本方案旨在研究从内生环境分离的Bacillus mycoides对马铃薯根系分泌物的转录组响应。该方法有助于鉴定参与植物-微生物互作的关键细菌基因，原则上也可适用于其他内生菌与植物，仅需进行少量调整。
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摘要
摘要
有益的植物相关细菌在促进植物生长和防治植物病害方面发挥着重要作用。将植物根际促生细菌（PGPR）作为生物肥料或生物防治剂施用，已成为传统化肥使用的有效替代方案，能够以较低成本提高作物产量。植物与微生物之间的互作依赖于宿主植物分泌的信号分子以及相关细菌对这些信号的响应。然而，目前对有益细菌如何响应植物来源信号的分子机制尚不完全清楚。评估细菌对根系分泌物的转录组响应，是研究根际条件下细菌基因表达与调控的有力手段。此类知识对于理解植物-微生物互作背后的机制至关重要。本文介绍了一种详细的研究方案，用于分析分离自马铃薯内生环境的菌株B. mycoides EC18对马铃薯根系分泌物的转录组响应。借助当前的高通量测序技术，该方案可在数周内完成，并产生大量数据。首先，在无菌条件下收集根系分泌物，随后将其添加至B. mycoides培养物中。利用苯酚/氯仿法结合 commercial kit 提取这些培养物中的RNA，并通过自动化电泳仪器进行质量控制。测序完成后，使用基于网络的T-REx分析流程对数据进行处理，鉴定出一组差异表达基因。该方法是推动揭示参与植物-微生物互作的细菌基因新发现的有力工具。
引言
植物可能通过根系将光合作用中固定的碳的多达20%分泌到根际环境中1, 即，即根系附近的狭小土壤区域。由于养分较为丰富，根际是多种微生物的适宜栖息地，包括促进植物生长的细菌。根系分泌物包含多种无机化合物，如离子、无机酸、氧气和水。然而，根系分泌物的主体为有机物质，可进一步分为低分子量化合物和高分子量化合物。低分子量化合物包括氨基酸、有机酸、糖类、酚类化合物、脂肪酸以及多种次生代谢产物；高分子量化合物则主要由黏液和蛋白质组成。2,3根际微生物可利用其中部分化合物作为生长和发育的能量来源。根系分泌物在塑造根际细菌群落方面发挥着重要作用，因为植物产生的分泌物中的化合物可通过影响特定基因的表达，调控与根际相关细菌的行为。
了解细菌对根系分泌物的响应是解析植物-微生物互作机制的关键步骤。由于细菌对植物-微生物互作的响应源于差异基因表达，因此可通过转录组分析进行研究。利用该方法，先前的研究已鉴定出多个参与植物-微生物互作的重要基因。在Pseudomonas aeruginosa中，参与代谢、趋化性及II型分泌系统的基因被证明可响应甜菜根系分泌物4。Fan et al.5 研究了B. amyloliquefaciens FZB42 对玉米根系分泌物的转录组谱变化。其结果表明，在根系分泌物强烈诱导的基因中，有多个基因群参与了与营养利用、趋化性、运动性以及非核糖体合成抗菌肽和聚酮化合物相关的代谢通路。
这些研究的准确性依赖于根系分泌物的收集。尽管已有多种方法用于不同目的的根系分泌物采集，但这些方法要么需要复杂的仪器，要么无法在严格控制的条件下进行6,7,8。此外，根际抑制性微生物可通过影响植物细胞膜通透性和损伤根组织，从而改变根系分泌物的组成，特别是在多种微生物共存的情况下尤为显著9。在研究微生物对根系分泌物的响应时，使用明确定义的实验条件至关重要，以避免其他微生物对化合物造成干扰10。此外，基于RNA测序的转录组研究需要高质量的RNA。然而，在处理非模式细菌菌株时，由于未知因素或特殊的生长特性，标准操作流程或商用试剂盒通常效率较低。
本方案中使用了B. mycoides进行验证，该菌属于厚壁菌门（Firmicute），是一种革兰氏阳性、可形成孢子的细菌，广泛存在于多种植物根际环境中。已有研究报道该菌具有多种促进植物生长的特性，包括诱导甜菜产生系统抗性（ISR）11、抑制黄瓜猝倒病病原菌Pythium12，以及在向日葵根际中进行固氮作用13。然而，其与宿主植物相互作用的分子机制尚缺乏深入研究。
本实验旨在研究内生菌分离的 B. mycoides 对马铃薯根系分泌物的转录组响应。简而言之，该实验方案包括以下步骤：首先，在无菌条件下收集马铃薯根系分泌物；然后，从经根系分泌物处理的细菌细胞中提取高质量RNA；最后一步是利用基于网络的T-REx分析流程14进行数据分析。该方案已被用于鉴定在接触根系分泌物后表达水平发生变化的 B. mycoides 基因，这些基因可能在植物-微生物互作中发挥重要作用。
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方案
1. 在无菌条件下萌发马铃薯
- 用无菌水冲洗马铃薯表面。将马铃薯先后浸入70%乙醇和3%次氯酸钠溶液中，各5分钟。再次用无菌水冲洗，以去除残留的次氯酸钠。
- 准备马铃薯块茎萌发和生长所需的材料；将塑料盆、嫁接篮、蛭石和水在121 °C下高压灭菌20分钟。
注意：确保所用材料均可高压灭菌。若不可，则采用其他灭菌方法。 - 将表面灭菌后的马铃薯放入嫁接篮中，并将其置于含有湿润蛭石的已灭菌盆中。
- 将盆置于24 °C的气候培养箱中培养三周，光照周期设置为16小时光照（120 µmol m-2s-1）和8小时黑暗。为避免微生物污染，使用大型玻璃纤维箱将盆覆盖。
2. 收集马铃薯根系分泌物
- 当芽开始萌发时，将带有整颗马铃薯的篮子转移至一个装有150 mL经高压灭菌的去离子水的无菌烧杯中，使马铃薯块茎位于水面之上，而根部浸入水中（见图1）。将幼苗置于气候培养箱中，并使用与之前相同的设置 [24 °C；16小时光照（120 µmol m-2s-1）、8小时黑暗的光暗循环]。
- 从第二天开始，收集含有分泌物的水，并用无菌去离子水重新加满烧杯。自转移幼苗之日起，每天进行一次取样，持续至第七天。
- 将每个样本单独储存在4 °C条件下。对每个样本，取100 µL涂布于Luria-Bertani（LB；1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl）琼脂平板，以检测微生物污染。弃用被污染的样本。
- 合并同一株幼苗收集的所有样本，并在-40 °C条件下通过冷冻干燥浓缩至终体积150 mL。
3. 培养细菌
- 从-80 °C甘油保藏菌种中挑取一环B. mycoides菌株，划线接种至LB琼脂平板上，于30 °C培养过夜。
- 用平板上的单菌落接种LB液体培养基，在30 °C、200 rpm条件下于摇床中过夜培养。
4. 细菌的处理与取样
- 为了比较经根系分泌物处理的细菌与阴性对照的生长曲线，准备一系列含有50 mL LB液体培养基的锥形瓶。向所有锥形瓶中加入0.5 mL过夜培养的细菌，并分别向培养基中添加0%、5%、10%或15%（v/v）的根系分泌物或无菌去离子水。
- 以添加去离子水而非根系分泌物的培养物作为对照。此后每隔1小时测定600 nm处的光密度（OD600）。通过绘制OD600值随时间变化的曲线，生成生长曲线。
注：我们观察到10%的根系分泌物对B. mycoides的生长无影响（见图2）；该比例被用于RNA-seq实验。 - 将过夜培养的B. mycoides菌液用90 mL预热的LB培养基稀释至初始OD600约为0.05，置于300 mL锥形瓶中。向菌液中加入10 mL根系分泌物，并在30 °C下孵育1小时。
- 以10 mL无菌去离子水处理作为对照。在4 °C、9,000 × g条件下离心2分钟收集菌体。弃去上清液，立即将菌体沉淀用液氮速冻，随后于-80 °C保存备用。
5. RNA 提取
注意：在开始分离之前，使用 RNase 去污染溶液清洁工作台、试管架和移液器（参见材料表）。始终佩戴手套，并确保所有离心管、吸头和溶液均为无 RNase 的。尽可能将样品保持在冰上。
- 向超纯水中加入0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC）（每100 mL溶液中加入100 µL DEPC），充分混匀，并在室温下静置过夜。过夜处理后，对混合液进行高压灭菌以灭活DEPC。使用该DEPC处理的超纯水配制TE缓冲液[10 mM Tris-HCl（pH = 8）；1 mM EDTA]和10% SDS（w/v）溶液。
- 将细胞沉淀在冰上解冻，每份沉淀用400 µL TE（DEPC）缓冲液重悬。将悬液转移至2 mL螺口管中。
- 预先混合300 µL氯仿-异戊醇（24:1 v/v）和300 µL苯酚（酸性苯酚，RNA级），静置5分钟。取500 µL有机上层相加入重悬的细胞中。然后向管中加入50 µL 10% SDS和0.5 g玻璃珠（0.5 µm）。
- 牢固盖紧管盖，将管放入珠磨式匀浆器中（见材料表）。在冰上以每次45秒、间隔1分钟的方式进行3次脉冲匀浆。
- 在11,000 × g、4 °C条件下离心样品10分钟，将上层相转移至新管中。
- 向第5.5步所得上层相中加入500 µL氯仿-异戊醇（24:1），在11,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
注意：以下步骤根据商用玻璃纤维滤膜RNA提取试剂盒的说明书进行了修改（见材料表）。 - 将500 µL上层相转移至新离心管中，加入2倍体积（1 mL）裂解/结合缓冲液，通过移液上下吹打混匀。
- 将RNA提取试剂盒中的滤膜管与收集管组合，将第5.7步的混合液移入滤膜管中。在8,000 × g条件下离心15秒，弃去穿滤液。
- 在1.5 mL微量离心管中预先加入100 µL DNase缓冲液、10 µL DNase I和5 µL RNase抑制剂（见材料表）。将配制好的溶液加至滤膜管的滤膜上，于15–25 °C孵育20–30分钟。
- 按照试剂盒说明书进行洗涤步骤。使用50 µL洗脱缓冲液洗脱RNA。
- 将洗脱的RNA保存于-80 °C，并在其周围包裹一层塑料封口膜。同时，取少量样品转移至1.5 mL微量离心管中，用于质量检测。
6. RNA 质量检测与测序
- 使用微量分光光度计检测RNA。
注意：260/280的吸光度比值应高于1.8，260/230的比值应至少高于1.8，最好高于2.0。 - 使用推荐的RNA分析试剂盒（见材料表），在自动化电泳仪中对纯化的RNA进行检测；RNA完整性数（RIN）必须至少高于7方可继续后续实验。
- 每个样本使用总计3 µg RNA，按照生产商说明书，利用RNA-Seq文库构建试剂盒制备文库（见材料表）。
注意：文库在高通量测序平台上进行测序，并生成双端读长（paired-end reads）。
7. 使用基于网络的分析流程 T-REx 进行数据分析
- 使用 FASTX-Toolkit 版本 0.0.13 对数据进行质量过滤（Phred 质量值 > 20）。利用 Trimmomatic 工具去除原始 RNA-Seq 测序读段中的接头序列。
注意：所有下游分析均基于高质量的干净数据。 - 下载 B. mycoides ATCC 6462 的 NCBI 基因组数据库（NCBI 登录号：CP009692.1），并将其作为参考基因组，使用 Bowtie2/2.2.3 将干净的测序读段比对至该基因组。
- 使用 HTSeq v0.6.1 统计比对到每个基因的读段数量，并根据基因长度及比对到该基因的读段数，计算每个基因的每千碱基转录本每百万比对读段数（RPKM）。
- 在使用 T-REx 分析流程进行数据分析时，以 RPKM 表作为输入文件，同时提供三个描述性文件：(i) 因子文件，用于以因子形式描述实验设计；(ii) 对比文件，用于定义哪些因子将用于差异基因表达分析；(iii) 类别文件，用于描述感兴趣的基因组。
注意：这些描述性文件为 .txt 格式，示例可在 T-REx 官网（http://genome2d.molgenrug.nl/）获取。有关使用 T-REx 进行数据分析的详细说明，请参见 de Jong et al.14 的前期发表文献。
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结果
与植物相关的微生物可对植物生长和健康产生积极影响。然而，植物与其微生物共生体之间复杂相互作用的机制尚未完全阐明。根系分泌物在调控根际细菌活性和行为方面发挥着重要作用，通常认为微生物对根系的定殖始于其被根系分泌物吸引。本研究旨在探讨根际细菌 B. mycoides 对马铃薯根系分泌物的转录组响应。为实现该目标，将马铃薯块茎进行表面灭菌后，在经高压灭菌的蛭石中萌发。随后按 图1 所示方法收集根系分泌物。为排除根系分泌物影响细菌生长的可能性，在 B. mycoides 培养物中添加了不超过15%的根系分泌物，在检测期间未观察到生长变化（图2）。因此，本研究中观察到的基因表达变化不太可能由生长相关效应引起。
收集后，将根系分泌物以10%（v/v）的比例加入 B. mycoides 培养物中...
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讨论
植物与微生物的相互作用被认为由细菌与植物之间精细调控的平衡所决定。这类相互作用在包含多种微生物物种（可能以群落形式发挥作用）的自然系统中极为复杂，难以研究。本文描述了一种简化的实验方案，用于在严格可控条件下研究细菌对根系分泌物的响应。根际细菌在接触根系分泌物后产生的转录组谱图，可提供细菌适应根际微环境的详细信息。该根系分泌物收集方案无需复杂操作步骤和专用设备。然而，所有操作必须在严格的无菌条件下进行，并应设置无菌对照。我们建议同时培养多个马铃薯块茎，并剔除被污染的样本。若研究其他植物物种，可对该方案进行相应修改。重要的是，应采用适当的方法对种子或块茎进行灭菌，因为不同材料对所用消毒剂的耐受性可能存在差异。
获得根系分泌物后，必须从细菌细胞中分离高质量的RNA。目前主要基于苯酚/氯仿法或TRIzol法的各种试剂和标准方案耗时较长16。市售试剂盒大多针对模式生物设计，对其他生物的适用性较差。本RNA提取方案结合了苯酚/氯仿法与RNA提取试剂盒，克服了上述方法的缺点。此外，加入珠磨步骤以均质化在浮游培养中通常发生聚集的B. myco...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
感谢 Jakob Viel 提供的有益评论和建议。同时感谢 Anne de Jong 在生物信息学分析方面的帮助。Yanglei Yi 和 Zhibo Li 由国家留学基金管理委员会（CSC）提供资助。感谢荷兰科学研究组织-TTW 透视计划 Back2Roots（TKI-AF-15510）为 OPK 提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 次氯酸钠 | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 含10-15% 活性氯 |
| LB（Luria-Bertani）液体培养基 | |||
| 培养箱 | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| 液氮 | |||
| 玻璃珠 | Sigma | G8893 | 直径0.5 µm |
| 带螺口盖的2.0 ml离心管 | 无RNase | ||
| 1.5 ml和2.0 ml离心管 | 无RNase | ||
| 珠磨式匀浆器 | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| 离心机 | Eppendorf | 5430 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma | CAS: 151-21-3 | 用DEPC处理的超纯水配制10%溶液 |
| TE缓冲液 | 10 mM Tris-HCl；1 mM EDTA，pH=8 | ||
| 苯酚 | Sigma | RNA级 | |
| 氯仿-异戊醇 | 按24:1比例配制氯仿:异戊醇，室温保存 | ||
| 高纯度RNA提取试剂盒 | Roche | 11828665001 | |
| RNase去污染溶液 | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| 自动化电泳仪 | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| 微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA质量分析试剂盒 | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| 链特异性RNA文库构建试剂盒 | NEB | Ultra | 适用于Illumina平台 |
参考文献
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