在多重基因分型与质谱技术下的临床队列研究中进行候选基因检测

摘要

鉴定参与复杂人类疾病的遗传变异有助于我们发现新的作用机制。本文展示了一种多重基因分型方法，可用于候选基因或基因通路分析，在低成本条件下实现高覆盖度，并适用于基于队列的研究。

摘要

复杂疾病通常由多个常见的遗传变异共同导致，这些变异影响个体对疾病的易感性。本文介绍一种经济高效的标签单核苷酸多态性（tag SNP）分析方法，通过基于质谱的多重基因分型检测技术，在临床队列中研究基因通路与疾病的关联。我们以食物过敏候选位点Interleukin13（IL13）为例进行说明。该方法利用基因组区域内的连锁不平衡（LD）共享特征，有效提高位点覆盖效率。选择出的LD相关SNP被设计为多重检测体系，可同时分析多达40个不同的SNP，显著提升成本效益。采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标位点，随后进行单碱基延伸反应，扩增产物通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术进行检测。原始数据使用基因型判读软件进行分析，依据严格的质控标准和阈值设定，确定高置信度的基因型结果，并输出用于后续数据分析。

引言

在人类复杂疾病中，遗传变异会影响疾病易感性，量化这些变异有助于理解发病机制、识别高风险患者群体以及对治疗产生应答的患者。事实上，精准医学的实现依赖于利用基因组信息来识别患者亚群¹不幸的是，在复杂的疾病生物学领域，疾病表型往往由显著的遗传异质性、低外显率和可变的表达度所决定，因此通过全基因组方法鉴定新候选基因所需的队列规模通常大到难以实现²或者，一种有针对性的候选基因方法从一个特定的候选基因开始 先验的 关于特定基因/通路在疾病病因学中的假设³通路分析工具常用于研究已鉴定靶点位点的病理生理机制，可生成大量待验证的候选通路。本文展示了一种多重基因分型方法，可在单次检测中同时分析数十至数百个单核苷酸多态性位点（SNPs），适用于人类队列研究。⁴该方法通量相对较高，可对数百至数千个DNA样本进行基因分型，适用于新发现研究及特定通路的探究。本文所述方法可用于相对快速且经济地鉴定风险等位基因及其与临床特征的关联。该平台在筛查和诊断应用中具有显著优势。^5,6，以及最近用于微生物感染的研究⁷ 和人乳头瘤病毒⁸.

本方案从选择一组待研究的基因开始， 即，目标区域通常通过文献检索确定，或 先验的 参与疾病过程的假设；或作为全基因组关联研究（GWA）中发现的显著关联位点而被选中进行重复验证。从基因集合中，研究人员将筛选出一组精炼的标签SNP（tag SNP）。即，利用该区域内的变异位点之间的连锁不平衡（LD）或相关性，识别出能够代表一组高度连锁不平衡SNP的代表性“标签SNP”，这一组SNP称为单倍型（haplotype）。由于该区域具有高度连锁不平衡，这些SNP通常一起遗传，因此对其中一个SNP进行基因分型即可代表该单倍型中所有SNP的变异情况。或者，在对来自多个区域的明确SNP列表进行后续研究时 例如对于全基因组关联研究（GWA研究）的重复验证，此步骤可能并非必要。对于多重基因分型，需围绕这些靶点设计检测方法，使扩增引物的质量与延伸引物及其产物的质量不同，从而产生可解读的质谱图。这些参数可通过多重基因分型检测设计工具轻松实现。该设计中的正向和反向引物将用于靶向目标标记并扩增包含SNP的序列。延伸引物直接结合在SNP位点附近，加入一个与SNP互补的单个质量修饰的“终止”碱基。该终止碱基可阻止DNA链的进一步延伸。碱基的质量修饰使得仅相差一个碱基的片段可通过质谱技术加以区分。随后将含有基因分型反应体系的微孔板加载至芯片上，用于质谱平台检测。在对系统检测到的原始基因分型结果实施适当的质量控制后，数据可被导出并用于统计分析，以检验其与疾病表型的关联性。

方案

本文所使用的遗传材料已获得儿童事务办公室人类研究伦理委员会（Office for Children HREC）（CDF/07/492）、人类服务部人类研究伦理委员会（10/07）以及皇家儿童医院（RCH）人类研究伦理委员会（27047）的伦理批准。

1. 设计多重检测实验

1. 准备用于引物设计的 SNP 列表。
   1. 将目标区域输入 Haploview 的 tagger 功能（https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads）。利用跨越目标区域的 SNP 之间的连锁不平衡（LD，相关性 r²）生成一个 SNP 列表，以最少数量的变异实现对目标区域的完全覆盖。生成的 SNP 列表应确保所有待捕获的等位基因之间的相关性高于用户设定的阈值（例如，r² ≥0.8）。
2. 确定正向、反向和延伸引物的合适序列
   1. 将步骤 1.1.1 生成的 SNP 列表输入所选的引物设计工具。
      注意：以下说明适用于用于生成代表性结果的引物设计工具，具体如材料表中所述。
   2. 启动引物设计工具后，选择新建基因分型设计。在设计名称字段中输入该引物设计的名称。
   3. 通过点击标有编辑文本输入的按钮（按钮左侧有rs 或 FASTA的提示）提供步骤 1.1.1 中生成的 SNP 列表。
      注意：SNP 可以以参考（rs）SNP ID 的文本列表形式输入，或以 FASTA 格式上传，或使用该工具专用的 SNP Group 文件格式上传。如需以这些格式上传文件，请选择文件上传按钮。单个检测（称为“孔”）中可设计的变异位点上限为 40 个 SNP。可在运行开始前指定某些 SNP 为优先设计位点，这些位点将优先被设计。也可指定对照 SNP，例如用于检测样本混淆的性别鉴定位点，或在处理低浓度或低质量 DNA 时用于判断模板是否足量的对照位点。但需注意，使用对照和优先 SNP 可能会减少单孔中可成功设计的 SNP 数量。
   4. 在预设菜单中选择高通量 iPLEX 预设选项。在生物体菜单中选择待测 DNA 所属的物种。本研究中代表性结果所用物种为人类。
      注意：小鼠和牛的基因组也兼容该工具。若研究其他生物（如植物或微生物），可选择其他选项；但由于缺乏参考基因组，将无法使用自动查找邻近 SNP 和最优引物区域的功能。
   5. 在数据库菜单中选择最新版本的基因组构建，或根据需要选择其他版本。在化学体系菜单中选择iPLEX，并在多重水平字段中输入最高多重数：40。然后选择开始运行，“步骤 1”将开始执行。
      注意：在步骤 1 中，工具将检索并格式化 SNP 序列。可能出现的错误包括 FASTA 文件格式问题，此时应检查并重新格式化 FASTA 文件；另一种错误是某些 rs 编号已被合并至其他 rs 编号中，此时应在 SNP 数据库（如 NCBI 的 dbSNP）中查询该 rs 编号以确定新的编号。工具还会在 SNP 周围搜索已知的邻近 SNP，以避免其干扰引物设计。潜在的 PCR 引物位点将与整个基因组比对，以避免因在基因组中存在多个匹配位点而导致非特异性扩增。
   6. 等待设计工具完成“步骤 2”，该步骤将识别邻近 SNP。
      注意：若所用生物体不支持此步骤，且已有相关信息，可在输入序列中使用 IUPAC 编码标注邻近 SNP。此步骤通常很少出错，但若选择了错误的参考生物体或基因组版本，或误将 cDNA 序列而非基因组 DNA 输入，则可能发生错误。为优化步骤 2，在高级设置中可根据特定人群过滤 SNP。也可通过排除频率低于 1% 的稀有 SNP 进行过滤。此外，可根据需要排除未验证状态或缺乏人群频率信息的 SNP。
   7. 等待设计工具完成“步骤 3”，该步骤将识别最优引物区域。若已预先确定了优选引物位置，或正在处理非标准生物体，可通过在输入序列（SNP 组文件）中将优选引物区域用大写字母标注、其余序列用小写字母标注，并在本步骤的高级设置菜单中选择保留大小写，手动输入引物位置。
      注意：步骤 2 和步骤 3 可能出现的错误包括：（1）邻近 SNP 阻碍引物设计，解决方法包括使用非模板碱基进行屏蔽，并订购含通用碱基（如次黄嘌呤）的寡核苷酸；或设计两条引物，每条对应邻近 SNP 的一个等位基因；或仅设计一条对应常见等位基因的引物。（2）另一个常见问题是无法找到唯一的引物结合位点，解决方法是调整扩增子长度以寻找唯一结合位点。本研究所用工具的默认扩增子长度为 80–120 bp，可在“3. 识别最优引物区域”中的高级设置对话框内将长度范围调整为 60–400 bp，同时在“4. 设计检测”中的扩增子标签页下也需进行相同修改。请确保两处均被更改。但需注意，在使用降解 DNA 时，不建议增加扩增子长度。
   8. 等待完成引物设计步骤（即设计工具的“步骤 4”），该步骤旨在优化多重设计中延伸引物与各 SNP 等位基因之间的质谱峰分离效果。此步骤完成后，导出寡核苷酸订购文件，该文件已格式化，便于通过任意寡核苷酸供应商直接订购。
      注意：扩增引物（正向（F）和反向（R））设计的目标扩增子大小为 80 至 120 bp。扩增引物的质量必须与延伸引物及其产物的质量不同，以避免质谱结果干扰并确保整体 PCR 性能。延伸引物长度应为 15 至 30 个核苷酸（4,500–9,000 Da），设计时应使其 3’ 端紧邻多态性位点。上述所有参数在用于生成代表性结果的工具中均已自动设定。
3. 从所选工具中导出设计结果，并向寡核苷酸供应商订购引物：每种 PCR 引物（正向和反向）各 25 nmol，每种延伸引物各 100 nmol。代表性结果所用引物见表 1。

2. 基因分型（1 - 2 天）

1. 制备扩增引物。
   1. 若订购的是冻干引物，需用分子级水重悬。正向和反向引物的浓度为100 μM/μL，延伸引物的浓度为500 μM/μL。
   2. 向前汇集 & 将每个多重检测的反向引物加入到一个储存引物混合液中，使每种引物的浓度均为 0.5 mM。
      注意：例如，用于 400 次反应的 400 μL 引物混合液：
      
      每种引物各需2 μL，浓度为100 μM/μL，用于配制引物储备液。对于一个包含60条正向和反向引物的30重检测体系，共需120 μL引物（即浓缩引物储备液）。随后加入280 μL分子生物学级水，最终得到400 μL的引物混合液。
2. 使用聚合酶链式反应（PCR）进行扩增
   1. 配制PCR主混合液，包含上述引物混合物100 nM、dNTPs 500 μM、MgCl₂ 2 mM₂，以及0.5 U的DNA聚合酶。对于大于26重的检测，需要1 U。请参考 表2.
   2. 向384孔PCR板的每孔中加入4 μL该混合液，以及1 μL浓度为5 - 10 ng/μL的基因组DNA。
      注意：反应板上还应包含质控样本，例如无模板对照和在先前测试运行中表现良好的阳性对照。如果同时运行多块反应板，则应包含来自其他板的多个DNA样本。 例如应设置三个技术重复，以检测板间差异性。
   3. 将酶标板在室温下以200 × g离心1分钟，离心时使用板盖，以确保所有液体均位于板孔底部。
   4. 使用以下热循环仪条件进行PCR：94 °C孵育4分钟以激活DNA聚合酶；进行45个循环（94 °C变性20秒，56 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟），随后在72 °C进行最终延伸3分钟。参见PCR程序 表3.
   5. 进行琼脂糖凝胶电泳以确认DNA扩增是否成功。取1 µL PCR产物（加入3 µL上样缓冲液），在2%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳，凝胶由琼脂糖粉末与0.5% Tris硼酸EDTA（TBE）缓冲液配制而成，于100 V电压下电泳45分钟。
3. 虾碱性磷酸酶（SAP）纯化步骤
   注意：此步骤用于去除未掺入的核苷酸。SAP 酶切割磷酸基团，以防止过量引物和未掺入的 dNTPs 干扰后续的延伸反应。
   1. 配制主混合液，其中包含 1.7 单位/μL 虾碱性磷酸酶（SAP），10 倍浓度 SAP 缓冲液，并用分子生物学级水定容至所需体积。参考 表4.
   2. 向已含有5 μL PCR反应产物的各孔中加入2 μL freshly made up SAP master mix。短暂离心后，放入热循环仪中，37 °C孵育40分钟，随后85 °C孵育5分钟以灭活酶。参考 表5.
4. 引物延伸反应
   注意：延伸引物混合物中各延伸引物的浓度必须根据其长度进行调整（线性引物调整，LPA）。这是因为质谱图中的峰强度与产物质量呈反比关系。通过调整延伸引物的浓度，可校正这种关系，从而获得强度相近的峰。用于生成代表性结果的经调整引物见下文 表6 & 7提供的体积用于制备1.5 mL的延伸引物混合液。
   1. 使用 Agena Biosciences 提供的梯度算法（“线性引物调整”）计算每对引物的稀释因子，该算法可根据引物的质量、浓度以及多重反应中引物的总数进行调整（参见 表6 & 7）。将每个引物的 UEP 质量输入至“线性引物校正”工作表的 UEP_MASS 字段中。
      注意：引物的按质量调整后的浓度将自动在标题为“目标反应浓度 (µM)”的单元格中计算。需加入引物混合液的引物体积将输出至标题为“需加入混合液的引物原液体积 (µL)”的单元格中。为达到计算所得浓度，需加入引物混合液的去离子水体积将输出至标注“PCR级无RN酶水添加体积”的文本旁的单元格中。₂O 待加入引物混合液（µL）。
   2. 根据线性引物调整文件中指定的每种引物体积配制引物混合液。按照算法计算出的水量，加入步骤2.4.1中确定的引物混合液进行稀释。
      注意：如果无法使用梯度算法方法，另一种方法是将引物分为低分子量和高分子量两组，并使高分子量引物的浓度为低分子量组的两倍。对于高重数检测（即超过19个SNP），可能需要分为三到四组。然而，该方法所获得的基因分型检出率不如梯度算法方法理想。
   3. 配制延伸反应主混合液。对于低重检测（1 - 18 重），加入 0.2 μL 缓冲液、0.1 μL 终止反应混合液、0.94 μL LPA 调整后的引物混合液以及 0.0205 μL 酶（在冰上配制）。对于高重检测（19 - 36 重），终止反应混合液和酶的用量加倍（终止反应混合液 0.2 μL，iPLEX 酶 0.041 μL）。参考 表8.
   4. 向上一步反应的孔板中加入 2 μL 延伸反应预混液，使每孔总体积达到 9 μL。短暂离心后放入热循环仪：94 °C 预变性 30 s，40 个循环（94 °C 5 s，随后进行 5 次循环：52 °C 5 s 和 80 °C 5 s），最后 72 °C 延伸 3 min。参考 表9.
5. 树脂纯化
   注意：现在可使用树脂去除反应中过量的盐。
   1. 向回收的孔板各孔中加入16 μL去离子水，使孔板中的总体积达到25 μL。
   2. 将树脂（通常为6 mg的凹孔树脂板，需单独购买）均匀涂布于整个板面。室温下静置20分钟，使树脂在凹孔树脂板中干燥，然后再将其加入反应板。加入树脂后，在室温下轻轻旋转反应板5分钟，可手动操作或使用悬浮混合器以低速进行混合。例如7.5 转/分钟
      注意：在将基因分型分析物上样至基因分型芯片之前，必须将样本信息和检测布局输入软件界面。此步骤可通过使用检测设计工具生成的Design Summary文件完成。
6. 质谱平台上的测量.
   1. 将微孔板在3,200 × g离心5分钟，以避免树脂污染质谱芯片。
   2. 在运行前将样品的板布局上传至系统的软件界面。
      注意：步骤 2.6.3 仅可由经过培训的人员操作。
   3. 将来自孔板的基因分型分析物混合液通过分配系统点样至基因分型芯片上。随后，将芯片装载至MALDI-TOF系统，以产生分析物混合液的质谱图，随后可通过该平台的软件界面进行结果解读。
      注意：该系统通过向质谱芯片上的每个“垫片”（对应基因分型板的单个孔）发射短脉冲紫外光来生成质谱。此脉冲导致分析物发生脱附和离子化。随后，这些离子化的DNA分子在高压静电场作用下被推向真空管顶部，较轻的离子移动速度较快，首先到达检测器，而较重的离子移动较慢，从而实现分离。系统记录这些分析物的“飞行时间”，据此可确定每个DNA片段的质量，进而推断出SNP位点存在的核苷酸碱基。

3. 基因分型数据

注意：质量控制和数据分析不是本方法学论文的重点。然而，以下将简要介绍质谱图的解读。

1. 质谱的手动检查与质量控制
   注意：原始质谱数据由系统生成，并使用下述软件进行分析 材料表采用高斯混合聚类方法对该输出进行处理，以实现概率性基因分型判定。
   1. 打开分析软件。选择 泰珀分析仪. 从 文件 菜单，选择 从文件打开孔板 并选择在步骤 2.6.3 中生成的包含光谱数据的 xml 文件。运行所用芯片的名称应可见，选择该名称后，将显示一个 384 孔板的“交通信号灯”面板，并列出所选孔中的 SNP 列表。在此基础上，选择 簇状图 查看每个SNP的数据点散点图。
      注意：对于信号强度较低的SNP，建议将其结果设为“无检出”。在用于代表性结果的软件中，建议采用高于默认值的聚类强度阈值5，以实现更严格的质量控制。该设置可在 幅值截断阈值字段 在……下方 参数 在 后处理聚类 窗格。选择 自动聚类 从 工具 按 Tab 键以运行聚类分析。
   2. 通过检查“后处理”面板中的笛卡尔图，手动检验基因型分型结果。在“检测”面板中，选择目标SNP并点击 后处理聚类 标签页中将显示一个基因型聚类的簇状图，图中包含样本编号及该SNP对应的基因型。
   3. 检查基因型检出簇，评估每个单独的检出结果与该SNP其他检出结果的聚类情况。软件会在图中为每种基因型提供一些边界线作为参考；参见来自一个基因型检出簇图的示例 IL13 SNP（单核苷酸多态性）图1）。如果该信号未与其他信号紧密聚集，明显位于某一簇之外，或信号强度极低，可右键单击该数据点，然后选择 更改呼叫 手动将其设置为 无 呼叫.
   4. 为确保下游分析使用高质量的基因分型数据，应排除基因分型调用率低于质控阈值的SNP位点和个体， 例如 90%。在对呼叫数据进行适当调整后，将数据导出用于统计分析。用于生成代表性结果的软件（见文末所列） 材料表通过以下方式实现： 平板数据 从“视图”菜单中选择并选取 另存为.

结果

根据上述方案，我们在一组食物过敏病例和对照人群中对Th2免疫基因IL13区域的标签SNP进行了基因分型⁹。我们采用逻辑回归分析，并对祖先背景及其他潜在协变量进行校正，以检验目标区域内的遗传变异是否增加食物过敏风险。表10⁹显示，其中一个变异位点rs1295686与激发试验确诊的食物过敏相关，我们使用相同的多重基因分型方法在重复队列中验证了这一关联。对两个队列结果进行的荟萃分析为IL13与食物过敏（FA）之间的关联提供了强有力的证据（表11）⁹。在分析中，我们通过一组祖先信息性SNP标记面板对遗传祖先进行推断并加以校正，该面板改编自已发表的面板¹⁰。该面板的基因分型同样采用相同的多重检测方法完成。

讨论

本文展示了利用质谱技术进行多重基因分型的方法。代表性结果通过PCR联合MALDI-TOF质谱技术获得⁴，相关检测化学试剂列于材料表¹³中。利用该平台，我们在实验室中于40小时内对1,255名个体的9个SNP位点共完成了11,295个基因型的检测。

我们通过在一个已进行食物过敏表型分析并具有独立验证队列的临床发现队列中，生成和分析候选基因 IL13 的单核苷酸多态性（SNP）数据，来展示该技术在验证遗传学假设方面的实用性。该平台对较低质量的DNA具有相对较强的耐受性，且所需起始材料极少，仅需10 ng。实验方案中的关键步骤包括：仔细排查检测设计过程中的问题，以确保在多重检测中最大程度地包含目标SNP；在扩增PCR过程中成功扩增目标区域；在延伸反应中成功实现单核苷酸延伸；以及将检测和样本板布局正确载入分析软件，以便软件能够准确分配质谱数据。

如前所述，该检测设计工具除人类外，还可用于小...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基因组DNA	-	-	1 μ5-10 ng/μL 的浓度μL
引物：正向与反向扩增及延伸	IDT	-	参见手稿第1.2.1节关于引物设计的内容
去离子水	例如：Milli-Q 水	-	去离子，电阻率为18.2 MΩ·cmΩ.cm 电阻率
基因分型试剂盒。iPLEX Gold Chemistry 试剂组	Agena Bioscience	#10148-2	包含2.2.1、2.3.1和2.4.2中反应所需的所有试剂，芯片和树脂
PCR板（384孔）	Abgene	#ABGAB-1384	Abgene 的板适用于 MassARRAY 系统
微量移液器			单通道和8通道
离心			兼容384孔板
PCR仪			与2.2.4、2.3.2和2.4.3节中所述的PCR程序兼容
凹面树脂板	Agena Bioscience		6毫克，384孔板
平板旋转仪
MassARRAY Analyzer 4 系统	Agena Biosciences		基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF） – 飞行时间质谱仪
RS1000 纳米分配仪	Agena Biosciences
检测设计套件	Agena Biosciences		用于设计多重基因分型检测的工具
热启动Taq			DNA聚合酶
树脂	Agena Biosciences		随 iPLEX 试剂盒提供