鉴定参与复杂人类疾病的遗传变异有助于我们发现新的作用机制。本文展示了一种多重基因分型方法，可用于候选基因或基因通路分析，在低成本条件下实现高覆盖度，并适用于基于队列的研究。
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摘要
摘要
复杂疾病通常由多个常见的遗传变异共同导致，这些变异影响个体对疾病的易感性。本文介绍一种经济高效的标签单核苷酸多态性（tag SNP）分析方法，通过基于质谱的多重基因分型检测技术，在临床队列中研究基因通路与疾病的关联。我们以食物过敏候选位点Interleukin13（IL13）为例进行说明。该方法利用基因组区域内的连锁不平衡（LD）共享特征，有效提高位点覆盖效率。选择出的LD相关SNP被设计为多重检测体系，可同时分析多达40个不同的SNP，显著提升成本效益。采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标位点，随后进行单碱基延伸反应，扩增产物通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术进行检测。原始数据使用基因型判读软件进行分析，依据严格的质控标准和阈值设定，确定高置信度的基因型结果，并输出用于后续数据分析。
引言
在人类复杂疾病中，遗传变异会影响疾病易感性，量化这些变异有助于理解发病机制、识别高风险患者群体以及对治疗产生应答的患者。事实上，精准医学的实现依赖于利用基因组信息来识别患者亚群1不幸的是，在复杂的疾病生物学领域，疾病表型往往由显著的遗传异质性、低外显率和可变的表达度所决定，因此通过全基因组方法鉴定新候选基因所需的队列规模通常大到难以实现2或者，一种有针对性的候选基因方法从一个特定的候选基因开始 先验的 关于特定基因/通路在疾病病因学中的假设3通路分析工具常用于研究已鉴定靶点位点的病理生理机制，可生成大量待验证的候选通路。本文展示了一种多重基因分型方法，可在单次检测中同时分析数十至数百个单核苷酸多态性位点（SNPs），适用于人类队列研究。4该方法通量相对较高，可对数百至数千个DNA样本进行基因分型，适用于新发现研究及特定通路的探究。本文所述方法可用于相对快速且经济地鉴定风险等位基因及其与临床特征的关联。该平台在筛查和诊断应用中具有显著优势。5,6，以及最近用于微生物感染的研究7 和人乳头瘤病毒8.
本方案从选择一组待研究的基因开始， 即，目标区域通常通过文献检索确定，或 先验的 参与疾病过程的假设；或作为全基因组关联研究（GWA）中发现的显著关联位点而被选中进行重复验证。从基因集合中，研究人员将筛选出一组精炼的标签SNP（tag SNP）。即，利用该区域内的变异位点之间的连锁不平衡（LD）或相关性，识别出能够代表一组高度连锁不平衡SNP的代表性“标签SNP”，这一组SNP称为单倍型（haplotype）。由于该区域具有高度连锁不平衡，这些SNP通常一起遗传，因此对其中一个SNP进行基因分型即可代表该单倍型中所有SNP的变异情况。或者，在对来自多个区域的明确SNP列表进行后续研究时 例如对于全基因组关联研究（GWA研究）的重复验证，此步骤可能并非必要。对于多重基因分型，需围绕这些靶点设计检测方法，使扩增引物的质量与延伸引物及其产物的质量不同，从而产生可解读的质谱图。这些参数可通过多重基因分型检测设计工具轻松实现。该设计中的正向和反向引物将用于靶向目标标记并扩增包含SNP的序列。延伸引物直接结合在SNP位点附近，加入一个与SNP互补的单个质量修饰的“终止”碱基。该终止碱基可阻止DNA链的进一步延伸。碱基的质量修饰使得仅相差一个碱基的片段可通过质谱技术加以区分。随后将含有基因分型反应体系的微孔板加载至芯片上，用于质谱平台检测。在对系统检测到的原始基因分型结果实施适当的质量控制后，数据可被导出并用于统计分析，以检验其与疾病表型的关联性。
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方案
本研究使用的遗传材料已获得儿童办公室人类研究伦理委员会（CDF/07/492）、人类服务部人类研究伦理委员会（10/07）以及皇家儿童医院人类研究伦理委员会（27047）的伦理批准。
1. 设计多重检测实验
- 为引物设计准备 SNP 列表。
- 将目标区域输入 Haploview 的标签功能（https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads）。使用 LD（相关性，r2) 以生成一个SNP列表，该列表以最少数量的变异位点实现对目标区域的完全覆盖。生成的SNP列表应确保所有待捕获的等位基因之间的相关性高于用户设定的阈值（例如，r2 ≥0.8).
- 正向、反向及延伸引物的合适序列鉴定
- 将生成的SNP列表输入所选的检测设计工具中。
注意：以下说明适用于生成代表性结果所用的检测设计工具，具体如文中所述 材料表. - 启动检测设计工具后，选择 新型基因分型设计. 在测定设计名称栏中输入该实验设计的名称 设计名称 领域
- 单击标有“提供在步骤1.1.1中生成的SNP列表”的按钮 编辑文本输入 按照说明 rs 或 FASTA 按钮左侧
注意：SNPs 可以以参考（rs）SNP ID 的文本列表形式输入，或以 FASTA 格式或该工具所使用的 SNP 分组文件格式上传。如需以这些格式上传文件，请选择 文件上传 按钮。单次检测（称为“孔”）中可设计的变异体上限 是40个SNP。在开始运行前，可以指定优先设计的SNP位点；这些位点将被优先设计。可以指定对照SNP，例如用于检测样本混淆情况下的性别鉴定，或在处理低浓度或低质量DNA时，用于确认已加入足量模板的对照。但需注意，使用对照SNP和优先SNP可能会减少单个孔中可成功设计的SNP数量。 - 从 预设 菜单，选择 高通量多重 iPLEX 预设 选项。从 生物体 在菜单中选择待基因分型 DNA 的来源生物。对于本文展示的代表性结果，该生物为 Human。
注意：该工具同样适用于小鼠和牛的样本。用户还可选择 其他 若使用植物或微生物等其他生物体，则由于缺乏参考基因组，查找邻近SNP位点和最佳引物区域的自动化步骤将不可用。 - 在 数据库 菜单中，根据需要选择基因组的最新版本或其它替代版本 化学 菜单。选择 iPLEX 以及用于 多重水平 场，输入最高多重检测水平：40。现在，选择 开始运行工具的“步骤1”将开始。
注意：在步骤1中，工具会检索并格式化SNP序列。可能出现的错误包括FASTA文件的格式问题，此时应检查FASTA文件并根据需要重新格式化。另一种错误是SNP的rs编号已被合并至另一个rs编号，此时应在SNP数据库（如NCBI的dbSNP）中查询该rs编号，以确定新的rs编号。此外，需在SNP周围序列中搜索任何已知的邻近SNP，以避免其对引物设计造成干扰。潜在的PCR引物位点将与基因组进行比对，以防止因在基因组中存在多个匹配位点而导致非特异性扩增。 - 等待设计工具中“步骤2”的完成，以鉴定近端SNP。
注意：如果使用的生物体不被此步骤支持，则在IUPAC注释中使用邻近的SNP对序列进行注释（若该信息可用）。此步骤中极少出现错误；然而，若选择了错误的参考生物体或基因组，或输入了cDNA序列而非基因组DNA序列，则可能出现错误。为优化步骤2，在 高级设置， 可根据特定人群对SNPs进行筛选。也可通过排除频率低于1%的位点来滤除罕见SNPs。此外，若需要，还可排除未验证状态或缺乏人群信息的SNPs。 - 等待设计工具完成“步骤3”，该步骤将识别最佳引物区域。如果已确定优先的引物位置，或正在处理其他生物体，可通过在输入序列（SNP组文件）上以大写字母标注首选引物区域、其余序列以小写字母标注的方式手动输入引物位置，然后选择 保留大小写 从该步骤的高级设置菜单中。
注意：步骤2的错误 & 3 可能包括：（1）上游 SNP 阻碍引物设计，解决方法包括使用非模板碱基进行屏蔽，并订购含有通用碱基（如次黄嘌呤）的寡核苷酸，或设计两条引物，每条引物分别包含上游 SNP 的一种等位基因，或仅设计一条包含常见等位基因的引物。（2）另一个常见错误是未能识别引物的唯一性位点，解决方法是调整扩增子长度以找到唯一性位点。在本文所用工具中，默认扩增子长度为 80 - 120 bp。该参数可在“3. 确定最佳引物区域”中的“扩增子长度”设置下的高级设置对话框中，调整为 60 - 400 bp。 扩增子 “4. 设计检测方法”标签 确保两者均被更改。但需要注意的是，使用降解DNA时，不建议增加扩增子长度。 - 等待完成引物设计步骤（设计工具中的“步骤4”），在此步骤中，该工具旨在为多重设计中所有SNP位点的延伸引物与等位基因之间提供最佳的扩增产物分离效果。此步骤完成后，导出Oligo Order文件，该文件已格式化，便于通过用户选择的寡核苷酸订购供应商进行订购。
注意：扩增引物（正向（F）和反向（R））的设计应产生80至120 bp的最佳扩增子大小。扩增引物的质量必须与延伸引物及其产物的质量不同，以避免质谱结果中出现干扰信号，并确保整体PCR性能。延伸引物长度应为15至30个核苷酸（4,500 - 9,000 Da），设计时应使3’端紧邻多态性位点的相邻位置。在生成代表性结果所用的工具中，上述所有参数均已自动设定。
- 将生成的SNP列表输入所选的检测设计工具中。
- 从所选工具中导出设计，并向寡核苷酸供应商订购引物：每种PCR引物（正向和反向）各25 nmol，每种延伸引物各100 nmol。参见 表1 用于生成代表性结果的引物。
2. 基因分型（1 - 2 天）
- 制备扩增引物。
- 若订购的引物为冻干形式，请使用分子级水进行复溶。使用浓度为 100 μM/μL 用于正向与反向引物 500 μM/μL 用于延伸。
- 池化正向 &；将每个多重检测的反向引物加入引物储备混合液中，使每种引物的终浓度达到 0.5 mM。
注：例如， 400 μL 400 次反应用引物池：
2 μL 每种引物，浓度为 100 μM/μL，制备储备引物池需要。对于包含60条正向和反向引物的30重检测，总共需要 120 μL 所需引物量（即浓缩引物池）。 280 μL 随后加入分子级纯水，使最终体积达到 400 μL 引物混合物。
- 聚合酶链式反应扩增
- 制备 PCR 预混液，其中包含 100 nM 上述引物混合物， 500 μM dNTPs 浓度为 2 mM，MgCl 浓度为 2 mM2以及 0.5 U 的 DNA 聚合酶。对于大于 26-重检测，需要 1 U。请参考 表 2.
- 添加 4 μL 将 5 µL 该混合物加入 384 孔 PCR 板的每个孔中，同时 1 μL 基因组 DNA 浓度为 5 - 10 ng/μL.
注意：平板上还应设置质量控制，例如无模板对照，以及先前在该检测（试运行期间）中表现良好的阳性对照。若运行多块平板，则需包含来自其他平板的多个 DNA 样本， 例如每组实验应设置三个技术重复，以控制板间变异。 - 将带有盖板的微孔板在室温下以 200 x g 离心 1 分钟，以确保所有液体均聚集于微孔板孔底部。
- 使用以下热循环条件运行PCR：先在94°C下孵育4分钟， 94 °C 激活DNA聚合酶；随后进行45个循环，每个循环包含以下步骤：在 94 °C 20 秒，退火于 56 °C 持续 30 秒，并于 72 °C 持续1分钟），最后在 72 °C 3 分钟。请参阅 PCR 程序中的 表 3.
- 进行琼脂糖凝胶电泳，以确保 DNA 扩增成功。使用 1 µL PCR产物（含 3 µL 将样品（含 6 μL 上样缓冲液）置于 2%（w/v）琼脂糖凝胶上，该凝胶由琼脂糖粉末与 0.5% Tris Borate EDTA（TBE）缓冲液混合制成，并在 100 V 电压下电泳 45 分钟。
- 虾碱性磷酸酶（SAP）纯化步骤
注意：此步骤用于去除未掺入的核苷酸。SAP 酶可裂解磷酸基团，以防止过量引物和未掺入的 dNTP 干扰后续的延伸反应。- 制备预混液，其中包含 1.7 单位/μL 虾碱性磷酸酶（SAP）酶，10x SAP缓冲液，并用分子级水补足体积。参见 表 4.
- 添加 2 μL 向每个孔中加入 20 µL 新配制的 SAP 预混液，孔中已含有 5 μL 来自 PCR 反应。短暂离心，然后放回热循环仪中，温度设定为 37 °C 40 分钟，随后在 85 °C 5 分钟以灭活酶。参见 表 5.
- 引物延伸反应
注：延伸引物混合物中延伸引物的浓度必须根据片段大小进行调整（线性引物调整——LPA）。这是因为质谱图中的峰强度与产物质量之间存在反比关系。调整延伸引物浓度可校正此关系，从而产生强度相等的峰。用于生成代表性结果的调整后引物浓度如下： 表 6 & 7所提供的体积用于配制 1.5 mL 延伸引物混合物。- 使用梯度算法计算各引物的稀释系数，该算法由 Agena Biosciences 提供（“线性引物调整”），可根据引物的质量与浓度以及多重反应中的引物总数进行调整（参见 表 6 & 7). 将每个引物的 UEP 质量输入线性引物调整工作表的 UEP_MASS 字段。
注：引物的质量调整浓度将在标题为“目标反应浓度 (µM).” 待添加至引物池的引物体积将输出在标题文本“待添加至池的引物储备液体积 (μL)”下方的单元格中。µL).” 为达到计算浓度所需加入引物池的 PCR 级无 RNase 水体积，将输出至“PCR 级无 RNase 水体积”文本旁的单元格。2待添加引物池µL).” - 按照线性引物调整文件中指定的每种引物体积，配制引物池。加入步骤2.4.1中算法计算得出的水量，以稀释引物池。
注：若无法使用梯度算法，另一种方法是将引物分为低质量数组和高质量数组，并使高质量数组引物的浓度相对于低质量组加倍。对于高多重性检测（即超过19个SNP），可能需要三到四组引物。但此方法无法获得与梯度算法同样优化的检出率。 - 组装延伸预混液。对于低重数检测（1-18重），加入 0.2 μL 缓冲液， 0.1 μL 终止混合液， 0.94 μL LPA 调整后引物混合物的， 0.0205 μL 酶（于冰上制备）。对于高重检测（19-36重），加入双倍浓度的终止混合液和酶（终止混合液 0.2 μL 与 iPLEX 酶 0.041 μL）。请参阅 表 8.
- 添加 2 μL 将延伸反应预混液加入前一步反应后的孔板中，此时总体积达到 9 μL 每孔。短暂离心后置于热循环仪中： 94 °C 初始孵育30秒，随后进行40个循环的1×扩增。 94 °C 持续 5 秒，共 5 次。52 °C 持续 5 秒，随后 80 °C 持续 5 秒），然后 72 °C 3 分钟。请参阅 表 9.
- 使用梯度算法计算各引物的稀释系数，该算法由 Agena Biosciences 提供（“线性引物调整”），可根据引物的质量与浓度以及多重反应中的引物总数进行调整（参见 表 6 & 7). 将每个引物的 UEP 质量输入线性引物调整工作表的 UEP_MASS 字段。
- 树脂纯化。
注意：现在可以使用树脂从反应中去除多余的盐。- 添加 16 μL 向回收的微孔板各孔中加入 200 µL 去离子水，使板内液体总体积达到 25 μL.
- 将树脂（通常为6毫克凹槽树脂板，需单独购买）均匀涂抹于整块板面。在室温下将树脂置于凹槽板中干燥20分钟，随后转移至反应板。添加树脂后，在室温下通过手动或使用低速悬浮混合器旋转反应板5分钟。例如转速为 7.5 转/分钟。
注意：在将基因分型分析物加载到基因分型芯片之前，必须将样本和检测布局输入软件界面。这可通过使用检测设计工具生成的"设计摘要"文件来实现。
- 在质谱平台上进行测量.
- 将平板以 3,200 x g 离心 5 分钟，以避免将树脂施加到质谱芯片上。
- 在运行前，将样本的板布局上传至系统软件界面。
注意：步骤 2.6.3 仅应由经过培训的人员执行。 - 使用点样系统将基因分型分析物混合物从微孔板转移至基因分型芯片。随后，将芯片装载至 MALDI-TOF 系统，以从分析物混合物中生成质谱图，随后可借助平台的软件界面进行解读。
注：该系统通过向每个“样品垫”发射短脉冲紫外光来生成质谱图。 对应基因分型板上单个孔位的质谱芯片区域。该脉冲导致分析物发生解吸和电离。随后，这些电离的DNA分子在高压静电场作用下被加速推向真空管顶部，较轻的离子运动更快、首先到达检测器，从而与较重的离子分离。系统记录这些分析物的“飞行时间”，据此可确定每个DNA片段的质量，从而推断出单核苷酸多态性（SNP）位点存在的核苷酸碱基。
3. 基因分型数据
注意：质量控制和数据分析解释并非本方法论文的重点。然而，以下将简要介绍质谱图的解析。
- 质谱的手动检查与质量控制
注意：原始质谱数据由系统生成，并使用下文所列软件进行分析。 材料清单采用高斯混合聚类方法对该输出进行处理，以实现概率性基因分型判定。- 打开分析软件。选择 泰珀分析仪. 从 文件 菜单，选择 从文件打开孔板 并选择在步骤 2.6.3 中生成的包含质谱数据的 xml 文件。运行所用芯片的名称应可见，选择该名称后，将显示一个 384 孔板的“交通灯”面板，并列出所选孔中的 SNP 列表。在此处选择 簇状图 查看每个SNP的数据点散点图。
注意：对于信号强度较低的 SNP，建议采用“无检出”结果。在代表性结果所用软件中，建议将聚类强度阈值设为 5，高于默认值，以实现更严格的质量控制。该设置可在 幅值截断阈值字段 下 参数 在 后处理聚类 窗格。选择 自动聚类 来自 工具 按 Tab 键以运行聚类分析。 - 通过在“后处理”面板中检查笛卡尔图，对基因型分型结果进行人工核查。在“检测”面板中，选择目标SNP并单击 数据后处理聚类 标签，将显示一个基因型聚类的簇状图，图中包含样本编号及该SNP对应的基因型。
- 检查基因型检出聚类情况，评估每个单核苷酸多态性（SNP）位点的检出结果与其他检出结果的聚类效果。软件会在图中为每种基因型提供若干参考边界线，以辅助判读；参见下方来自某项研究的基因型检出聚类图示例。 IL13 单核苷酸多态性（SNP）图1）。如果该信号未与其他信号紧密聚集，明显位于某一簇之外，或信号强度极低，可右键单击该数据点，然后选择 更换细胞 手动设置为 无 呼叫.
- 为确保用于下游分析的基因分型数据具有高质量，应剔除检测率低于质控阈值的SNP位点和个体， 例如 90%。在对呼叫数据进行适当调整后，将数据导出用于统计分析。用于生成代表性结果的软件（列于下文） 材料列表通过以下方式实现 平板数据 从“视图”菜单中选择并选取 另存为.
- 打开分析软件。选择 泰珀分析仪. 从 文件 菜单，选择 从文件打开孔板 并选择在步骤 2.6.3 中生成的包含质谱数据的 xml 文件。运行所用芯片的名称应可见，选择该名称后，将显示一个 384 孔板的“交通灯”面板，并列出所选孔中的 SNP 列表。在此处选择 簇状图 查看每个SNP的数据点散点图。
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结果
根据上述方案，我们对一批食物过敏病例和对照样本中 Th2 免疫基因 IL13 区域的标签 SNP 进行了基因分型9。我们采用逻辑回归分析，并对祖先背景及其他潜在协变量进行校正，检验目标区域内的遗传变异是否增加食物过敏风险。表 109 显示，其中一个变异位点 rs1295686 与激发试验确诊的食物过敏相关，我们使用相同的多重基因分型方法在重复队列中验证了这一关联。对两个队列结果进行的荟萃分析为 IL13 与食物过敏之间的关联提供了强有力的证据（表 11）9。在分析中，我们通过一组祖先信息性 SNP 标记面板对祖先背景进行遗传推断并加以校正，该面板改编自已发表的面板10。该面板的基因分型同样采用相同的多重检测方法完成。
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讨论
本文展示了利用质谱技术进行多重基因分型的方法。代表性结果通过PCR联合MALDI-TOF质谱技术获得4，相关检测化学试剂列于材料表13中。利用该平台，我们在实验室中于40小时内对1,255名个体的9个SNP位点共完成了11,295个基因型的检测。
我们通过在一个已进行食物过敏表型分析并具有独立验证队列的临床发现队列中，生成和分析候选基因 IL13 的单核苷酸多态性（SNP）数据，来展示该技术在验证遗传学假设方面的实用性。该平台对较低质量的DNA具有相对较强的耐受性，且所需起始材料极少，仅需10 ng。实验方案中的关键步骤包括：仔细排查检测设计过程中的问题，以确保在多重检测中最大程度地包含目标SNP；在扩增PCR过程中成功扩增目标区域；在延伸反应中成功实现单核苷酸延伸；以及将检测和样本板布局正确载入分析软件，以便软件能够准确分配质谱数据。
如前所述，该检测设计工具除人类外，还可用于小...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基因组DNA | - | - | 1 μ5-10 ng/μL 的浓度μL |
| 引物：正向与反向扩增及延伸 | IDT | - | 参见手稿第1.2.1节关于引物设计的内容 |
| 去离子水 | 例如：Milli-Q 水 | - | 去离子，电阻率为18.2 MΩ·cmΩ.cm 电阻率 |
| 基因分型试剂盒。iPLEX Gold Chemistry 试剂组 | Agena Bioscience | #10148-2 | 包含2.2.1、2.3.1和2.4.2中反应所需的所有试剂，芯片和树脂 |
| PCR板（384孔） | Abgene | #ABGAB-1384 | Abgene 的板适用于 MassARRAY 系统 |
| 微量移液器 | 单通道和8通道 | ||
| 离心 | 兼容384孔板 | ||
| PCR仪 | 与2.2.4、2.3.2和2.4.3节中所述的PCR程序兼容 | ||
| 凹面树脂板 | Agena Bioscience | 6毫克，384孔板 | |
| 平板旋转仪 | |||
| MassARRAY Analyzer 4 系统 | Agena Biosciences | 基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF） – 飞行时间质谱仪 | |
| RS1000 纳米分配仪 | Agena Biosciences | ||
| 检测设计套件 | Agena Biosciences | 用于设计多重基因分型检测的工具 | |
| 热启动Taq | DNA聚合酶 | ||
| 树脂 | Agena Biosciences | 随 iPLEX 试剂盒提供 |
参考文献
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