慢病毒介导的转基因小鼠制备：一种用于直接研究 Founder 小鼠的简单高效方法

摘要

本文介绍一种通过将慢病毒载体直接注射到受精卵的卵周隙中，以高效促进外源基因整合并制备首建者转基因小鼠的实验方案。

摘要

近40年来，原核DNA显微注射一直是通过外源基因随机整合来制备转基因小鼠的标准方法。该技术在全球范围内被广泛应用，但其主要局限在于外源基因整合效率较低，导致获得的首建鼠（founder）数量较少。在显微注射后移植受精卵所出生的仔鼠中，仅有少数百分比个体成功整合了外源基因。相比之下，慢病毒载体是一种高效的整合型基因转移工具，将其用于感染受精卵可实现高达70%以上的首建鼠平均获得率，显著提高了制备效率。此外，该方法适用于任何品系的小鼠，且外源基因的表达穿透性极高，采用慢病毒介导的转基因技术时，基因表达率超过80%，明显优于DNA显微注射。然而，慢病毒载体所能携带的DNA片段大小受限于10 kb，这是该方法的主要局限。通过在受精卵透明带（zona pellucida）下进行一种简单且易于操作的注射程序，单次显微注射实验即可获得50只以上的首建鼠。该方法特别适用于在首建鼠个体中直接开展基因功能获得或缺失的快速研究，或对基因组DNA区域进行体内（in vivo）功能筛选，以评估其调控基因表达的能力。

引言

戈登的开创性工作 等 1980年的研究表明，在假孕小鼠中植入后，将质粒DNA注射到雄性个体中 原核 受精卵的处理可获得整合了质粒DNA的转基因动物¹转基因哺乳动物的成功制备对全球生命科学产生了巨大影响，为基础科学和转化生物医学研究开辟了全新的研究领域。在过去的四十年中，DNA显微注射已成为常规技术。尽管已产生了大量转基因小鼠，但该标准方法并非适用于所有小鼠品系，且需要耗时的回交过程。^2,3其在其他物种中的应用仍然具有挑战性⁴ 且整体的转基因整合率仅限于出生动物的百分之几⁵此外，转基因整合效率是解释原核DNA显微注射总体产量低下的限制性因素。在这方面，整合型病毒载体是运输和整合转基因最有效的工具，因此可能为显著提高整合率提供新的途径，唯一的限制是转基因的大小不能超过10 kb。⁶.

带有水疱性口炎病毒（VSV）包膜蛋白的假型慢病毒载体是一种具有广宿主范围和高整合效率的基因转移工具，可用于转导受精卵⁷。该 透明带 包裹卵母细胞的结构是一种天然的病毒屏障，必须穿透该屏障才能实现....

方案

所有涉及动物实验的操作均已获得伦理批准，并由法国研究与教育部授权，许可编号为APAFIS#5094-20 16032916219274 v6和05311.02。ICM动物实验中心PHENOPARC已获得法国农业部认证，认证编号为B75 13 19。整体实验方案要求每项操作均在特定时间范围内完成，具体时间安排详见图1。

1. 动物采购与基础化合物的制备

1. 动物购买
   1. 订购25只8周龄的结扎雄性B6CBAF1/JRj小鼠（由♀C57Bl/6JRj与♂CBA/JRj交配产生的F1代）。
      注意：动物到达后应立即隔离。结扎雄性小鼠可重复使用至少一年。
      每3周更换一次笼具。
   2. 订购50只10周龄的B6CBAF1/JRj雌性小鼠，并维持不少于50只的动物群体。
   3. 订购10至15只8周龄的C57BL/6JRj可育雄性小鼠。
   4. 订购30只4周龄的C57BL/6JRj雌性小鼠。
2. 麻醉与安乐死
   1. 通过腹腔注射300μL的氯胺酮/赛拉嗪混合液进行麻醉（氯胺酮剂量为150μg/g体重，赛拉嗪剂量为0.15μg/g体重）。将动物置于加热垫上以调节体温。在开始操作前，通过轻捏动物尾部检查反射情况。
   2. 采用颈椎脱位法实施安乐死....

结果

采用本方案生成了转基因动物。图示结果展示了普遍性及特定细胞类型中转基因的表达情况。

转基因的组成型表达

普遍型启动子是基础研究中用于持续高效表达外源基因的基本工具。这类启动子被广泛应用于多种多样的研究场景，从 体外 细胞转染至 体内 小型和大型动物的转基因技术

慢病毒载体被构建为在巨细胞病毒（CMV）启动子或基于鸡β-肌动蛋白启动子与CMV增强子融合而成的复合启动子CAG的控制下，表达绿色荧光报告基因（eGFP）。两种慢病毒载体均被制备（补充方法），并在293T细胞中根据eGFP的表达水平测定滴度，单位为转导单位（TU）。将两种慢病毒载体构建物.......

讨论

本文所述在受精卵中进行慢病毒载体的卵周隙注射，获得了转基因胚胎，其数量占所收集胚胎总数的70%以上。该结果与以往报道一致，体现了该操作方法的特异性^2,7,10,11,12。比较表1中所有数据，可突出几个重要特征。首先，移植卵的数量对应于所有注射后形态正常、且在培养数小时后未发生裂解的注射卵。93%的注射卵得以移植，表明慢病毒载体注射至卵周隙几乎不产生快速毒性。相比之下，DNA注射的情况则截然不同，仅有44%的注射卵存活并被移植。此外，两种方法中收集胚胎数与移植卵数的比值基本相同，提示慢病毒载体并无加剧的长期毒性。其次，若以整合了转基因的胚胎数相对于注射卵总数来计算，慢病毒载体注射的整体效率比DNA注射高出10倍以上。当采用相同的Neurog3增强子构建体比较两种方法中表达转基因的胚.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm 培养皿	Dutsher	353003
4 孔 Nunc 培养皿	Dutsher	56469	体外受精培养皿
M2 培养基	Sigma	M7167
M16 培养基	Sigma	M7292
0,22 µm 注射器滤器	Dutsher	146611
透明质酸酶 30mg	Sigma	H4272	经小鼠胚胎测试
胰岛素注射器	VWR	613-3867	Terumo Myjector
弯镊	Moria	2183
弯剪	Moria	MC26
校准微量移液毛细管用吸管组件	Sigma	A5177-5EA
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus	GC 100-10
水平微量移液器拉制仪	Narishige	PN-30
显微操作仪	Narishige	MF-900
倒置显微镜	Nikon	Transferman NK2 5188	需配备霍夫曼调制对比照明系统
显微操作器	Eppendorf	Celltram air
持卵针控制器	Eppendorf	Femtojet
矿物油	Sigma	M8410	经小鼠胚胎测试
显微注射仪	Eppendorf	Femtojet	可用于注射 DNA 或病毒载体
Dumont #5 镊子	Moria	MC 40
Vannas 显微剪刀	Moria	9600
异氟烷	Centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
Ocrygel	Centravet	OCR002
聚维酮碘	Centravet	VET001	Vetedine 120ml
丁丙诺啡	Centravet	BUP002	Buprecare 0.3 mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	三羟甲基氨基甲烷盐酸盐
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	粉末
蛋白酶 K	Sigma	P2308
oneTaq 试剂盒	NEB	M0480L
引物	Eurogentec
8联排 PCR 管	4titude	4ti-0781
96孔 PCR 仪	Applied Biosystems	4375786	Veriti
基因组 DNA 小量提取试剂盒	Invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR 预混液	Roche	4887352001	SYBR Green
384孔多孔板	Roche	5217555001
384孔 qPCR 仪	Roche	5015243001	LightCycler 480