应用多重基因分型和质谱法进行临床队列研究的候选基因检测

在人类复杂的疾病中, 遗传变异有助于疾病的易感性和量化这些变种可能有助于了解发病机制, 识别高危患者组和治疗应答者。的确, 精确医学的承诺依赖于利用基因组信息来识别患者亚群¹。不幸的是, 在复杂的疾病生物学空间中, 疾病表型的基础是大量的遗传异质性、低显性和可变表现力, 在基因组范围内识别小说的队列大小要求候选人往往是令人望而却步的大²。另外, 有针对性的候选基因方法首先是关于疾病病因学³中特定基因/通路的先验假说。通路分析工具通常用于调查确定的靶位点的病理生理学, 从而产生许多候选通路。我们在这里演示了一个多重基因分型方法, 允许调查数以万计的 snp 与一个化验, 适合人类队列研究⁴。这种方法是相对较高的通过投入, 允许成百上千的 DNA 样本被 genotyped 新的发现研究和研究的特定途径。这里概述的方法是有用的识别风险等位基因及其与临床特征的关联, 以相对快速和廉价的方式。该平台为^5、6和最近的微生物感染⁷和人乳突病毒⁸的筛查和诊断目的提供了极大的优势。

本议定书首先从选择一组基因进行调查, 即目标区域, 通常是通过文献检索确定的, 或者是对参与疾病过程的先验假说;也可能被选为复制, 作为一个发现基因组范围的协会 (GWA) 研究的主要协会。从基因组, 研究员将选择一个精致的标签 SNPs 列表。即, 在该区域的变种之间的连锁不平衡 (LD) 或相关性, 用来确定一个代表的 "标记 snp" 的一组 snp 在高 LD, 称为单体。该区域的高 LD 意味着, snp 经常被遗传在一起, 这样, 基因型一 SNP 就足以代表单体中所有 SNPs 的变异。或者, 如果对来自许多地区的 SNPs 的明确列表进行跟踪, GWA 研究的复制, 这个过程可能是不必要的。对于复用基因分型, 必须围绕这些目标设计一个化验, 以便放大引物与延伸底漆和产品的质量不同, 以产生解释质谱。这些参数很容易实现的多重基因分型分析设计工具。该设计的正反引物将被用来瞄准感兴趣的标记并放大包含 SNP 的序列。引伸引物直接附着在 SNPs 上, 并添加了一个与 snp 互补的单质量修饰的 "终结者" 基础。终止者基地防止进一步扩展脱氧核糖核酸。该基的质量修正使不同的碎片由一个单一的基地被检测到质谱。将含有基因分型化学的板块应用于一种用于质谱平台测量的芯片。在对系统检测到的原始基因分型调用应用适当的质量控制后, 可以导出数据并用于统计分析, 以测试与疾病表的相关性。

本文所用的遗传物质在伦理上被批准用于儿童办公室 HREC (人类研究伦理学委员会) (CDF/07/492)、人类服务 HREC 部 (10/07) 和皇家儿童医院 HREC (27047)。

1. 设计复用试验

1. 准备一个 SNP 列表进行化验设计。
   1. 将目标区域输入到 Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads) 的标注器函数中。使用 LD (相关性, r²) 之间的 snp 跨越目标区域, 以生成一个 snps 列表, 它提供了所需的区域的全部覆盖, 所需的变体数量最少。生成一个 SNPs 列表, 以便捕获的所有等位基因都与用户定义的阈值 (e., r² ≥0.8) 相关。
2. 前、逆、引引物的合适序列的识别
   1. 在选择的检测设计工具中输入 snp 的生成列表。
      注: 以下说明适用于用于生成具有代表性结果的化验设计工具, 如材料表中所述。
   2. 一旦检测设计工具启动, 选择新的基因型设计。在 "设计名称" 字段中输入检测设计的名称。
   3. 通过单击标记为 "编辑文本输入" 的按钮, 并通过按钮左侧的FASTA指示, 提供在步骤1.1.1 中生成的 SNP 列表。
      注意: snp 可以输入为引用 (rs) SNP id 的文本列表, 或者以 FASTA 格式上载, 或者由该工具使用的 snp 组文件格式。要以这些格式上载文件, 请选择 "文件上载" 按钮。可以设计成单一化验的变体的上限, 称为 "好的", 是 40 snp。在开始运行之前, 可以指定作为设计优先级的 snp;这些将首先设计。可以指定控制 SNPs: 例如, 在样本混合 ups 或控件的情况下检测性别的测试, 以确定在使用低质量或劣质 DNA 时添加了足够的模板。然而, 应该指出, 使用控制和优先的 snps 可以减少可设计为单个井的 snps 的数量。
   4. 从预设菜单中, 选择高复用 iPLEX 预设选项。从 "生物" 菜单中, 选择要 genotyped 的 DNA 所派生的有机体。对于这里提出的代表性结果, 这是人。
      注意: 鼠标和牛的有机体也与该工具兼容。如果与植物或微生物等替代有机体合作, 也可以选择其他生物;然而, 由于缺乏一个参考基因组, 寻找近端 SNPs 和最佳引物区域的自动步骤将不可用。
   5. 在 "数据库" 菜单中, 从 "化学" 菜单中选择 "基因组" 的最新版本, 或者在需要时进行替代生成。选择iPLEX和多路级别字段, 输入最高级别的复用:40。现在, 选择 "开始运行"。工具的 "步骤 1" 将开始。
      注意: 在步骤1中, 该工具检索和格式化 SNP 序列。在这里, 错误可能包括 FASTA 文件的格式, 在这种情况下, FASTA 文件应按需要进行检查和重新格式化。另一个错误是 snp rs 数字与另一个 rs 号合并, 在这种情况下, 应该在 snp 数据库中搜索 rs 号, 如 NCBI 的 dbSNP, 以识别新的 SNP rs 号。在 SNP 周围的序列搜索任何已知的近端 SNPs 可能干扰底漆设计。潜在的 PCR 底漆站点被比较对基因组, 以避免非特异的放大由于多次命中在基因组。
   6. 等待完成的 "步骤 2" 的设计工具, 其中近端的 SNPs 将被识别。
      注意: 如果使用此步骤不支持的有机体, 如果此信息可用, 请在 IUPAC 注释中用近的 SNPs 注释序列。在此步骤中很少出现错误。然而, 如果选择了错误的参考有机体或基因组, 或者基因序列被输入而不是基因组 DNA, 可能会出现错误。要优化步骤 2, 请在 "高级设置" 下,如果在特定人群中工作, 可以根据人口筛选出 SNPs。稀有的 SNPs 也可以通过排除那些频率低于1% 的人来筛选出来。最后, 如果需要, 不具有验证状态或没有人口信息的 snp 也可以被排除。
   7. 等待完成 "步骤 3" 的设计工具, 确定最佳底漆区域。如果选择了首选的底漆位置, 或者如果使用不同的有机体, 则通过将输入序列 (SNP 组文件) 标注为大写的首选底漆区域并在较低的序列的其余部分中手动输入底漆位置。情况下, 请从该步骤的 "高级设置" 菜单中选择 "保留案例"。
      注意: 步骤 2 & 5月3日的错误包括: (1) 一个近 SNP 阻断了底漆的设计, 解决方案是用非模板底座进行掩模, 并订购一个像 Isonine 这样的通用底座的寡核苷酸, 或者, 设计两个引物, 一个与 proxim 的每个等位基因。阿 SNP, 或者, 设计一个底漆与共同的等位基因只。(2) 另一个常见的错误是, 没有为底漆确定一个独特的站点, 解决方案是修改扩增子长度, 以确定一个独特的站点。在本文所用的工具中, 缺省值为 80-120 bp。在 "3" 中的 "扩增子长度设置" 下的 "高级设置" 对话中, 可以更改 60-400 bp。确定最佳引物区域 "和也在" 4 的扩增子标签之下。设计化验。确保两者都已更改。然而, 应该注意的是, 不建议在使用退化的 DNA 时增加扩增子的长度。
   8. 等待完成的化验设计步骤 ("步骤 4" 的设计工具), 这里的工具旨在提供最佳的通行证分离之间的推广引物和所有 SNPs 的等位基因在复用设计。完成此步骤后, 导出寡聚顺序文件, 它被格式化为通过选择的寡聚排序供应商轻松订购。
      注: 放大底漆 (前 (F) 和反向 (R)) 的设计, 以产生最佳的扩增子大小为80至 120 bp。放大底漆质量必须有别于外延底漆及其产品, 以避免在质量谱和总体 PCR 性能方面产生冲突。引伸底漆应为15至30核苷酸长 (4500-9000 Da), 设计, 使 3 ' 年底将附加直接相邻的多态性的站点。所有这些设置都将在用于生成代表结果的工具中自动设置。
3. 从所选的工具和从低聚物提供商的订购底漆导出设计:25 nmol 的 PCR 引物 (向前和反向), 和 100 nmol 的每一个引伸底漆。见表 1用于生成代表结果的引物。

2. 基因分型 (1-2 天)

1. 准备放大底漆。
   1. 如果冻干底漆被订购, 用分子级水进行重组。使用100微米/ul 的浓度为正向和反向底漆和500微米/ul 的延伸。
   2. 池向前 & 反向引物为每复用化验成一个股票底漆混合, 包含每一个底漆浓度为0.5 毫米。
      注: 例如, 400 ul 底漆池为400反应:
      
      2每个底漆的 ul, 在浓度为100微米/ul, 是需要的股票底漆池。对于具有60正向和反向底漆的30丛试验, 需要总共120个引物 ul (浓缩底漆池)。280 ul 分子级水将被添加到最后的体积 400 ul 的底漆混合。
2. 聚合酶链反应扩增 (PCR)
   1. 做一个主混合 PCR 包含100毫微米的底漆混合以上, 500 微米的 dNTPs, 2 毫米的氯化镁₂, 和 0.5 U 的 DNA 聚合酶。1 U 是需要大于26丛的化验。请参阅表 2。
   2. 添加 4 ul 的这个混合到每个井的384井 PCR 板, 连同 1 ul 的基因组 DNA 在浓度 5-10 ng/ul。
      注: 质量控制也应包括在板上, 如非模板控制, 和一个积极的控制, 以前表现良好的检测 (在测试运行期间)。如果运行多个板块, 来自另一板块 (s) 的多个 DNA 样本, 则应作为板间变异的技术控制运行。
   3. 将板材在室温下以 200 x g 为1分钟进行离心, 以确保所有液体都包含在板井的底部。
   4. 运行 PCR 与以下 thermocycler 条件: 4 分钟孵化在94°c 激活 DNA 聚合酶;45个周期以下 (变性在94°c 为二十年代, 退火在56°c 为三十年代和引伸在72°c 为1分钟) 和然后最后的引伸在72°c 为3分钟. 参考表 3中的 PCR 程序。
   5. 进行琼脂糖凝胶电泳, 确保 DNA 扩增成功。在 2% (µL) 琼脂糖凝胶上使用 1 PCR 产品 (3 µL 的负载缓冲器), 并将琼脂糖粉和0.5% 三硼酸 EDTA (no) 缓冲剂混合制成, 并在 45 v 上运行100分钟。
3. 虾碱性磷酸酶 (SAP) 纯化步骤
   注意: 此步骤用于移除未合并的核苷酸。SAP 酶将磷酸盐组组织在一起, 防止过量底漆和未合并的 dNTPs 干扰即将到来的延伸反应。
   1. 制作一个主组合, 其中包含1.7 个单位/ul 的虾碱性磷酸酶 (sap) 酶, 10x sap 缓冲, 并弥补体积与分子级水。请参阅表 4。
   2. 添加 2 ul 新组成的 SAP 主混合到每一个良好的板块, 已经包含 5 ul 从 PCR 反应。离心机简要和返回到 thermocycler 在37°c 40 分钟, 然后在85°c 5 分钟的酶失活。请参阅表 5。
4. 底漆延伸反应
   注: 延长底漆组合中的引伸引物的浓度必须按尺寸 (线性底漆调整) 调整。这是因为在峰值强度 (质量谱) 和产品质量上存在反向关系。调整引伸底漆浓度纠正这种关系, 产生同等强度的峰值。表 6 & 7提供了用于产生代表性结果的调整底漆。所提供的体积是产生1.5 毫升的延伸底漆组合。
   1. 使用梯度算法计算每个底漆的稀释系数, 可从阿金纳生物科学 ("线性底漆调整") 中获得, 它可以调整底漆的质量和浓度, 以及复用反应中的引物总数 (见表 6 & 7)。输入 UEP 质量为每个底漆进入 UEP_MASS 领域的线性底漆调整表。
      注: 该底漆的质量调整浓度将自动计算在细胞与标题文本 "目标反应浓度 (µM)。要添加到底漆池的底漆体积将输出在标头文本 "卷料底漆" 下的单元格中, 以添加到池中 (µL)。将添加到底漆池中的水量, 以弥补计算出的浓度是输出到的细胞旁边的文本 "PCR 等级 RNase 免费 H₂O 增加底漆池 (µL)。
   2. 取线性底漆调整文件中指定的每一底漆的体积, 并组成底漆池。添加算法计算的水量, 以稀释在步进2.4.1 中确定的底漆池。
      注: 如果梯度算法方法不可用, 另一种方法是将引物分为低质量和高质量, 并将高质量引物的浓度与低质量基团相加。高丛检测 (即19个 SNPs) 可能需要三或四组。然而, 该方法不会作为最佳的调用速率作为梯度算法的方法产生。
   3. 装配扩展主组合。对于低丛检测 (1-18 丛), 添加 0.2 ul 的缓冲, 0.1 ul 的终止混合, 0.94 ul 的溶血磷脂酸调整底漆混合, 0.0205 ul 的酶 (准备在冰上)。对于高丛试验 (19-36 丛), 加入双重浓度的终止混合和酶 (终止混合 0.2 ul 和 iPLEX 酶 0.041 ul)。请参阅表 8。
   4. 添加 2 ul 的延伸反应大师混合到板块从先前的反应, 现在把总体积到 9 ul 每井。离心机简要地和地方在 thermocycler:94 °c 为三十年代最初的孵化, 40 个周期 1 x 94 °c 为 5 s 与 5 x (52 °c 为 5 s, 跟随80°c 为 5 s), 然后72°c 为3分钟. 请参阅表 9。
5. 树脂提纯。
   注: 过量的盐现在可以从反应中去除与树脂的使用。
   1. 将 16 ul 的去离子水添加到回收板的井中, 使板材中的体积达到 25 ul。
   2. 适用于树脂, 通常6毫克的酒窝树脂板 (单独购买), 均匀地对整个板材。将树脂在树脂酒窝板中干燥20分钟, 然后再应用于反应板。加入树脂后, 在室温下用手或用悬浮搅拌机以慢速 (e.、7.5 rpm) 旋转板材5分钟。
      注: 在将基因型分析物加载到基因分型芯片之前, 样品和化验布局必须输入软件界面。这可以使用分析设计工具中的设计摘要文件来实现。
6. 在质谱平台上的测量。
   1. 离心板在 3200 x g 5 分钟, 以避免树脂应用于质谱芯片。
   2. 在运行之前, 将样品的板布局上载到系统的软件接口。
      注意: 步骤2.6.3 只应由训练有素的人员执行。
   3. 将分型分析物混合物从盘子中应用到分基因芯片上, 配以配药系统。接着, 将芯片加载到 MALDI 系统上, 从分析物混合物中生成质谱, 然后借助平台的软件接口解释。
      注: 系统通过在每个 "垫" 上指示紫外线光的短脉冲, 与质谱芯片上的基因分型板的单个井相对应, 生成质量谱。这种脉冲会导致分析物的解吸和电离。这些电离 DNA 分子然后被推进到真空管的顶部由高压静电场, 分离轻的离子, 移动更快和到达探测器首先, 从重的离子。这些分析物的 "飞行时间" 由系统记录, 每个 DNA 片段的质量可以被确定, 因而可以推断出在 SNP 上存在的核苷酸基。

3. 基因分型数据

注: 质量控制和数据解释不是本方法文件的重点。但是, 下面将简要介绍质量谱的解释。

1. 质谱的手工检验和质量控制。
   注: 原始质量谱由系统生成, 并与材料表中列出的软件进行分析。采用高斯混合聚类方法对该输出进行概率基因分型调用。
   1. 打开分析软件。选择打字员分析器。从 "文件" 菜单中, 选择 "从文件中打开井", 然后使用步骤2.6.3 中生成的频谱数据选择 xml 文件。运行的芯片名称应该是可见的, 选择它, 384 井板的 "红绿灯" 窗格将显示在选定井中的 snp 列表中。在此处, 选择 "调用群集图" 以查看每个 SNP 的散点图数据点。
      注意: 建议对低强度 SNPs 应用 "无调用" 结果。在用于代表结果的软件中, 提出了一种比默认值高5的聚类级切断方法, 用于严格的质量控制。此设置可在 "后处理群集" 窗格中的 "参数" 下的 "幅度截止" 字段中进行调整。从 "工具" 选项卡中选择 " Autocluster " 以运行群集分析。
   2. 通过检查后处理窗格中的笛卡尔地块, 对基因型调用进行手动检查。在 "分析" 窗格中, 选择感兴趣的 SNP, 然后单击 "后处理群集" 选项卡, 用样本 id 和 SNP 的相应基因型将可见一个具有基因组聚类的簇图。
   3. 检查基因型调用簇, 并评估每个个体调用集群与其他调用 SNP 的程度。该软件为每个基因型提供了一些边界线, 以供指导;参见基因型调用聚类图从IL13 SNP (图 1) 的例子。如果调用不与其他调用紧密地聚集在一起, 并且在群集中不存在, 或者如果它的强度很低, 请右键单击数据点并选择 "更改调用" 以手动将其设置为 "无呼叫"。
   4. 为了确保高品质的基因分型数据用于下游分析, 排除了 SNPs 和在 QC 门槛下的呼叫率的个人,例如90%。一旦对呼叫数据进行了适当的调整, 就可以导出统计应用程序的数据。在用于生成代表结果的软件 (在材料表中列出), 这是通过 "视图" 菜单中的 "板数据选择" 和 "另存为" 选择的。

通过上述的协议, 我们 genotyped 标记 snp 横跨 Th2 免疫基因IL13在一组食物过敏病例和控制9。我们应用了逻辑回归分析, 调整了祖先和其他潜在的变量, 以测试是否有兴趣区域内的遗传变异增加了食品过敏风险。表 109显示一个变种 rs1295686 与挑战被证明的食物过敏相关, 并且我们在复制队列证实了这个协会使用同样复用基因分型方法。对两个群体的结果进行 meta 分析, 为IL13与 FA (表 11)9的关联提供了有力的证据。我们基因推断和调整祖先在分析使用祖先信息的 SNP 标记面板, 改编自发布的面板10。我们使用相同的复用检测方法 genotyped 了面板。

相关的变种, rs1295686, 以前被确定为哮喘危险基因座11和与其他过敏性免疫学参数12, 表明它可能是一个普遍的过敏性疾病的危险基因座。接下来的步骤将是进行进一步的研究, 如差异表达分析, 映射物理相互作用与染色质捕获方法, 精细映射的区域, 和单体分析, 以针点的功能变体和特征生物在被观察的协会之后与食物过敏。

图 1: IL13 SNP rs1295686 的笛卡尔簇图.黄色簇代表纯合基因型呼唤一个等位基因, 蓝色的 G 等基因, 和绿色的异型调用。没有与纯合或异型质谱进行聚类的几种基因型调用被设置为 "无呼叫"。

表 1: 用于为IL13生成代表性结果的底漆序列."名称" 列包含 SNP id、井号 (如前所述, "井" 号指多路复用检测的 ID), 以及底漆的类型 (向前的 F, R 为反向, 以及延伸底漆的 UEP)。下一列包含底漆的顺序、底漆的大小和纯化类型。应该指出的是, SPINK5和祖先信息标记 (目标) 面板是 genotyped 使用相同的化验, 虽然这些结果没有讨论与提出的代表性结果。_CEU 和 _CHB 中的 snps 是指来自犹他州和中国北京的汉族人的目标 snps, 分别来自1000基因组项目。请单击此处下载此文件.

表 2: 使扩增 PCR 底漆组合所需的试剂和浓度.主混合体积为200反应, 因为 400 (足够覆盖384井板) 将不适合到1.5 µL 管, 因此 2 x 200 应在单独的管。如果多路复用检测 "井" 包含小于或等于26的 snps, 则在低丛下指定的卷应使用, 如果大于26的 snps 在井中使用高丛容量。

表 3: 扩增 PCR 的 Thermocycler 条件。

表 4: 用于 SAP 反应的主混合试剂和浓度.主混合体积被给予410反应, 以覆盖一个384井板与边缘的吹打误差。

表 5: SAP 反应所需的 Thermocycler 条件。

表 6: 井1经调整的引物用于产生代表性结果.根据尺寸调整的引伸底漆表, 包括目标浓度、底漆池中使用的容积以及底漆池中每个底漆的最终浓度为1井。在表的底部提供了弥补最终体积所需的水量。引物池总容积为1.5 毫升。

表 7: 井2经调整的引物用于产生代表性结果.根据尺寸调整的引伸底漆表, 包括目标浓度、底漆池中使用的容积以及底漆池中每个底漆的最终浓度为2井。在表的底部提供了弥补最终体积所需的水量。引物池总容积为1.5 毫升。

表 8: 引伸反应母料的试剂和浓度.在这种情况下, 如果在井中有18或更少的 SNPs, 就应该使用低丛反应的体积。对于19或更多的 SNPs 使用高丛反应容量。这是不同的 SNP 要求的低丛和高丛的扩增 PCR 主混合详细的表 2。

表 9: 延伸反应的 Thermocycler 条件

表 10:变体 rs1295686 的IL13轨迹与挑战证明的食物过敏有关.逻辑回归分析, 调整的祖先, 性别和存在的特应性湿疹, 透露, 变种 rs1295686 是与挑战证明食品过敏的发现队列 (n = 367 例和156非过敏性控制)。SNP 列列出正在检查的标记, A1 列列出了次要的等位基因, 用作关联测试的参考等位基因。p 列列出了回归分析中的 p 值, 或列列出了相应的赔率比率, L95 和 U95 是从分析中得到的95% 置信区间的下限和上限。数据从阿希礼等, 20179。

表 11:在独立的人群中复制确认IL13变异 rs1295686 和挑战被证明的食物过敏.对祖先主要成分、性别和特应性湿疹进行的逻辑回归, 在独立人群中 (n=203 食品过敏症和330例非过敏对照) 证实了变异 rs1295686 与食物过敏的关系。然后进行 Meta 分析, 为 snp 和结果之间的关联提供最高的证据, 很少有证据表明这两个族群在这一 snp 中的差异性大小。这里列是按表 10, 与附加 P (r) 和或 (r) 值为随机效应元分析模型 vs 固定效果模型 (P 和 OR)。Q 和 i 是 Cochrane 试验和 i 指数的 P 值, 两者都是研究间效应大小的异质性测度。数据从阿希礼等, 20179。

作者没有什么可透露的。