利用微计算机断层扫描对β-氨基丙腈诱导的小鼠主动脉瘤与主动脉夹层疾病模型进行定量分析

摘要

本文介绍了一种使用不透射线的含铅硅橡胶灌注小鼠血管系统的详细方法，用于在主动脉瘤和主动脉夹层小鼠模型中定量测定主动脉直径。

摘要

主动脉瘤和主动脉夹层在人群中具有较高的发病率和死亡率，可能极为致命。尽管已存在多种主动脉疾病的动物模型，但对血管系统的体内成像仍受到限制。近年来，微型计算机断层扫描（micro-CT）已成为对大血管和小血管进行体内及体外成像的首选方法。结合血管铸型技术，我们已成功应用micro-CT对经β-氨基丙腈处理的C57/Bl6小鼠中主动脉病变的发生频率和分布特征进行了表征。该方法的技术局限性包括因动物准备不当导致灌注质量的差异、血管尺寸定量方法的规范性问题，以及该操作无法在活体中重复进行。本文详细描述了一种在主动脉瘤和夹层小鼠模型中，通过血管内灌注含铅放射性显影硅橡胶以实现主动脉病变定量表征的方法。除用于观察主动脉病变外，该方法还可用于体内或死后获取的其他血管床的检测。

引言

主动脉夹层的发病率为每年每10万人中3例¹。主动脉夹层和动脉瘤性疾病每年在美国造成超过10,000人死亡，占西方国家全部死亡人数的1%至2%²。主动脉夹层起始于血管内膜层的撕裂，在生理压力作用下血液穿透主动脉壁各层而扩展。患者脉压升高与夹层发生率及并发症风险增加相关。管壁剪切应力升高可导致主动脉壁扩张，进而形成动脉瘤^3,4。主动脉夹层的后果包括血流受阻，影响远端器官（如大脑、肾脏、肠道和四肢）的灌注，以及慢性动脉瘤形成、破裂或死亡^5,6,7。

目前，主动脉瘤和主动脉夹层发生与发展的生化及细胞过程仍不甚清楚。可重复的主动脉瘤和夹层动物模型对于理解其病理生理机制至关重要。β-氨基丙腈（BAPN）是一种赖氨酰氧化酶抑制剂，可阻止弹性蛋白和胶原蛋白的交联，已被证实能显著改变血管壁细胞外基质的结构及其生物力学完整性^6,8。使用BAPN处理的啮齿类动物已被广泛用作主动脉瘤和夹层的常见动物模型^9,10。

血管成像技术在识别血管病变、确认血管通畅性以及评估器官灌注方面具有重要作用。近年来，微型计算机断层扫描（micro-CT）已被用于研究小鼠及类似体型动物的血管系统。与骨骼不同，由于血液本身具有相对较低的X射线衰减性，单纯通过计算机断层扫描对血管进行轴向成像存在局限性。然而，当结合血管内对比剂使用时，micro-CT能够实现动物血管系统的精细三维重建，从而用于宏观解剖学水平的血管病变研究¹¹。

所选用的对比剂（参见材料表）是一种含铬酸铅和硫酸铅的不透射线硅橡胶。在催化剂存在下灌注时，该对比剂可迅速硬化，形成血管系统的铸型，且对血管的大体解剖结构影响极小，使得在放射影像学检查中，血管系统与背景组织相比具有高度的不透射线性。该对比剂的优势在于操作简便，并可避免因血管铸型腐蚀所导致的组织降解和血管丢失。由于其固化过程中收缩极小¹²，清除血液后的血管仍保持通畅，从而可在非存活实验中准确评估动物的大血管结构。既往研究已成功将这种不透射线硅橡胶对比剂应用于多种动物实验。具体而言，已有研究证实其可用于显示冠状动脉、肾小球、胎盘及脑部循环系统^{11,12,13,14,15}。本文中，我们详细描述通过开放性左心室穿刺法进行血管内灌注含铅不透射线硅橡胶的技术方法，并结合显微CT对BAPN诱导的小鼠主动脉病变进行定量表征。

方案

动物操作方案已获马里兰大学巴尔的摩分校机构动物护理和使用委员会批准（动物实验方案编号 0116024），并依照国际实验动物评估和认证协会（AAALAC International）标准进行。

1. 试剂的准备

1. 肝素
   1. 将 250 µL 浓度为 1000 U/mL 的硫酸肝素稀释于 50 mL 磷酸盐缓冲液中，配制成终浓度为 5 U/mL 的溶液。
   2. 将含肝素（5 U/mL）的磷酸盐缓冲液置于 37 °C 水浴中预热，该溶液将用于替代血管系统中的血液。
   3. 准备压力控制泵，连接所需管路和两个空的 10 mL 注射器，分别用于盛装含肝素的缓冲盐水和造影剂。
   4. 用预热的含肝素磷酸盐缓冲液填充管路，并排除压力泵管路中的气泡。
2. 造影剂
   注意：请参阅材料表以获取造影剂试剂盒的组成成分。
   1. 将着色化合物与稀释液按 1:6 的染料与稀释液比例混合。
   2. 在使用前（步骤 2.3.12），向每份 5 mL 稀释后的着色化合物中立即加入 200 µL 固化剂，并充分混匀（体积比为 4%）。
      注意：制造商报告的工作时间为 40 分钟。由于硅橡胶造影剂在加入固化剂后约 20 分钟开始聚合，因此必须在灌注前立即配制该溶液。
3. 含 BAPN 的饮用水
   1. 将 β-氨基丙腈（BAPN）溶解于饮水中，配制成终浓度为 3 g/L 的溶液（根据文献中先前描述的方案进行修改）^9,16,17。
   2. 从 4 周龄开始，向一组小鼠提供含 BAPN 的饮用水，直至进行显微 CT 灌注实验时为止。

2. 手术步骤

1. 动物准备
   1. 在3周龄时断奶小鼠，维持12小时光照/12小时黑暗循环，饲喂标准啮齿类动物饲料。对于BAPN处理组，给予新鲜配制的BAPN饮用水，持续16至26周 随意摄取为对照动物提供标准饮用水 随意摄取.
2. 麻醉技术
   注意：在进行CT分析前24小时，执行以下操作。实施手术操作以准备标本，用于死后经心腔灌注。
   1. 通过含有100% O₂的诱导麻醉罐诱导麻醉₂ 和通过精密蒸发器输送的3%异氟烷。麻醉诱导后，停止异氟烷供应，并用O₂冲洗麻醉舱₂使用2-2.5%异氟烷和1 L/min氧气维持麻醉₂ 通过鼻罩
   2. 将诱导室和面罩均连接至活性炭废气吸附装置，以保护操作人员。通过检测对有害刺激（如脚趾夹捏）无反应来确认麻醉深度是否充分。
   3. 准备一个由手术托盘和必要手术器械组成的手术区域。
   4. 将动物转移至手术区域，并使其呈仰卧位。
3. 手术技术
   1. 使用剪刀从耻骨联合中点至胸骨切迹做正中切口，切开皮肤及软组织，并延伸至胸骨表面的皮肤和软组织。
   2. 使用剪刀在剑突处的膈肌上剪开一个孔，以进入胸腔。
   3. 使用剪刀双侧解剖腹侧胸壁的膈肌。
   4. 在右侧胸骨缘处切断肋软骨，使肋骨与胸骨分离。
   5. 用精细止血钳夹住胸骨末端（靠近剑突处），并将止血钳向头侧移动，使其位于小鼠头部上方。此举可将胸腺和胸骨从心脏处牵开，暴露心脏及大血管，以便进一步操作。
   6. 锐性分离心脏与胸壁之间的所有连接组织。
   7. 将27号静脉导管针连接至预装有10 mL肝素化磷酸盐缓冲液（5 U/mL）的注射器，并用缓冲液充满所有导管，以排除压力泵管路中的气泡。
   8. 在配制液体时需格外小心，因为液体管路中的气泡可能会阻碍小血管的充盈。在动物准备过程中应尽量减少血管损伤，否则会导致造影剂从断裂的血管中泄漏，改变完全充盈所需的体积，并在最终成像中引入伪影。
   9. 用固定在直角钳上的27号针头穿刺左心室。立即切开右心室或下腔静脉，以排出肝素溶液和血液。
      注意：肝素用作抗凝剂，以防止动物死亡后血液在血管中凝固。
   10. 使用单个注射泵以 2 mL/分钟的恒定速率灌注动物。注意观察器官出现的明显苍白现象。持续灌注直至静脉循环流出的灌注液中无血液（约 5 - 6 mL）。停止泵送。
   11. 将静脉导管管路从10 mL注射器上断开，注意不要移动针头在左心室中的位置。
   12. 在彻底放血后，立即将造影剂溶液分装为5 mL等份，并在此时加入固化剂（参见步骤1.2），充分混匀。用10 mL注射器吸取5 mL造影剂混合液，对动物进行灌注。
   13. 为实现血管（动脉和静脉）的完全灌注，需在观察到灌注液从静脉端流出后继续灌注。成功的灌注表现包括在冠状动脉、肺动脉、肠和肝脏血管系统中可见造影剂填充。
   14. 对比剂在室温下约20分钟后固化。固化后，根据需要收获各个器官，并将其固定于10%中性缓冲甲醛溶液中。如果样品次日不用于显微CT扫描，则将整个尸体进行固定。若尸体将于次日使用，则将其置于金属托盘上，放入4 °C冰箱中过夜固化。

3. 显微CT扫描及参数

注意：具体的图像采集参数将取决于所使用的设备。

1. 使用微型CT扫描仪，在灌注后的第二天获取每只小鼠的X射线计算机断层扫描图像，X射线管电压为55 kVp，电流为150 μA，系统放大倍数为2.19，CCD相机像素合并因子为2。此设置可获得29 µm的有效像素尺寸。
   1. 将小鼠尸体仰卧置于微型CT扫描仪载物台上，并获取定位X射线扫描图像。
   2. 将探测器视野（57.4 mm（轴向）× 37.1 mm（横向））聚焦于躯干区域，以完整成像主动脉全长。
   3. 采集180个投影图像，旋转步进为2度，每个投影采集时间为2800 ms。
2. 使用改进的Feldkamp算法重建图像；采用此处所用软件的Multimodal 3D Visualization插件，重建后的体素尺寸为29 × 29 × 29 µm³（层厚 = 29 µm）。

4. 后处理与渲染

1. 使用适当的软件将CT数据转换为DICOM格式。
2. 分析图像以确定是否存在动脉瘤。按照先前描述的方法¹⁸，测量主动脉弓、降胸主动脉和腹主动脉最宽处的短轴直径（图1）。
   注：在本研究中，由两名独立观察者（其中一名为盲法）使用DICOM图像查看器分析图像，以判断是否存在动脉瘤。主动脉弓、降胸主动脉和腹主动脉最宽处的短轴直径测量方法如前所述¹⁹（图1）。未接受BAPN处理的小鼠的非动脉瘤性动脉节段的平均直径被用作正常血管直径，作为年龄匹配的对照值。
3. 动脉瘤定义为主动脉节段局部或弥漫性扩张，其直径超过参考直径的50%。根据上述测量结果确定动脉瘤位置。

结果

为了评估本方案，采用前述混合背景的20只雄性成年小鼠¹⁹，年龄为20至30周，无论是否接受BAPN处理，均按照上述方案灌注含铅放射性显影硅橡胶（见材料表）。次日对小鼠进行显微CT扫描（图1和 图2）。各比较组间小鼠年龄无显著差异。

随后对这些小鼠的短轴直径进行了量化。与未经处理的同龄对照组相比，BAPN处理组小鼠升主动脉的平均直径显著增大（1.43 ± 0.56 mm） 与 0.93 ± 0.11 mm p = 0.023，非配对 t 检验 t-test）。与年龄匹配的对照组相比，使用BAPN抑制赖氨酰氧化酶对降胸主动脉或腹主动脉的平均直径无显著影响p

讨论

Micro-CT 成像可用于在动物模型中提供高度详细且三维的血管病理重建图像。通过使用血管内对比增强介质，可将未增强的软组织（如血管管腔）与增强组织区分开来。尽管激光多普勒、微血管造影、磁共振血管造影、结合共聚焦或双光子显微镜的组织学可用于评估血管床，但这些方法通常仅限于局部区域研究和/或局限于二维评估。Micro-CT 提供了一种经济有效的方法，用于获取血管结构的详细成像，有助于深入理解潜在的血管生成及血管生物学。其他用于小动物成像的方法包括 in vivo micro-CT 和数字减影血管造影。与本文所述技术类似，in vivo micro-CT 依赖外源性对比剂以提高分辨率。Fenestra VC 和 Isovue-370 是两种可用于 micro-CT 的血池对比剂。已有研究使用 Fenestra VC，报道其在注射后 20 分钟主动脉中的平均最大增强值约为 620 Hounsfield 单位²⁰。其他基于纳米颗粒的对比剂在 CT 和 MRI 中也显示出应用潜力。无需开胸的左心室导管插管术是另一种已报道的用于小鼠整体灌注以进行微成像的方法

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Microfil	Flow Tech, Inc	MV-122	我们使用黄色，可根据需要订购其他颜色。试剂盒包含 MV-Compound、MV-稀释液和 MV-固化剂。
肝素（1000 U/mL）	Sagent Pharmaceuticals	25021-400-10
磷酸盐缓冲液	Corning	21-031-CV
异氟烷	Vet One, MWI	502017
富马酸氨基丙腈盐	Sigma-Aldrich	A3134
单通道注射泵	Fisher Scientific	14-831-200
27 号头皮静脉套管针	Exel Int	26709	27G x 3/4", 12" 管
Inveon 小动物 Micro-CT 扫描仪	Siemens Medical Solutions
Osirix MD	Pimxmeo SARL		版本 8.0.2
Inveon 研究工作平台	Siemens Medical Solutions		版本 4.2
啮齿类动物饲料	Harlan Teklad	2018sx