本文介绍了一种用于培养鸡胚胎器官的器官型培养方案 体外 利用该方法可在高度控制培养环境的条件下研究鸡胚胎组织的发育过程。
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摘要
摘要
鸡胚胎通常被用作研究脊椎动物发育的一种可靠模式生物。由于其易于操作且孵化周期较短，非常适合开展实验研究。目前，对鸡胚胎中这些发育通路的研究通常通过多种方法，在局部位点以低浓度施加抑制剂和药物来实现。体外组织 培养是一种使组织在脱离宿主生物体的情况下进行研究的技术，同时可规避使用完整胚胎时存在的诸多物理限制，例如胚胎对可能致命的高剂量化学物质的敏感性。本文介绍了一种鸡胚胎半侧头部的器官型体外培养方案，为超越现有方法进一步探究发育过程提供了新的机会。
引言
鸡胚胎（Gallus gallus）是一种在生物学领域中广泛使用的优秀模式生物。其孵化期约为21天，且可同时孵化大量卵，使实验过程快速而高效。或许最重要的是，该胚胎易于操作，便于深入研究关键的发育过程以及驱动这些过程的基因和蛋白质。
鸡胚胎的眼睛是一个复杂的器官，其发育过程与其他许多身体系统类似，依赖多种不同组织之间的相互作用。via 该方法可实现对这些组织发育过程的研究，尤其适用于发育较晚期阶段的观察。例如，多层结构的视网膜可能对神经系统发育研究者具有特别意义。其他可用来研究角膜、玻璃体、晶状体、巩膜以及眼睑等眼部组织的替代方法，也对科研人员具有重要价值。鸡胚胎眼内还包含一系列扁平骨结构，即巩膜骨小骨（scleral ossicles），可作为研究脊椎动物膜内成骨诱导及骨化过程的模型1。
目前，有多种方法可用于研究胚胎发育。通过显微注射抑制性抗体或其他抑制性分子2,3、植入经抑制剂浸泡的微型珠粒4，以及电穿孔技术5，均可用于下调胚胎中特定基因或蛋白的表达。类似的方法也可用于上调蛋白表达。然而，这些方法均存在一定的局限性。例如，当使用化学物质干预胚胎发育时，必须评估其对胚胎的致死效应，因此上述方法的应用通常局限于局部区域，且剂量需控制在足以保证胚胎存活的低水平。
体外组织 培养已被广泛应用于多种生物体以研究发育过程，并可用于克服前述部分局限性。例如，鸡的股骨6、羽毛芽7,8和四肢9均已通过组织培养方法进行了研究，小鼠的睾丸10以及植物的根和茎11 likewise 如此。这些方法使科研人员能够高度控制组织发育过程，例如调节温度和改变营养物质的可利用性。将组织从完整胚胎中分离出来后，其对化学物质的致死效应也显著降低，从而可在更高浓度下进行大规模的操作研究。体外培养的另一个显著优势在于能够维持组织的细胞微环境；组织的排列结构相对保持不变，使得研究不同类型组织之间的相互作用成为可能9。因此，体外培养为那些在体内或卵内模型中无法实现的实验方法开辟了新的途径。
目前，利用化学物质研究鸡胚眼睛的发育过程极具挑战性。由于有多种胚外膜覆盖胚胎，难以施加微珠或化学物质；随着胚胎在蛋内逐渐发育，其活动性也显著增强，这进一步加大了本已困难的操作难度。本方案可便捷地接触眼睛及其周围组织，消除了上述障碍，同时为研究眼内发育过程提供了新的机会。该方案的建立旨在研究胚胎眼内巩膜骨片的诱导过程。
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方案
注意：对于胚胎发育阶段，请使用 Hamburger 和 Hamilton12（HH）分期表。
1. 胚胎孵育
- 将受精的鸡卵置于无菌、温度可控的孵育箱中，在 37 °C ± 1 °C 和约 40% 湿度条件下孵育。
- 每天翻卵 1 次，并继续孵育至 HH34 期（受精后 8 天）。
2. 材料的准备与灭菌
- 准备12个胚胎所需材料：将2 L蒸馏水、1 L 0.85%鸡生理盐水、12根玻璃移液管、1盒纸巾、24片2.5 cm × 2.5 cm的半透性滤纸以及24片2.5 cm × 2.5 cm、边缘向下弯曲的钢丝网，在121 °C条件下高压灭菌至少15分钟。
注意：上述材料的高压灭菌可提前进行。 - 使用70%乙醇擦拭培养箱的内壁、搁板和门，对培养箱进行消毒。在培养箱内放置两个装有已灭菌蒸馏水的塑料容器以维持湿度。将培养箱预热至37 °C ± 1 °C，相对湿度约为40%。确保培养箱内部完全避光；若箱门透明，需用锡箔纸覆盖。
- 将100 mL营养培养基和1 mL青霉素置于培养箱中预热。
- 在实验台面上铺上纸巾，并用70%乙醇喷洒台面以进行消毒。同样使用70%乙醇对两对镊子、解剖剪刀、剃刀刀片和一把塑料勺进行灭菌处理。
- 将12个无菌的100 mm培养皿和24个无菌的35 mm培养皿放置于实验台面上备用。确保这些培养皿在使用前始终保存在无菌袋中。
3. 胚胎制备
注意：从此时起，需佩戴防护性防尘口罩，以避免污染培养物。细菌或真菌感染会破坏培养，并存在迅速扩散至培养箱中所有培养物的风险。
- 敲开鸡蛋，将胚胎转移至含有0.85%鸡生理盐水的100 mm培养皿中。根据Hamburger和Hamilton分期指南12中描述的解剖特征对胚胎进行分期，并确认胚胎处于HH34期。
- 切开胚胎颈部，然后使用无菌剃刀刀片沿中线将头部一分为二。用无菌镊子取出脑组织，保留喙部完整。
4. 培养体系的建立
- 将两个35 mm培养皿放入一个100 mm培养皿中。
- 在每个35 mm培养皿内放置一片钢丝网。
- 使用镊子将一个已切开的头部组织转移至一张2.5 cm × 2.5 cm的半透性滤纸上，确保眼部朝上。可轻微倾斜滤纸，以确保组织固定稳妥，不会滑落。
- 使用镊子小心地将带有滤纸的眼部组织放置于其中一个35 mm培养皿内的钢丝网上，形成一个眼部组织位于上方的抬高平台。
- 对另一个半头重复步骤4.3和4.4。
- 使用无菌玻璃移液管，小心地将营养培养基直接加入每个35 mm培养皿中，直至液面达到滤纸水平。切勿将半头组织完全浸入营养培养基中。
- 向每个培养皿的营养培养基中加入50 µL的10,000 U/mL青霉素-链霉素溶液。
- 将一张滤纸折叠成小方块，放入100 mm培养皿内，并用高压灭菌的蒸馏水润湿。
- 将培养皿置于37 °C ± 1 °C、相对湿度约40%的无菌、避光培养箱中，培养时间最长可达4天。
- 对每个胚胎重复步骤3和4。
注意：所需胚胎数量取决于具体实验；此处以12个胚胎为例描述实验方案。
5. 培养物的维持
- 每天一次，向培养箱中的塑料容器补充新鲜的、经高压灭菌的蒸馏水。
- 每天检查所有培养物是否存在细菌或真菌污染。若培养物已解体或培养基颜色发生改变，则表明已被污染。丢弃所有受污染的培养物。
6. 固定
- 培养结束后，将所有培养皿从培养箱中取出。
- 使用一对镊子，轻轻将眼球从滤纸上取下，注意避免撕裂组织。
- 将眼球组织在4%多聚甲醛（溶于1×磷酸盐缓冲液）中于4 °C固定过夜，或在10%中性缓冲福尔马林中室温固定过夜。
- 将组织保存在4 °C的1×磷酸盐缓冲液中。
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结果
利用该方法，可将鸡胚胎眼睛从发育第8天（HH34）开始进行体外培养 体外 4天。4天的 在卵内 发育阶段对应 HH38。
该培养方法可支持眼周及眼睑上羽毛芽的发育（图1B。这些羽毛芽不存在 在卵内 在培养前的HH34期图1A），表明羽毛芽的发育是在培养期间启动的，与体内情况一致 在卵内13 (图1C）。在培养过程中，眼睑和瞬膜逐渐生长以覆盖眼球。图1B). 眼睑在之后显得更加成熟 体外 培养至HH34阶段时的培养情况相较于培养初期
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讨论
该方案利用成熟的组织培养技术，实现从鸡胚第8天（HH34）开始的眼组织生长 体外 培养4天。这种网格培养法最初由Trowell描述15我们优化了Pinto和Hall在1991年研究中提出的实验方案16 利用带有网格的半透膜研究胚胎鸡眼分离组织层之间的诱导信号15. 采用该方法，Roach 培养了14日龄鸡的股骨6该方法在小鼠组织的培养中也已证明有效6,17滤纸的使用对该实验方案的成功至关重要，因为它有助于组织有效吸收培养基中的营养物质，同时避免组织被过度浸润或浸泡。
营养液的pH值适宜对细胞的最佳生长至关重要。培养基的pH值应处于或接近生理pH值，使用酚红作为培养基中的指示剂具有优势，因为pH的变化可以被轻易检测。可使用无血清培养基，无需每日更换培养基，且不会...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Gregory Haller（Mount Saint Vincent University）在本实验方案开发初期所做的工作。作者还感谢 Nicholas Jones（Mount Saint Vincent University）在手稿的音视频部分拍摄与制作过程中提供的专业技术支持与协助。Daniel Andrews 的研究得到了 Mount Saint Vincent University 和加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）的资金支持。 通过 一名本科生研究奖获得者。塔玛拉·A·弗兰兹-奥登达尔尔（Tamara A. Franz-Odendaal）由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 细胞培养培养皿 | Corning | 353001 | 易握型组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原 |
| 100 mm 细胞培养培养皿 | Corning | 353003 | 组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原 |
| 纸巾 | Kimtech | 34155 | Kimtech Science 品牌任务擦拭纸，每箱 280 张 |
| 金属网 | n/a | n/a | 不锈钢金属网（网格尺寸 0.7 mm） |
| 一次性玻璃移液管 | VWR | 14673-010 | 硼硅酸盐玻璃一次性 5 3/4" |
| 营养培养基 | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson 改良型，含 L-谷氨酰胺和酚红（BGJB） |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 单位/mL 青霉素-链霉素稳定溶液 |
| 滤纸 | Whatman | 1454 090 | 半透性滤纸，直径 90 mm |
| 受精鸡胚 | 达尔豪西大学农学院 | n/a | 可从本地农场获取 |
| 氯化钠（NaCl） | EMD | SX0420-3 | 氯化钠晶体，试剂级 |
| 1 L 玻璃瓶 | VWR | 89000-240 | 1 L 耐热玻璃可高压灭菌瓶 |
| 乙醇 | 菲舍尔科技 | BP82011 | 70% 分子生物学级 |
| 塑料密封盒 | n/a | n/a | 市售并用乙醇灭菌 |
| 一次性剃须刀片 | VWR | 55411-050 | 单刃工业剃须刀片（外科级碳钢） |
| 塑料勺 | n/a | n/a | 市售并用乙醇灭菌 |
| 防尘口罩 | 3M | n/a | 3M 8500 舒适型口罩 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | 多聚甲醛，试剂级，结晶状 |
| 中性缓冲福尔马林 | 菲舍尔科技 | 72210 | 10% 中性缓冲福尔马林 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | n/a | n/a | 10X 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（137 mM NaCl，2.5 mM KCl，4.3 mM Na2HPO4，1.4 mM KH2PO4） |
| 15 ml 离心管 | VWR | 21008-216 | 预灭菌离心管 |
| 镊子 | FST | n/a | 精细镊子 |
| 鸡生理盐水 | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| 锡箔纸 | n/a | n/a | 市售 |
| 纸巾 | n/a | n/a | 市售 |
参考文献
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