研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

摘要

本文介绍了一种用于培养鸡胚胎器官的器官型培养方案 体外 利用该方法可在高度控制培养环境的条件下研究鸡胚胎组织的发育过程。

摘要

鸡胚胎通常被用作研究脊椎动物发育的一种可靠模式生物。由于其易于操作且孵化周期较短，非常适合开展实验研究。目前，对鸡胚胎中这些发育通路的研究通常通过多种方法，在局部位点以低浓度施加抑制剂和药物来实现。体外组织 培养是一种使组织在脱离宿主生物体的情况下进行研究的技术，同时可规避使用完整胚胎时存在的诸多物理限制，例如胚胎对可能致命的高剂量化学物质的敏感性。本文介绍了一种鸡胚胎半侧头部的器官型体外培养方案，为超越现有方法进一步探究发育过程提供了新的机会。

引言

鸡胚胎（Gallus gallus）是一种在生物学领域中广泛使用的优秀模式生物。其孵化期约为21天，且可同时孵化大量卵，使实验过程快速而高效。或许最重要的是，该胚胎易于操作，便于深入研究关键的发育过程以及驱动这些过程的基因和蛋白质。

鸡胚胎的眼睛是一个复杂的器官，其发育过程与其他许多身体系统类似，依赖多种不同组织之间的相互作用。via 该方法可实现对这些组织发育过程的研究，尤其适用于发育较晚期阶段的观察。例如，多层结构的视网膜可能对神经系统发育研究者具有特别意义。其他可用来研究角膜、玻璃体、晶状体、巩膜以及眼睑等眼部组织的替代方法，也对科研人员具有重要价值。鸡胚胎眼内还包含一系列扁平骨结构，即巩膜骨小骨（scleral ossicles），可作为研究脊椎动物膜内成骨诱导及骨化过程的模型¹。

目前，有多种方法可用于研究胚胎发育。通过显微注射抑制性抗体或其他抑制性分子^2,3、植入经抑制剂浸泡的微型珠粒⁴，以及电穿孔技术⁵，均可用于下调胚胎中特定基因或蛋白的表达。类似的方法也可用于上调蛋白表达。然而，这些方法均存在一定的局限性。例如，....

方案

注意：对于胚胎发育阶段，请使用 Hamburger 和 Hamilton¹²（HH）分期表。

1. 胚胎孵育

1. 将受精的鸡卵置于无菌、温度可控的孵育箱中，在 37 °C ± 1 °C 和约 40% 湿度条件下孵育。
2. 每天翻卵 1 次，并继续孵育至 HH34 期（受精后 8 天）。

2. 材料的准备与灭菌

1. 准备12个胚胎所需材料：将2 L蒸馏水、1 L 0.85%鸡生理盐水、12根玻璃移液管、1盒纸巾、24片2.5 cm × 2.5 cm的半透性滤纸以及24片2.5 cm × 2.5 cm、边缘向下弯曲的钢丝网，在121 °C条件下高压灭菌至少15分钟。
   注意：上述材料的高压灭菌可提前进行。
2. 使用70%乙醇擦拭培养箱的内壁、搁板和门，对培养箱进行消毒。在培养箱内放置两个装有已灭菌蒸馏水的塑料容器以维持湿度。将培养箱预热至37 °C ± 1 °C，相对湿度约为40%。确保培养箱内部完全避光；若箱门透明，需用锡箔纸覆盖。
3. 将100 mL营养培养基和1 mL青霉素置于培养箱中预热。
4. 在实验台面上铺上纸巾，并用70%乙醇喷洒台面以进行消毒。同样使用70%乙醇对两对镊子、解剖剪刀、剃刀刀片和一把塑料勺进行灭菌处理。

结果

利用该方法，可将鸡胚胎眼睛从发育第8天（HH34）开始进行体外培养 体外 4天。4天的 在卵内 发育阶段对应 HH38。

该培养方法支持眼周及眼睑上羽毛芽的发育（图1B。这些羽毛芽不存在 在卵内 在培养前的HH34期图1A），表明羽毛芽的发育是在培养期间启动的，与体内情况一致 在卵内¹³ (图1C）。在培养过程中，眼睑和瞬膜逐渐生长以覆盖眼球。图1B). 眼睑在之后显得更加成熟 体外 培养至HH34阶段时的培养情况相较于培养初期

讨论

该方案利用成熟的组织培养技术，实现从鸡胚第8天（HH34）开始的眼组织生长 体外 培养4天。这种网格培养法最初由Trowell描述¹⁵我们优化了Pinto和Hall在1991年研究中提出的实验方案¹⁶ 利用带有网格的半透膜研究胚胎鸡眼分离组织层之间的诱导信号¹⁵. 采用该方法，Roach 培养了14日龄鸡的股骨⁶该方法在小鼠组织的培养中也已证明有效^6,17滤纸的使用对该实验方案的成功至关重要，因为它有助于组织有效吸收培养基中的营养物质，同时避免组织被过度浸润或浸泡。

营养液的pH值适宜对细胞的最佳生长至关重要。培养基的pH值应处于或接近生理pH值，使用酚红作为培养基中的指示剂具有优势，因为pH的变化可以被轻易检测。可使用无血清培养基，无需每日更换培养基，且不会.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 细胞培养培养皿	Corning	353001	易握型组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原
100 mm 细胞培养培养皿	Corning	353003	组织培养皿，聚苯乙烯材质，无热原
纸巾	Kimtech	34155	Kimtech Science 品牌任务擦拭纸，每箱 280 张
金属网	n/a	n/a	不锈钢金属网（网格尺寸 0.7 mm）
一次性玻璃移液管	VWR	14673-010	硼硅酸盐玻璃一次性 5 3/4"
营养培养基	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson 改良型，含 L-谷氨酰胺和酚红（BGJB）
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458	10000 单位/mL 青霉素-链霉素稳定溶液
滤纸	Whatman	1454 090	半透性滤纸，直径 90 mm
受精鸡胚	达尔豪西大学农学院	n/a	可从本地农场获取
氯化钠（NaCl）	EMD	SX0420-3	氯化钠晶体，试剂级
1 L 玻璃瓶	VWR	89000-240	1 L 耐热玻璃可高压灭菌瓶
乙醇	菲舍尔科技	BP82011	70% 分子生物学级
塑料密封盒	n/a	n/a	市售并用乙醇灭菌
一次性剃须刀片	VWR	55411-050	单刃工业剃须刀片（外科级碳钢）
塑料勺	n/a	n/a	市售并用乙醇灭菌
防尘口罩	3M	n/a	3M 8500 舒适型口罩
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	多聚甲醛，试剂级，结晶状
中性缓冲福尔马林	菲舍尔科技	72210	10% 中性缓冲福尔马林
磷酸盐缓冲液（PBS）	n/a	n/a	10X 磷酸盐缓冲液，pH 7.4（137 mM NaCl，2.5 mM KCl，4.3 mM Na2HPO4，1.4 mM KH2PO4）
15 ml 离心管	VWR	21008-216	预灭菌离心管
镊子	FST	n/a	精细镊子
鸡生理盐水	n/a	n/a	0.85% NaCl
锡箔纸	n/a	n/a	市售
纸巾	n/a	n/a	市售