方法文章

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

DOI：

10.3791/57599

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2018年6月2日

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1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

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本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5 小鼠胰腺前体细胞及其相关间充质中生成表达胰岛素的三维胰腺类器官的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胰腺是一个复杂的器官，由多种不同类型的细胞组成，这些细胞协同作用以调节血糖稳态和消化过程。这些细胞类型包括分泌酶的腺泡细胞、负责将酶运输到肠道的分支状导管系统，以及产生激素的内分泌细胞。

内分泌β细胞是体内唯一能够产生胰岛素以降低血糖水平的细胞类型。糖尿病是一种以β细胞缺失或功能障碍为特征的疾病，其发病率正达到流行病水平。因此，建立可用于筛选药物和细胞治疗手段的β细胞发育研究方案至关重要。尽管对小鼠发育过程的实验研究必不可少， 体内 研究工作繁琐且耗时。培养细胞为筛选提供了更为便捷的平台；然而，它们无法维持在体内所存在的细胞多样性、结构组织以及细胞间的相互作用 在体内 因此，开发新工具以研究胰腺器官发生和生理学至关重要。

胰腺上皮细胞自器官发生初期便与间充质紧密关联，随着细胞的组织化和分化，最终形成结构复杂且具备生理功能的成熟器官。胰腺间充质为内分泌系统的发育提供了多种重要信号，其中许多信号机制尚未被充分阐明，因此在体外模拟过程中难以重现 体外 培养。本文描述了一种培养三维、含间充质细胞复合体的小鼠类器官（称为胰腺类器官）的实验方案。取e10.5小鼠胰腺芽组织，进行解剖、解离，并在无支架环境中培养。这些悬浮细胞可自组装形成类器官，其间充质包裹发育中的胰腺类器官，并伴随大量内分泌β细胞以及腺泡细胞和导管细胞的生成。该体系可用于研究器官发生过程中的细胞命运决定、结构组织与形态发生、细胞间相互作用，或用于药物、小分子化合物及遗传筛选。

引言

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阐明正常发育与生理学的机制对于理解疾病病因并最终开发治疗方法至关重要。尽管干细胞的培养与分化能够实现对发育过程的快速、高通量分析，但该方法受限于当前对调控细胞命运机制的认知水平，且仅能在相对均一的二维人工环境中模拟发育过程1,2。体内发育不仅受到外部因素的影响——微环境中的不同细胞类型通过旁分泌信号和结构支持引导器官发生，而且这些细胞的功能也依赖于周围环境提供的指导信号3,4,5。鉴于这些外部信号的重要性、现有分化方案的局限性以及体内小鼠模型实验的繁琐性，亟需建立新的实验体系以深入研究基本的发育过程与生理机制。

三维复杂类器官培养方案的出现为研究器官发生、生理功能、药物疗效甚至发病机制提供了一个便捷且高度相关的系统. 建立用于不同系统的鼠类类器官，例如胃6 和肠道7 拓展了我们对器官发生的理解，提供了一种研究发育复杂性的工具，其限制较以往更少 体内 和 体外 模型。由于小鼠类器官培养技术的进步....

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方案

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本方法中描述的所有动物实验均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会批准。

1. 小鼠胚胎第10.5天胰腺前体细胞的制备

注意：此方案在第2步之前无需在无菌条件下进行，但最好在使用前对解剖工具进行灭菌，并用70%乙醇喷洒。

  1. 准备解剖操作时，装满一个冰桶，并将一容器磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上。用70%乙醇清洁两把尖头镊子和解剖剪刀。在解剖区域附近放置一个容器，内含至少三根硼硅酸盐毛细管、一根口吸管、一个打火机以及经过滤的1,000 µL移液器吸头。
    1. 准备至少1 mL浓度为1.25 mg/mL的冷dispase溶液，用无菌水稀释后置于冰上的12孔板第二孔中。将PBS加入12孔板的第一、第三和第四孔。将1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液加入1.5 mL离心管中并置于冰上。预热摇床培养箱至37 oC。
  2. 根据IACUC指南对孕10.5天（e10.5）的小鼠实施安乐死。用70%乙醇喷洒小鼠腹部以清洁该区域，然后使用剪刀和镊子在小鼠生殖器部位做V形切口，并向上延伸至横膈膜。
    ​注：本方案中阴道栓的出现记为第0.5天。使用5–6周龄小鼠时，体重增加超过2 g可作为成功交配的次要判断依据。
    1. 小心地切下子宫：在子宫最上侧部分做切口，将器官向上拉离小鼠体腔，沿切口向下延伸至生殖区....

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结果

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在e10.5时期，从小鼠子宫角中仔细解剖胚胎，应能在PBS中获得无损伤的胚胎，以供进一步解剖（图1A）。可高效地将胃肠道从胚胎中分离（图1B），从而在肠道与胃的连接处清晰识别背侧胰腺芽（图1C-F）。e10.5时期的胰腺芽已有文献描述；其前体细胞应表达 Pdx1, Sox9, Ptf1a 和 Hes120,21,22,23。在完成组织处理步骤后，可通过光学显微镜观察到解离的胰腺单细胞或小细胞团（

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讨论

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细胞培养模型的发展对于准确模拟发育过程、生成具有临床相关性的细胞类型、测试药物疗效，甚至用于患者移植至关重要。然而，在培养皿中人工重现发育过程仍具挑战性，因为我们对器官发生和生理机制的理解还远未完善。 体内 因此 体外 细胞的生成效率低下，功能不完善，无法长期维持，或与体内相应的细胞相比存在其他异常。这是因为在发育和生理过程中，多种不同类型的细胞相互作用，并伴随着复杂的形态发生改变。通过结合实验操作的便利性与 体外 系统，同时保留其复杂性 体内 发育将为生物医学研究提供一种有价值的工具。

类器官的开发为模拟发育过程的复杂性提供了一条极具前景的研究路径。本实验方案中，我们介绍了如何制备保留天然间充质并能高效生成内分泌细胞的胰腺类器官（pancreatoids），尽管此类胰腺类器官不表现出葡萄糖响应性。该工具可用于在维持组织异质性的培养体系中研究发育机制及功能特性 体内此外，该方法可用于遗传筛选或小分子及药物的筛选。这一点尤其具有重要意义，因为在相对均一的细胞培养体系中测试候选药物，可避免这些化合.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Jolanta Chmielowiec 对本实验方案及手稿撰写的有益讨论。同时感谢 Benjamin Arenkiel 提供共聚焦显微镜的使用权限。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（P30-DK079638 资助 M.B.，T32HL092332-13 资助 M.A.S. 和 M.B.）、McNair 医学基金会（资助 M.B.）以及贝勒医学院智力与发育障碍研究中心共聚焦成像核心（由 Eunice Kennedy Shriver 国家儿童健康与人类发育研究所资助 NIH U54 HD083092）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
校准微量毛细移液管用吸管组件Sigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure 无核酸酶水ThermoFisherD119
硼硅酸盐毛细管Sutter InstrumentsGB1007515外径 1 mm，内径 0.75 mm，长度 1.5 cm
CaCl₂Sigma-AldrichC5080
防细胞黏附U型底96孔微孔板Greiner Bio-One650970U型底
Centrifuge 5424 R 离心机Eppendorf5401000013
氯仿Sigma-Aldrich233306
嗜铬粒蛋白A抗体Abcamab15160
紧凑型模块化体视显微镜 M60Leica
Countess 自动细胞计数仪InvitrogenC10310
Countess 细胞计数仪专用载片InvitrogenC10312
CryoStar NX70 冷冻切片机ThermoFisher957000L
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG7528
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）Roche10 236 276 001粉末
DBA 抗体Vector LabRL-1032
Dispase II 粉末Gibco17105041
DMEM/F-12 培养基（含 HEPES）Gibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-100.05 × 0.02 mm；钛材质；生物学尖端
EGF（表皮生长因子）Sigma-AldrichE9644
乙醇，200 证明Decon Laboratories2716
Forma Steri Cycle CO₂ 培养箱ThermoFisher370
Fluoromount-G 封片剂Southern BiotechOB10001
来源于猪肠黏膜的肝素钠盐Sigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 抗体Santa Cruz BioTechnologysc-271408多克隆小鼠 IgG
异丙醇Fishera4164
Isothesia 异氟烷，USP 标准Henry Schein11695-6776-2
胰岛素抗体DakoA056401多克隆豚鼠抗体
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut 血清替代物Invitrogen10828028
Leica TCS SPE 高分辨率光谱共聚焦显微镜Leica
MgCl₂Sigma-Aldrich442615
小鼠 C 肽 ELISA 试剂盒ALPCO80-CPTMS-E01
小鼠超敏胰岛素 ELISA 试剂盒ALPCO80-INSMSU-E01
MX35 微型切片机刀片ThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO₃Sigma-AldrichS3817
NaH₂PO₄Sigma-Aldrich
正常驴血清Jackson Immuno Research017-000-121
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
PBS 1×Corning21-040-CV
Pdx1 抗体DSHBF6A11单克隆小鼠 IgG1
Peel-A-Way 一次性包埋模具VWR15160-157
青霉素-链霉素溶液CorningMT30002CI
PMA（佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯）Sigma-AldrichP1585
Protein LoBind 微量离心管Eppendorf224310811.5 mL 容量
重组人 FGF-10 蛋白R&D Systems345-FG
重组人酸性 FGF 蛋白Peprotech100-17A
重组人 R-Spondin I 蛋白R&D Systems4546-RS
BenchRocker 2D 混匀仪BenchmarkBR2000
蔗糖 500 gSigma-AldrichS0389
SuperFrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
Super Pap Pen 防扩散笔Electron Microscopy Sciences71310
Thermomixer R 恒温混匀仪Eppendorf05-412-401
Tissue Tek O.C.T. 包埋剂Sakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzol 试剂Invitrogen15596018
TrypLE Express 酶解液Invitrogen12604039(1×)，无酚红
台盼蓝染色液Invitrogen15250061用于细胞计数载片
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）Corning25-052-CI
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco25200072含酚红
超低吸附24孔板Corning3473
超低吸附96孔球形培养板Corning4520
波形蛋白抗体EMD MilliporeAB5733多克隆鸡 IgY
Vortex Genie 涡旋振荡器BioExpresS-7350-1
Y-27632 二盐酸盐R&D Systems1254又称 ROCK 抑制剂
Zeiss 710 共聚焦显微镜Zeiss

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bio....

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