 获取每只老鼠的 x 射线计算机断层扫描图像在使用微 CT 扫描器进行灌注后的第二天, 使用 X 射线管电压为 55 kVp, 电流为150μA, 系统放大系数为 2.19, CCD 相机像素 binning 因子2。这将生成一个有效的像素大小为29µm。
    1. 将小鼠胴体仰卧在微 CT 扫描台上, 获得侦察 X 线扫描。
    2. 在躯干上聚焦57.4 毫米 (轴向) x 37.1 毫米 (transaxial) 的探测器视野, 以图像的主动脉全长。
    3. 获取180个图像投影, 其旋转增量为2度, 每次投影的时间为2800毫秒。
  2. 用改进的 Feldkamp 算法重建图像;重建的体素大小是 29 x 29 x 29 µm3 (切片厚度 = 29 µm) 使用的多模式3D 可视化插件的软件在这里使用。

4. 后处理和渲染

  1. 使用适当的软件将 CT 数据转换为 DICOM 格式。
  2. 分析图像以确定是否存在动脉瘤。测量主动脉弓、降胸主动脉和腹主动脉最宽点的小轴直径 (如前所述18 ) (图 1)。
    注意: 在我们的研究中, 图像被两个独立的观察者 (一个盲人) 分析, 利用 DICOM 查看器来确定动脉瘤是否存在。在主动脉弓、降胸主动脉和腹主动脉的最宽点测量了小轴直径, 如前所述19 (图 1)。BAPN 未治疗小鼠的平均非动脉瘤性动脉段建立正常血管直径作为年龄匹配的控制值。
  3. 动脉瘤被定义为主动脉段的局部或弥散扩张, 直径大于参考直径的50%。根据上述测量结果找到这些数据。

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Results

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为了评估这项议定书, 20 只成年小鼠, 以前描述的混合背景19和 20-30 周的年龄, 有或不 BAPN 治疗, 用铅基显影硅橡胶灌注 (见材料表) 使用上面详细说明的协议。他们在次日进行微 CT 扫描 (图 1和 图 2)。在对照组中, 小鼠的年龄没有显著差异。

小轴直径在这些小鼠被定量。BAPN 治疗小鼠升主动脉的平均直径明显大于未处理的年龄匹配对照组 (1.43 0.56 毫米至0.93 英寸0.11 毫米; p = 0.023, 未配对学生t测试)。与年龄匹配的对照组相比, BAPN 对赖氨酰氧化酶的抑制作用对平均降胸或腹主动脉直径没有显著影响 (...

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Discussion

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微 CT 成像可用于提供高度详细和三维的血管病理重建动物模型。通过使用血管造影增强的培养基, 非增强的软组织, 如血管的流明, 可以区别于那些加强。虽然激光多普勒, microangiography, 磁共振血管造影, 组织学与共焦, 或双光子显微镜可用于评估血管床, 他们通常侧重于有限的研究领域和/或仅限于二维评估。微 CT 提供了一种成本效益高的方法来获得详细的血管结构成像, 这有助于了解潜在的血管生成和血管生物学。其他成像小动物的方法包括活体微 CT 和数字减影血管造影。与这里描述的技术类似,体内微 CT 依赖于外源造影剂来增加分辨率。孔 vc 和 Isovue-370 是2这样的血池造影剂, 可用于微 CT. 孔 vc 已被使用, 并报告有最大平均增强 620 Hounsfield 单位在主动脉20分钟后注射20。其他基于纳米微粒的造影剂也显示了 CT 和 MRI 的潜力。左心室插管不开胸是另一种方法, 整个小鼠灌注显微成像, 已被描述21。超声成像对血管直径的纵向测量是一种可用于生存研究的最终方法...

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢马克. 史密斯在射线成像方面的帮助。这项工作得到了 nih T32 赠款的支持, 为心血管疾病 (蟒蛇) 的跨学科研究, 美国心脏协会 (SMC) 和 nih R35 补助金 (拿 dk)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrofilFlow Tech， IncMV-122我们使用黄色，可以根据需要订购不同的颜色。套件包括 MV 化合物、MV 稀释剂和 MV 固化剂。
肝素 （1000 U/mL）Sagent Pharmaceuticals25021-400-10
磷酸盐缓冲盐水康宁21-031-CV
异氟醚Vet One，MWI502017
3-富马酸氨基丙腈盐Sigma-AldrichA3134
单注射泵Fisher Scientific14-831-200
27 号头皮静脉固定针Exel Int2670927G x 3/4"，12" 管
Inveon Micro-CT 扫描仪Siemens Medical Solutions
Osirix MDPimxmeo SARL版本 8.0.2
Inveon Research WorkplaceSiemens Medical Solutions版本 4.2
啮齿动物 ChowHarlan Teklad2018sx

References

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