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一个 体外 研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法作用的模型 金黄色葡萄球菌 生物膜

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DOI：

10.3791/57604

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2018年4月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种研究5-氨基乙酰丙酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）对微生物抗菌作用的实验方案 金黄色葡萄球菌 生物膜。该方案可用于开发一种 体外 为将来研究光动力疗法（PDT）治疗细菌生物膜提供模型。

摘要

金黄色葡萄球菌 (S. aureus是一种常见的人类病原体，可引起化脓性和全身性感染。 S. aureus 感染难以根除不仅因为耐药菌株的出现，还因其能够形成生物膜。近年来，光动力疗法（PDT）被认为是一种控制生物膜感染的潜在治疗手段。然而，仍需进一步研究以加深对其作用机制及其对细菌生物膜影响的理解。本文描述了一种 体外 5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力疗法模型，其中5-ALA是实际光敏剂原卟啉IX（PpIX）的前体。简言之，成熟 S. aureus 生物膜经ALA孵育后暴露于光照。随后，评估ALA-PDT的抗菌效果 S. aureus 通过计算菌落形成单位（CFUs）对生物膜进行定量，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合活/死荧光染色进行可视化观察。代表性结果表明，ALA-PDT对细菌具有显著的抗菌作用 S. aureus 生物膜。该方案简单，可用于开发一种 体外 研究治疗的模型 S. aureus 使用ALA-PDT处理生物膜。未来，该方法也可在使用其他光敏剂针对不同细菌菌株的PDT研究中，经少量调整后加以参考。

引言

S. aureus 是一种重要的革兰氏阳性病原菌，可定植于人类宿主的皮肤和黏膜。其形成生物膜的能力被认为是其致病过程中的一个重要方面1。细菌生物膜是由细菌群体及其自身分泌的胞外聚合物基质共同构成的微环境，该基质包含多糖、DNA 和蛋白质等成分。这种基质在细菌感染的持续存在中发挥着关键作用，导致细菌对人类免疫系统以及现有的抗菌治疗手段具有高度耐受性2。目前，抗生素仍是治疗生物膜感染的主要手段，但其对生物膜的作用效果有限。已有研究表明，生物膜中的细菌细胞对抗生素的耐受性比浮游状态下的同类细胞高出 10 至 1,000 倍3。因此，亟需开发替代策略以应对这一难题。

光动力疗法（PDT）是一种治疗细菌感染的替代方法，其利用适当波长的光激活光敏剂，从而产生活性氧（ROS）。活性氧可通过破坏细胞壁、使酶失活以及损伤DNA，对靶细胞产生致死作用4。这种多靶点作用特性使得细菌难以对PDT治疗产生耐药性。

光动力疗法（PDT）对细菌和真菌生物膜的抗菌作用已在此前的研究中得到探讨，所使用的多种光敏剂包括亚甲苯蓝、孔雀石绿、亚甲蓝、氯素e6和卟啉类5,6,7,8,9,10,11,12,135-ALA 是实际光敏剂 PpIX 的前体药物，具有分子量小、清除速度快的特点12,14这些优势使ALA-PDT在治疗应用方面具有巨大潜力。尽管许多研究团队已对ALA-PDT对浮游细菌的作用进行了研究12，ALA-PDT 对细菌生物膜的抗菌作用尚未阐明。同时，既往研究之间的结果难以进行比较，其原因之一在于不同研究团队采用了不同的实验方案。因此，本方案描述了一种 体外 基于我们先前工作的ALA-PDT系统模型15通过CFU计数和CLSM活死染色验证了该模型的效果。

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方案

1. 生物膜形成

  1. 在96孔微孔板中形成生物膜
    1. 取出保存在-80 °C的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株USA300以及3株形成生物膜的临床菌株（C1 - C3）。
      注：临床菌株形成生物膜的能力已通过先前描述的微量滴定板法测定15。
    2. 将细菌接种于5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，在37 °C条件下振荡培养过夜至稳定期。
    3. 在25 °C下以4,000 x g离心过夜培养的细菌10分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，最终浓度为2.0 x 109 CFU/mL。
      注：细菌浓度通过测量光密度估算，并进一步通过平板计数法确定16，结果显示悬浮液中1 OD600相当于1.5 x 108 CFU/mL。
    4. 将细菌悬液用含0.5%葡萄糖的TSB培养基稀释1:200（即1.0 x 107 CFU/mL）。向经细胞培养处理的聚苯乙烯96孔微孔板的每孔中加入200 µL细菌悬液。
    5. 将微孔板在37 °C静置培养24小时，置于充分供氧的环境中。
      注：不同细菌菌株形成成熟生物膜所需的培养时间可能有所不同；应在光动力治疗实验前确定最佳时间15。
    6. 弃去各孔中的培养基，用PBS轻柔洗涤微孔板各孔三次，随后弃去上清液。
      注：此步骤应操作轻柔，避免扰动已形成的生物膜。
  2. 在培养皿中形成生物膜
    1. 将金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株USA300接种至5 mL TSB培养基中，在37 °C条件下振荡培养过夜至稳定期。
    2. 在25 °C下以4,000 x g离心过夜培养的细菌10分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于PBS中，最终浓度为2.0 x 109 CFU/mL。然后将细菌悬液用含0.5%葡萄糖的TSB培养基稀释至1:200（即1.0 x 107 CFU/mL）。向35 mm光学级玻璃底细胞培养皿中加入2 mL细菌悬液，并在37 °C静置培养24小时。
      注：细菌浓度通过测量光密度估算。
    3. 用移液器吸除培养基，然后用PBS轻柔冲洗培养皿中的生物膜三次，小心弃去上清液。
      注：避免移液器吸头接触培养皿底部。步骤2.2应在本步骤后立即进行，以防止形成的生物膜干燥。

2. 光照照射

  1. 将5-ALA储存于4 °C冰箱中。实验前，用PBS将5-ALA稀释至10 mM。
    注意：5-ALA溶液应在实验前新鲜配制。
  2. 在实验组中，向微孔板的每个孔中加入200 µL 10 mM ALA，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹微孔板或培养皿，于37 °C孵育1小时。随后，使用发光二极管（LED）以100 mW/cm2的光强照射微孔板或培养皿1小时，主波长为633 ± 10 nm17，以达到360 J/cm2的光剂量。
    注意：为确保光能均匀有效地传递至各孔/皿中的生物膜，需将光源顶端与孔/皿之间的距离固定为6.0 cm，并将实验区域限制在中央照射区域（10 cm × 8 cm）。为保证实验结果的可重复性，所有实验应在相同的室温条件下进行。
    在LED照射步骤中，为避免微孔板或培养皿直接暴露于其他光源（如日光、室内照明或灯光），应在将板/皿移至照射区域前先打开LED光源，且光线应足够明亮以完成操作。
  3. 设置对照组（本实验设置了三个对照组）。
    1. 第一对照组（ALA-LED-）：向微孔板的每个孔中加入200 µL PBS，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹板/皿，于37 °C孵育2小时。
    2. 第二对照组（ALA+LED-）：向微孔板的每个孔中加入200 µL 10 mM ALA，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹板/皿，于37 °C孵育2小时。
    3. 第三对照组（ALA-LED+）：向微孔板的每个孔中加入200 µL PBS，或向培养皿中加入2 mL。用铝箔包裹板/皿，于37 °C孵育1小时。随后将板/皿暴露于主波长为633 ± 10 nm17、光剂量为360 J/cm2的LED照射下。
      注意：在LED照射步骤中，应避免微孔板或培养皿直接暴露于其他光源，如日光、室内照明或灯光。

3. 光动力疗法治疗效果的测定

注意：为了确认5-氨基乙酰丙酸光动力疗法（ALA-PDT）对金黄色葡萄球菌（S. aureus）生物膜的作用，通过菌落形成单位（CFU）计数以及活/死染色法评估了经ALA-PDT处理与未处理细胞的存活率。

  1. 测定残留的可存活细菌细胞
    1. ALA-PDT 处理后，弃去孔板中的培养基，并用 PBS 洗涤孔板三次，以去除实验组和对照组中所有非黏附性细胞。
      注意：此步骤应轻柔操作。
    2. 用移液器枪头彻底刮取孔板中黏附的细菌细胞，并将细胞收集至锥形管中。
    3. 将细菌悬液在 4 °C 条件下以 4,000 × g 离心 10 分钟，然后弃去上清液。
    4. 将菌体重悬于 1 mL 含 0.25% 胰蛋白酶的 PBS 溶液中，在 37 °C 下孵育 1.5 小时。
    5. 以 4,000 × g 离心 10 分钟；弃去上清液，然后将沉淀重悬于 200 µL PBS 中。
    6. 用 PBS 对细胞悬液进行 1:10 系列稀释；取每种稀释样品 5 µL 点种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上。将 TSA 平板在 37 °C 下孵育 16 小时；然后，用肉眼计数细菌菌落数量（CFU/mL）。
  2. 通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察 S. aureus 生物膜
    1. 光照处理后，用 PBS 洗涤培养皿中的生物膜三次。
      注意：此步骤应轻柔操作。
    2. 加入 1 mL 1 µM 绿色荧光核酸染料（可穿透原核细胞膜，例如 SYTO9）和 1 mL 1 µM 碘化丙啶（PI），染色 20 分钟，以同时标记生物膜及死细胞。
    3. 使用 63X 1.4-NA 油浸物镜，在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下观察活细胞（绿色荧光，激发/发射波长 485 nm/530 nm）和死细胞（红色荧光，激发/发射波长 485 nm/630 nm）。
    4. 使用显微镜成像软件生成图像。

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结果

与对照组（ALA-LED-、ALA+LED- 和 ALA-LED+）相比，ALA-PDT 处理后，USA300 及三种临床菌株的生物膜中细菌活力均有所下降图1).

为了验证菌落形成单位（CFU）实验的结果，并观察5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对细菌的抗菌作用 S. aureus 生物膜 原位，使用CLSM结合活性染色对USA300生物膜进行可视化观察。活菌和死菌分别被染成绿色和红色荧光。图像显示，生物膜中的大部分细菌被ALA-PDT杀灭，这与CFU测定结果一致图2).

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讨论

光动力疗法（PDT）自100多年前被发明以来，已作为一种癌症治疗手段得到了广泛研究18。在过去十年中，PDT已被用作一种抗菌策略，并对某些耐药性致病菌表现出治疗效果12。与浮游状态相比，细菌生物膜对抗生素治疗表现出更强的耐药性3，而ALA-PDT对生物膜的作用效果尚未得到充分研究。

在本文中，一个 体外 ALA-PDT 系统被描述，并且该模型对此的抗菌效果 S. aureus 生物膜的效果已得到证实。采用两种方法来检测ALA-PDT对 S. aureus 本方案中的生物膜。CFU检测通过计算处理后存活细胞数量来评估抗菌效果，而利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行的荧光活死染色不仅验证了CFU检测的结果，还检测了活菌与死菌的形态特征。 原位结合使用这两种分析技术是确定ALA-PDT对生物膜作用效果的理想方法。根据CLSM结果，死亡的细菌细胞主要分布在上层，而底层的部分...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由国家自然科学基金青年项目（编号 81300810）、上海市青年医生培养计划（编号 20141057）以及国家自然科学基金（81671982、81271791 和 81571955）资助。我们感谢 LetPub（www.letpub.com）在本论文撰写过程中提供的语言协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）OXOIDCM0129B
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒 
碘化丙啶（PI）Thermo Fisher ScientificL7012LIVE/DEAD BacLight 细菌活性检测试剂盒 
胰酶Sigma-AldrichP3292
5-氨基乙酰丙酸（ALA）复旦张江生物医药3.1
Staphylococcus aureus 菌株 USA300//USA 300 来源参考文献：“Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”。
Staphylococcus aureus 临床菌株（C1-C3）//所有临床菌株均分离自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉头颈外科收治的慢性鼻窦炎患者 [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, 等. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]。
96孔微孔板Corning Inc3599透明平底聚苯乙烯组织培养处理微孔板，独立包装，带盖，无菌
FluorodishNEST 生物科技801001玻璃底，无热原
Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf 微型离心机 5417EppendorfZ365998 | SIGMA
培养箱Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 台式轨道摇床
发光二极管（LED）武汉雅阁光电技术有限公司LED-IB
Leica TCS SP8 共聚焦激光扫描显微镜Leica Microsystems
Leica LAS AF 软件Leica Microsystems
IMARIS 软件Bitplane

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