本方案旨在研究从内生环境分离的Bacillus mycoides对马铃薯根系分泌物的转录组响应。该方法有助于鉴定参与植物-微生物互作的关键细菌基因，原则上也可适用于其他内生菌与植物，仅需进行少量调整。
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本文内容
摘要
摘要
有益的植物相关细菌在促进植物生长和防治植物病害方面发挥着重要作用。将植物根际促生细菌（PGPR）作为生物肥料或生物防治剂施用，已成为传统化肥使用的有效替代方案，能够以较低成本提高作物产量。植物与微生物之间的互作依赖于宿主植物分泌的信号分子以及相关细菌对这些信号的响应。然而，目前对有益细菌如何响应植物来源信号的分子机制尚不完全清楚。评估细菌对根系分泌物的转录组响应，是研究根际条件下细菌基因表达与调控的有力手段。此类知识对于理解植物-微生物互作背后的机制至关重要。本文介绍了一种详细的研究方案，用于分析分离自马铃薯内生环境的菌株B. mycoides EC18对马铃薯根系分泌物的转录组响应。借助当前的高通量测序技术，该方案可在数周内完成，并产生大量数据。首先，在无菌条件下收集根系分泌物，随后将其添加至B. mycoides培养物中。利用苯酚/氯仿法结合 commercial kit 提取这些培养物中的RNA，并通过自动化电泳仪器进行质量控制。测序完成后，使用基于网络的T-REx分析流程对数据进行处理，鉴定出一组差异表达基因。该方法是推动揭示参与植物-微生物互作的细菌基因新发现的有力工具。
引言
植物可能通过根系将光合作用中固定的碳的多达20%分泌到根际环境中1, 即，即根系附近的狭小土壤区域。由于养分较为丰富，根际是多种微生物的适宜栖息地，包括促进植物生长的细菌。根系分泌物包含多种无机化合物，如离子、无机酸、氧气和水。然而，根系分泌物的主体为有机物质，可进一步分为低分子量化合物和高分子量化合物。低分子量化合物包括氨基酸、有机酸、糖类、酚类化合物、脂肪酸以及多种次生代谢产物；高分子量化合物则主要由黏液和蛋白质组成。2,3根际微生物可利用其中部分化合物作为生长和发育的能量来源。根系分泌物在塑造根际细菌群落方面发挥着重要作用，因为植物产生的分泌物中的化合物可通过影响特定基因的表达，调控与根际相关细菌的行为。
了解细菌对根系分泌物的响应是解析植物-微生物互作机制的关键步骤。由于细菌对植物-微生物互作的响应源于差异基因表达，因此可通过转录组分析进行研究。利用该方法，先前的研究已鉴定出多个参与植物-微生物互作的重要基因。在Pseudomonas aeruginosa中，参与代谢、趋化性及II型分泌系统的基因被证明可响应甜菜根系分泌物4。Fan et al.5 研究了<....
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方案
1. 在无菌条件下萌发马铃薯
- 用无菌水冲洗马铃薯表面。将马铃薯先后浸入70%乙醇和3%次氯酸钠溶液中，各5分钟。再次用无菌水冲洗，以去除残留的次氯酸钠。
- 准备马铃薯块茎萌发和生长所需的材料；将塑料盆、嫁接篮、蛭石和水在121 °C下高压灭菌20分钟。
注意：确保所用材料均可高压灭菌。若不可，则采用其他灭菌方法。 - 将表面灭菌后的马铃薯放入嫁接篮中，并将其置于含有湿润蛭石的已灭菌盆中。
- 将盆置于24 °C的气候培养箱中培养三周，光照周期设置为16小时光照（120 µmol m-2s-1）和8小时黑暗。为避免微生物污染，使用大型玻璃纤维箱将盆覆盖。
2. 收集马铃薯根系分泌物
- 当芽开始萌发时，将带有整颗马铃薯的篮子转移至一个装有150 mL经高压灭菌的去离子水的无菌烧杯中，使马铃薯块茎位于水面之上，而根部浸入水中（见图1）。将幼苗置于气候培养箱中，并使用与之前相同的设置 [24 °C；16小时光照（120 µmol m-2s-1）、8小时黑暗的光暗循环]。
- 从第二天开始，收集含有分泌物的水，并用无菌去离子水重新加满烧杯。自转移幼苗之日起，每天进行一次取样，持续至第七天。 ....
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结果
与植物相关的微生物可对植物生长和健康产生积极影响。然而，植物与其微生物共生体之间复杂相互作用的机制尚未完全阐明。根系分泌物在调控根际细菌活性和行为方面发挥着重要作用，通常认为微生物对根系的定殖始于其被根系分泌物吸引。本研究旨在探讨根际细菌 B. mycoides 对马铃薯根系分泌物的转录组响应。为实现该目标，将马铃薯块茎进行表面灭菌后，在经高压灭菌的蛭石中萌发。随后按 图1 所示方法收集根系分泌物。为排除根系分泌物影响细菌生长的可能性，在 B. mycoides 培养物中添加了不超过15%的根系分泌物，在检测期间未观察到生长变化（图2）。因此，本研究中观察到的基因表达变化不太可能由生长相关效应引起。
收集后，将根系分泌物以10%（v/v）的比例加入 B. mycoides 培养物中.......
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讨论
植物与微生物的相互作用被认为由细菌与植物之间精细调控的平衡所决定。这类相互作用在包含多种微生物物种（可能以群落形式发挥作用）的自然系统中极为复杂，难以研究。本文描述了一种简化的实验方案，用于在严格可控条件下研究细菌对根系分泌物的响应。根际细菌在接触根系分泌物后产生的转录组谱图，可提供细菌适应根际微环境的详细信息。该根系分泌物收集方案无需复杂操作步骤和专用设备。然而，所有操作必须在严格的无菌条件下进行，并应设置无菌对照。我们建议同时培养多个马铃薯块茎，并剔除被污染的样本。若研究其他植物物种，可对该方案进行相应修改。重要的是，应采用适当的方法对种子或块茎进行灭菌，因为不同材料对所用消毒剂的耐受性可能存在差异。
获得根系分泌物后，必须从细菌细胞中分离高质量的RNA。目前主要基于苯酚/氯仿法或TRIzol法的各种试剂和标准方案耗时较长16。市售试剂盒大多针对模式生物设计，对其他生物的适用性较差。本RNA提取方案结合了苯酚/氯仿法与RNA提取试剂盒，克服了上述方法的缺点。此外，加入珠磨步骤以均质化在浮游培养中通常发生聚集的B. myco.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
感谢 Jakob Viel 提供的有益评论和建议。同时感谢 Anne de Jong 在生物信息学分析方面的帮助。Yanglei Yi 和 Zhibo Li 由国家留学基金管理委员会（CSC）提供资助。感谢荷兰科学研究组织-TTW 透视计划 Back2Roots（TKI-AF-15510）为 OPK 提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 次氯酸钠 | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 含10-15% 活性氯 |
| LB（Luria-Bertani）液体培养基 | |||
| 培养箱 | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| 液氮 | |||
| 玻璃珠 | Sigma | G8893 | 直径0.5 µm |
| 带螺口盖的2.0 ml离心管 | 无RNase | ||
| 1.5 ml和2.0 ml离心管 | 无RNase | ||
| 珠磨式匀浆器 | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| 离心机 | Eppendorf | 5430 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma | CAS: 151-21-3 | 用DEPC处理的超纯水配制10%溶液 |
| TE缓冲液 | 10 mM Tris-HCl；1 mM EDTA，pH=8 | ||
| 苯酚 | Sigma | RNA级 | |
| 氯仿-异戊醇 | 按24:1比例配制氯仿:异戊醇，室温保存 | ||
| 高纯度RNA提取试剂盒 | Roche | 11828665001 | |
| RNase去污染溶液 | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| 自动化电泳仪 | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| 微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA质量分析试剂盒 | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| 链特异性RNA文库构建试剂盒 | NEB | Ultra | 适用于Illumina平台 |
参考文献
- Haichar, F. eZ., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M.
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