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A11阳性β-淀粉样蛋白寡聚体的制备及点印迹分析鉴定

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DOI：

10.3791/57592

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2018年5月22日

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1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

本文内容

摘要

本方案描述了如何从合成肽制备Aβ寡聚体 体外 并通过点印迹分析评估Aβ寡聚体的相对含量。

摘要

β-淀粉样蛋白（Aβ）是一种具有内在自聚集倾向的疏水性肽。在多种聚集形态中，Aβ寡聚体被广泛认为是阿尔茨海默病（AD）进展过程中主要的神经毒素，并被视为AD发病机制中的关键事件。因此，Aβ寡聚体抑制剂可能阻止神经变性，并有望开发成为可改变疾病进程的AD治疗药物。然而，不同的Aβ寡聚体形成方案可能导致产生具有不同特性的寡聚体。此外，目前尚缺乏有效的方法用于高通量筛选Aβ1-42 寡聚体抑制剂。A11 抗体可与一组有毒 Aβ 结合1-42 具有反平行β-折叠结构的寡聚体。在本方案中，我们描述了如何制备A11阳性Aβ1-42 来自合成Aβ的富含寡聚体的样品1-42 肽 体外 并评估 A11 阳性 Aβ 的相对含量1-42 通过使用 A11 和 Aβ 进行点印迹分析检测样品中的寡聚体1-42特异性6E10抗体。利用本方案，可筛选针对A11阳性Aβ的抑制剂1-42 寡聚体也可通过半定量实验结果进行筛选。

引言

阿尔茨海默病（AD）是全球影响老年人群最重要的神经退行性疾病之一1普遍认为，β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集可能是阿尔茨海默病（AD）最主要的致病因素。Aβ聚集体是老年斑的主要成分，而老年斑是AD患者脑组织中的重要生物学标志之一。此外，Aβ聚集体（尤其是寡聚体）具有强烈的神经毒性，可能在AD病程进展中导致神经元死亡。因此，抑制Aβ寡聚体的形成可能有助于防止神经退行性病变，而Aβ寡聚体抑制剂有望被开发为可改变疾病进程的AD治疗药物。许多研究已采用合成的Aβ多肽来诱导寡聚体的形成 体外，探索人工Aβ寡聚体的形态与结构，并利用其研究Aβ寡聚体的抑制剂 体外 模型2,3,4。然而，不同的 体外 Aβ寡聚体的形成方案可能导致具有不同形态特征的寡聚体，这或许会引起不同研究团队之间结果无法相互比较。因此，迫切需要建立一种标准化的Aβ寡聚体形成方案。

迄今为止，直接检测Aβ寡聚体的方法报道较少。透射电子显微镜（TEM）、非变性凝胶电泳、酶联免疫吸附测定（ELISA）和点印迹分析可用于检测Aβ寡聚体的含量和/或形态。 体外5,6例如，可利用透射电子显微镜（TEM）观察Aβ寡聚体的形态与结构。通过非变性凝胶电泳可测定Aβ聚集体的相对含量及其分子大小。酶联免疫吸附测定（ELISA）可用于检测血清、血浆及脑组织提取物中的Aβ寡聚体。最后，点印迹分析（dot blotting analysis）是一种用于蛋白质检测、分析与鉴定的技术，借助寡聚体特异性及Aβ特异性抗体，可用于评估不同样本中Aβ寡聚体的相对浓度。此外，点印迹分析具有显著的时间优势，因其无需进行凝胶电泳及凝胶转膜步骤。因此，该方法通常用于筛选潜在的Aβ寡聚体抑制剂。本实验方案的总体目标是描述一种相对简单、可靠且可重复的Aβ寡聚体制备方法。1-42 富含寡聚体的样品，用于分析Aβ的含量1-42 通过点印迹分析检测Aβ寡聚体，并利用半定量实验结果筛选Aβ寡聚体抑制剂。

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方案

1. 溶液配制

注意：试剂来源见材料表。

  1. 通过将5 g牛血清白蛋白（BSA）加入100 mL双蒸水中，配制5% BSA溶液。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。
  2. 通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗寡聚体抗体A11溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。
  3. 通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗Aβ抗体6E10溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。
  4. 通过将10 µL抗体原液加入10 mL 5% BSA溶液中，配制抗纤维状寡聚体抗体OC溶液（1:1,000）。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。
  5. 通过将24 g Tris碱和88 g NaCl加入1,000 mL双蒸水中，配制Tris缓冲盐水（TBS）储备液。调节pH至7.4。将溶液在4 °C下保存，可保存最多3个月。
  6. 通过将1 mL Tween-20加入100 mL TBS储备液和900 mL双蒸水中，配制含Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）溶液。
  7. 通过将10 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H + L）加入10 mL TBST溶液中，配制二抗溶液。充分涡旋混匀。将溶液在4 °C下保存，可保存最多1个月。
  8. 将3.68 g姜黄素溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，制成10 mM姜黄素储备液。
  9. 将5 mg合成Aβ1-42溶解于2 mL 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）中，制成2.5 mg/mL Aβ单体溶液。在室温（25 °C）下放置20分钟。分装为每份100 µL，并在-20 °C下保存，可保存最多6个月。
    注意：该步骤应尽快操作。移液枪头应剪去尖端，以确保准确移液。
  10. 按体积比1:1混合电化学发光（ECL）液A和B，配制ECL工作液。该溶液应在使用前现配。

2. 样品制备

注意：在进行点印迹分析前 2 天完成样品制备。

  1. 向一管 Aβ1-42 单体溶液中加入 900 µL 双蒸水，使 Aβ1-42 的浓度为 0.25 mg/mL。将混合物在室温下放置 20 分钟。
  2. 用高纯度氮气吹干溶液，直至其体积约为 850 µL。此时 Aβ1-42 溶液的浓度约为 0.29 mg/mL。
    注意：应不时摇动溶液，以确保 HFIP 完全挥发。通常情况下，经过约 30 分钟的吹干后，残留溶液体积约为 850 µL。
  3. 用双蒸水将姜黄素储备液稀释为姜黄素工作液（0.2 和 2 µM）。按体积比 1:1 混合 Aβ1-42 溶液与姜黄素工作液，姜黄素的最终浓度分别为 0.1 和 1 µM。
    注意：如有需要，潜在的寡聚体抑制剂可按任意比例与 Aβ1-42 溶液混合。
  4. 将溶液置于磁力搅拌器上持续振荡（参见材料表）。
    1. 将一个塑料分隔盒固定在磁力搅拌器上，在盒子的两个角落各放置一根磁力搅拌子，并将样品管置于盒子中央。
    2. 在室温（25 °C）下振荡 48 小时。
      注意：磁力搅拌器的转速约为 60 rpm。
  5. 在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟，收集上清液。

3. 点印迹分析

注意：所有孵育步骤均在水平摇床中进行。

  1. 将硝酸纤维素膜切成1厘米宽的条带。
    注意：硝酸纤维素膜的宽度可根据实验需要进行调整。
  2. 将2 µL样品均匀地点在两条条带（条带1和条带2）上，每点间隔0.5 cm。
  3. 将条带置于室温下5分钟，直至条带上的液滴干燥。
  4. 用5% BSA溶液在室温下孵育条带30分钟。
  5. 用TBST溶液在室温下冲洗条带5分钟。
  6. 吸除TBST溶液。在室温下，将条带1与抗寡聚体抗体A11溶液孵育1小时，条带2与抗Aβ抗体6E10溶液孵育1小时。
  7. 用TBST溶液在室温下冲洗条带三次，每次5分钟。
  8. 吸除TBST溶液。在室温下用二抗溶液孵育条带40分钟。
  9. 用TBST溶液在室温下冲洗条带三次，每次5分钟。
  10. 将混合的ECL溶液均匀地加在条带表面，在自动化学发光成像系统中进行曝光（参见材料表）。
    注意：通常每张膜使用300 µL ECL溶液即可。曝光过程中必须保持膜湿润。曝光时间由成像系统自动计算。
  11. 使用ImageJ（美国国立卫生研究院）或其他图像处理软件进行灰度分析，以获得半定量结果。

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结果

为了研究Aβ1-42单体在制备后是否能够形成Aβ1-42寡聚体，采用了透射电子显微镜（TEM）分析。在HFIP溶解的Aβ1-42单体样品中未观察到可见的聚集体（图1A）。此外，在振荡培养48小时后的Aβ1-42样品中，主要观察到直径约为10 - 80 nm的球形聚集体，表明Aβ1-42在制备后能够形成寡聚体（图1B）。

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讨论

在本实验方案中，我们报道了一种制备含Aβ1-42寡聚体样品的方法，并通过点印迹分析检测A11阳性Aβ1-42寡聚体的含量。尽管我们制备富含Aβ1-42寡聚体样品的方法简便、可靠且可重复，但仍有一些注意事项需要关注。首先，使用HFIP溶解合成的Aβ1-42多肽。聚集态的Aβ1-42多肽在HFIP溶液中可解聚为单体。然而，HFIP易挥发，且黏度很低。因此，应尽快将Aβ1-42多肽溶解于HFIP中，并迅速分装HFIP溶液，以减少操作过程中HFIP的潜在损失。此外，此步骤中应剪断移液器吸头，以确保准确移液。其次，使用高纯度氮气将溶液中的HFIP吹干。在此过程中，应不时振荡Aβ1-42溶液，以确保HFIP完全挥发。该步骤结束时，溶液中不应再有HFIP气味。通常，30分钟的吹干可使HFIP浓度降至0.1%以下。据文献报道，在此浓度下HFIP不会影响Aβ1-42的构象转变7。第三，在制备含Aβ1-42寡聚体的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（U1503223、81673407、21475131）、浙江省公益性技术应用研究项目（2016C37110）、宁波市国际科技合作项目（2014D10019）、宁波市生命科学与健康创新团队项目（2015C110026）、宁波市科技惠民项目（2017C50042）、李达三叶耀珍李国达海洋生物制药发展基金以及宁波大学王宽诚基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A11（ab126892 兔多克隆抗体，针对淀粉样蛋白寡聚体）AbcamGR91739-58
6E10（β-淀粉样蛋白兔单克隆抗体）Cell Signalling Technology2454S
OC（抗淀粉样纤维OC抗体）MilliporeAB2286
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L） BeyotimeA0208
Aβ1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇AladdinI1523078
姜黄素SigmaC1386
牛血清白蛋白V型SolarbioA8020
氯化钠Sangon BiotechD920BA0003
十二烷基硫酸钠SCR30166428
TRISSolarbioT8060
甘氨酸SolarbioG8200
 二甲基亚砜SolarbioD8370
5×非变性凝胶PAGE蛋白MarkerBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
纯硝酸纤维素印迹膜Pall CorporationT50189
甲醇SCR10014118
乙醇SCR10009218
超低分子量蛋白Marker SolarbioPR1300
转膜膜Immobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
考马斯亮蓝快速染色液BeyotimeP0017
全自动化学发光成像系统TanonTanon 5200
Image J美国国立卫生研究院
图像处理软件AdobePhotoshop CS6
磁力搅拌器上海沪西

参考文献

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
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  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
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  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
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  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

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A11 TBST

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