本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。
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摘要
摘要
大脑皮层由多种细胞类型组成，这些细胞表现出不同的形态学、生理学和分子特征。这种多样性阻碍了对这些细胞类型的简便鉴定与表征，而鉴定与表征正是研究其特定功能的前提条件。本文描述了一种多重单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方案，该方法可在脑片上进行膜片钳记录后，同时检测单个细胞中数十个基因的表达情况。该方法操作简便，可与形态学表征相结合，广泛适用于确定各类细胞类型的表型特征及其特定的细胞微环境，例如血管周围区域的细胞特性。该方案的基本原理是：利用膜片钳技术记录单个细胞，收集并逆转录其胞质内容物，再通过多重PCR定性检测一组预定义基因的表达情况。该方法需要精心设计PCR引物，并使用与RT-PCR兼容的细胞内膜片钳溶液。为确保转录本检测的选择性和可靠性，从胞质采集到扩增的各个环节均需设置适当的对照。尽管本文讨论的注意事项必须严格遵守，但几乎所有电生理实验室均可应用多重单细胞RT-PCR技术。
引言
大脑皮层包含多种参与不同生理过程的细胞类型。由于皮层细胞类型具有显著的形态学、生理学和分子多样性，要识别和鉴定这些细胞类型（理解其特定功能的前提）极具挑战性1,2,3,4。
单细胞多重RT-PCR技术基于膜片钳与RT-PCR技术的结合，能够同时检测电生理学鉴定的细胞中30多个预定义基因的表达5。在记录电极内加入神经元示踪剂，可在组织化学显影后进一步对记录的细胞进行形态学表征6,7,8,9,10。该技术对于基于多变量分析细胞表型特征来分类神经元类型极为有用5,9,10
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方案
所有涉及动物的实验操作均严格遵循法国法规（Code Rural R214/87 至 R214/130），并符合欧洲经济共同体（86/609/EEC）和法国动物实验伦理国家宪章的伦理准则。所有实验方案均经查尔斯·达尔文伦理委员会批准，并提交至法国高等教育与研究部（批准号：2015 061011367540）。IBPS 动物实验设施已获得法国主管部门认证（认证编号：A75-05-24）。
1. 初步考虑
注意：为避免污染，在进行膜片钳后单细胞 RT-PCR 之前，请遵循以下建议。
- 实验室中不要使用含有目的基因的质粒，因为它们可能成为污染源。
- 应预留一个远离凝胶电泳室的实验台用于PCR体系的配制。
- 专门配备一套移液器和带滤芯的气溶胶阻隔吸头，用于操作浓度低于1 ng/µL的DNA和RNA。切勿用这些器具分析PCR产物。
- 始终使用无RNase和DNase的耗材，并佩戴手套。
- 配制膜片钳内液应使用专用的化学试剂。称量粉末时切勿使用药匙，而应使用称量纸。
- 使用专用的pH电极和pH标准溶液，因为它们可能成为污染源（例如，RNase污染）。
- 将硼硅酸盐玻璃毛细管、20 µL长且尖端细而柔韧的吸头、20 µL微量移液器、自制的推出装置（连接至10 mL注射器的膜片钳移液器 hol....
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结果
多重RT-PCR的代表性验证结果如图3所示。该实验方案旨在同时检测12个不同基因的表达。囊泡型谷氨酸转运蛋白vGluT1被用作谷氨酸能神经元的阳性对照42。GABA合成酶（GAD65和GAD67）、神经肽Y（NPY）以及生长抑素（SOM）被用作GABA能中间神经元的标志物3,5,11。环氧化酶-2（COX-2）被用作锥体细胞亚群的标志物3,16。
选择Na+/K+ ATP酶的ATP1α1-3亚基以及AT.......
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讨论
在膜片钳记录后进行单细胞多重RT-PCR，可同时且可靠地检测电生理学鉴定细胞中超过30个基因的表达5。在单细胞水平上分析基因表达需要高效能的PCR引物。其中最关键的限制步骤之一是细胞内容物的收集。其效率取决于膜片钳电极尖端的直径，该直径应尽可能大，同时与细胞大小相匹配。研究表明，尖端开口直径为1–2 µm的电极适用于大多数类型的神经元。还必须确保仅收集细胞内容物，而不混入周围组织。这可通过电生理手段监控采集过程中紧密封接的维持情况来实现。在撤回电极时形成外向-out膜片构型，可进一步保护所采集的细胞质免受细胞碎片污染。单细胞多重RT-PCR的成功率还取决于目标细胞类型中mRNA的丰度。例如，星形胶质细胞的mRNA表达量相对较低3，因此从中获得的产物量通常低于神经元，需增加样本数量以补偿15,16。逆转录反应在离心管中的效率较低48，是单细胞多重RT-PCR的限速步骤。因此，使用高.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Alexandre Mourot 博士对本文手稿的评论。本工作得到了法国国家研究署（ANR 2011 MALZ 003 01；ANR-15-CE16-0010 和 ANR-17-CE37-0010-03）的资助；BLG 得到了阿尔茨海默病研究基金会博士后奖学金的支持。感谢 IBPS 动物实验中心（法国巴黎）提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | 用于引物设计的多序列比对 | |
| 二硫苏糖醇 | VWR | 443852A | RT |
| 随机引物 | Sigma-Aldrich（默克） | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| RNasin 核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II 逆转录酶 | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA聚合酶 | Qiagen | 201205 | PCR |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich（默克） | M5904-5ML | PCR |
| PCR 引物 | Sigma-Aldrich（默克） | PCR / 脱盐并稀释至200 µM | |
| 0.5 mL平盖管 | 赛默飞世尔科技 | AB0350 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| BT10 系列 - 10 µL滤芯吸头 | Neptune Scientific | BT10 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| BT20 系列 - 20 µL滤芯吸头 | Neptune Scientific | BT20 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| BT200 系列 - 200 µL滤芯吸头 | Neptune Scientific | BT200 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| BT1000 系列 - 1000 µL滤芯吸头 | Neptune Scientific | BT1000.96 | 逆转录与聚合酶链式反应 |
| DNA热循环仪 | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| 溴化乙锭 | Sigma-Aldrich（默克） | E1510-10ML | 琼脂糖凝胶电泳 |
| Tris-硼酸-EDTA缓冲液 | Sigma-Aldrich（默克） | T4415-1L | 琼脂糖凝胶电泳 |
| UltraPure 琼脂糖 | Life Technologies | 16500-500 | 琼脂糖凝胶电泳 |
| ΦX174 DNA-Hae III 酶切 | NEB（New England BioLabs） | N3026S | 琼脂糖凝胶电泳 |
| EDA 290 | 柯达 | 琼脂糖凝胶电泳 | |
| 电泳电源 EPS 3500 | Pharmacia Biotech | 琼脂糖凝胶电泳 | |
| 中型水平电泳仪型号 SHU13 | Sigma-Aldrich（默克） | 琼脂糖凝胶电泳 | |
| 表面光滑、具有缎面外观的纸张 | Fisherbrand | 1748B | 膜片钳内液 |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich（默克） | 60377 | 膜片钳内液 |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸 | Sigma-Aldrich（默克） | E3889 | 膜片钳内液 |
| HEPES | Sigma-Aldrich（默克） | H4034 | 膜片钳内液 |
| D-葡萄糖酸钾 | Sigma-Aldrich（默克） | G4500 | 膜片钳内液 |
| 氯化镁溶液 | Sigma-Aldrich（默克） | M1028 | 膜片钳内液 |
| 5500 蒸气压渗透压计 | Wescor | 膜片钳内液 | |
| 生物胞素 | Sigma-Aldrich（默克） | B4261 | 膜片钳内液 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich（默克） | S5016 | 组织切片制备 |
| D-(+)-葡萄糖一水合物 | Sigma-Aldrich（默克） | 49159 | 切片制备 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich（默克） | S6191 | 切片制备 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich（默克） | 60128 | 切片制备 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich（默克） | 31437-M | 切片制备 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich（默克） | S5011 | 切片制备 |
| 氯化镁溶液 | Sigma-Aldrich（默克） | 63069 | 切片制备 |
| 氯化钙溶液 | Sigma-Aldrich（默克） | 21115 | 组织切片制备 |
| 犬尿喹啉酸 | Sigma-Aldrich（默克） | K3375 | 切片制备 |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare UK | 切片制备 | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | 组织切片制备 |
| 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich（默克） | H1009 | 膜片钳装置清洁 |
| 带细丝的薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments | TW150F-4 | 膜片钳 |
| PP-83 | Narishige | 膜片钳 | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | 膜片钳 |
| BX51WI 正置显微镜 | Olympus | 膜片钳 | |
| XC-ST70/CE 黑白CCD视频相机 | 索尼 | 膜片钳 | |
| Axopatch 200B 放大器 | Molecular Devices | 膜片钳 | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | 膜片钳 | |
| pCLAMP 10 软件套装 | Molecular Devices | 膜片钳 | |
| 10 mL注射器 | Terumo | SS-10ES | 排出 |
| 直筒式E系列（支架） | Phymep | 64-0997 | 排出 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich（默克） | S7907 | 组织化学显色 |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich（默克） | S8282 | 组织化学显色 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich（默克） | P6148 | 组织化学显色 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich（默克） | X100 | 组织化学显色 |
| 来自冷水鱼皮的明胶 | Sigma-Aldrich（默克） | G7041 | 组织化学显色 |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物 | 赛默飞世尔科技 | S11223 | 组织化学显色 |
| 24孔板 | Greiner Bio-One | 662160 | 组织化学显色 |
参考文献
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
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