方法文章

膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

DOI：

10.3791/57627

⸱

2018年6月20日

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大脑皮层由多种细胞类型组成，这些细胞表现出不同的形态学、生理学和分子特征。这种多样性阻碍了对这些细胞类型的简便鉴定与表征，而鉴定与表征正是研究其特定功能的前提条件。本文描述了一种多重单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方案，该方法可在脑片上进行膜片钳记录后，同时检测单个细胞中数十个基因的表达情况。该方法操作简便，可与形态学表征相结合，广泛适用于确定各类细胞类型的表型特征及其特定的细胞微环境，例如血管周围区域的细胞特性。该方案的基本原理是：利用膜片钳技术记录单个细胞，收集并逆转录其胞质内容物，再通过多重PCR定性检测一组预定义基因的表达情况。该方法需要精心设计PCR引物，并使用与RT-PCR兼容的细胞内膜片钳溶液。为确保转录本检测的选择性和可靠性，从胞质采集到扩增的各个环节均需设置适当的对照。尽管本文讨论的注意事项必须严格遵守，但几乎所有电生理实验室均可应用多重单细胞RT-PCR技术。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大脑皮层包含多种参与不同生理过程的细胞类型。由于皮层细胞类型具有显著的形态学、生理学和分子多样性，要识别和鉴定这些细胞类型（理解其特定功能的前提）极具挑战性1,2,3,4。

单细胞多重RT-PCR技术基于膜片钳与RT-PCR技术的结合，能够同时检测电生理学鉴定的细胞中30多个预定义基因的表达5。在记录电极内加入神经元示踪剂，可在组织化学显影后进一步对记录的细胞进行形态学表征6,7,8,9,10。该技术对于基于多变量分析细胞表型特征来分类神经元类型极为有用5,9,10,11,12,13,14。单细胞多重RT-PCR也适用于星形胶质细胞等非神经元细胞的表征15,16,17，并且理论上可应用于所有脑区结构18,19,20,21,22,23和细胞类型，前提是这些细胞能够以全细胞构型进行记录。

当缺乏特异性抗体时，该技术对于鉴定传递系统的细胞来源和/或靶细胞尤其便捷7,8,15,16,20,21,24,25,26,27,28。该方法依赖于对视觉可识别细胞进行的膜片钳记录29，因此也可实现对特定细胞微环境中细胞的靶向研究8,15,16。此外，由于脑组织的细胞构筑在脑切片中得以保留，该方法还可用于研究已鉴定细胞与神经元及非神经元结构之间的解剖学关系7,8,18。

由于该技术受限于所获取细胞质的量以及逆转录（RT）效率，检测低拷贝数表达的mRNA可能较为困难。尽管基于RNaseq技术的其他方法能够分析单个细胞的全转录组3,4,30,31，但这些方法需要高通量且昂贵的测序仪，而并非所有实验室都具备此类设备。由于单细胞多重RT-PCR技术采用终点PCR，因此仅需广泛可用的PCR仪即可。该方法可在配备电生理实验装置的实验室中轻松开展，无需昂贵仪器。它能够在一天内完成对预定义基因集合的表达情况进行定性分析。因此，该方法为快速获取单细胞分子特征提供了便捷途径。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及动物的实验操作均严格遵循法国法规（Code Rural R214/87 至 R214/130），并符合欧洲经济共同体（86/609/EEC）和法国动物实验伦理国家宪章的伦理准则。所有实验方案均经查尔斯·达尔文伦理委员会批准，并提交至法国高等教育与研究部（批准号：2015 061011367540）。IBPS 动物实验设施已获得法国主管部门认证（认证编号：A75-05-24）。

1. 初步考虑

注意：为避免污染，在进行膜片钳后单细胞 RT-PCR 之前，请遵循以下建议。

  1. 实验室中不要使用含有目的基因的质粒，因为它们可能成为污染源。
  2. 应预留一个远离凝胶电泳室的实验台用于PCR体系的配制。
  3. 专门配备一套移液器和带滤芯的气溶胶阻隔吸头，用于操作浓度低于1 ng/µL的DNA和RNA。切勿用这些器具分析PCR产物。
  4. 始终使用无RNase和DNase的耗材，并佩戴手套。
  5. 配制膜片钳内液应使用专用的化学试剂。称量粉末时切勿使用药匙，而应使用称量纸。
  6. 使用专用的pH电极和pH标准溶液，因为它们可能成为污染源（例如，RNase污染）。
  7. 将硼硅酸盐玻璃毛细管、20 µL长且尖端细而柔韧的吸头、20 µL微量移液器、自制的推出装置（连接至10 mL注射器的膜片钳移液器 holder）、500 µL PCR管、10 µL带滤芯的气溶胶阻隔吸头以及细头永久性记号笔存放于专用的盒子中（图1）。

2. 引物设计

注意：多重逆转录 PCR 依赖于两个扩增步骤。在第一轮 PCR 中，通过混合所有 PCR 引物，同时扩增所有目的基因。为了可靠地检测单个细胞中的转录本，设计高效且特异性的 PCR 引物至关重要。在第二轮 PCR 中使用巢式（内部）引物可提高扩增的特异性和效率。

  1. 在 NCBI 参考序列数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）中检索目标基因及其相关家族基因的精选 mRNA 序列32。
    1. 输入目标基因名称和物种作为查询条件，点击检索到的相关序列。
    2. 为将分析限制在基因的编码序列范围内，点击发送至（右上角），选择编码序列和FASTA 核苷酸格式，然后点击创建文件，并使用".nt"文件扩展名保存 FASTA 序列。
  2. 使用 MACAW 软件33（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）或其他多序列比对软件确定同源区域。
    1. 点击文件 | 新建项目...，选择DNA作为序列类型。导入基因序列时，选择序列 | 导入序列...，加载一个".nt"文件。对所有相关序列重复此操作。
    2. 在示意图窗口中点击并拖动所有序列，以选中全部序列。
    3. 通过选择比对 | 搜索模块...（CTRL+S）来搜索同源区域。在搜索方法中选择片段对重叠。将成对比分阈值设为相对较高的值（例如，1,000），并将每模块最少序列数设为待比对序列的总数，然后点击开始。
    4. 在弹出的搜索结果窗口中，选择 MP 分数最高的结果，点击链接。若未找到结果，可降低成对比分阈值和/或每模块最少序列数。
    5. 为便于可视化同源区域，选择比对 | 着色 | 平均分数。
    6. 选择未链接的序列部分，重复步骤 2.2.3–2.2.4，以可能发现 MP 分数较低的其他同源区域。
    7. 为获得特异性最强的引物，应选择序列同源性最低的区域。
  3. 获取所有剪接变体的序列，并重复步骤 2.2.1–2.2.6。选择其共有区域以实现整体检测。针对特定剪接变体的分析，考虑使用可变外显子盒20,34,35,36。
  4. 使用 BLAST37 基因组（Basic Local Alignment Search Tool）将 mRNA 序列比对至动物模型基因组，以确定基因的内含子-外显子结构（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
    1. 点击小鼠选择小鼠 BLAST 基因组，在输入查询序列区域上传检索到的 FASTA 序列。在程序选择中选择优化为高度相似序列（megablast），然后点击BLAST按钮。
    2. 在描述部分，选择 Identity 最高的比对结果（最高可达 100%）。确保该结果对应于比对部分特征中所示的目标基因。
    3. 在同一部分中按查询起始位置对比对结果进行排序，以获得编码序列的外显子顺序。记录所有比对片段的起始和终止位置，这些位置大致对应于查询序列上内含子的位置（图 2A）。
  5. 为正义和反义引物选择两个不同的外显子，以便基于片段大小差异轻松区分 cDNA 与基因组 DNA（gDNA）的扩增（图 2）。
    注意：当细胞核与细胞质一同被提取时，gDNA 的扩增可能以较低频率发生。因此，必须设计跨越内含子的引物对（图 2A）。对于无内含子的基因，细胞核的收集存在问题，可能导致结果混淆。为解决此问题，应包含一组旨在扩增内含子序列的引物，用于检测 gDNA 的存在25。若基因组对照呈阳性，则所有无内含子基因的结果均应舍弃。
  6. 为实现高效扩增，应选择产生长度理想在 200 至 400 个碱基对之间的扩增子的引物（图 2）。
  7. 为在多重 PCR 步骤中同时扩增多种 cDNA，应设计长度在 18 至 24 个核苷酸之间、熔解温度（Tm）在 55 至 60 °C 之间的引物。
  8. 为最小化可能降低扩增效率的二级结构形成，应选择发夹结构和二聚体长度最小的正义和反义引物（图 2B）。
  9. 使用相同标准（步骤 2.5–2.8）设计内部引物。
  10. 通过将引物与目标生物的参考 RNA 序列数据库进行核苷酸 BLAST 比对，验证 PCR 引物的特异性。
    1. 在 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中点击核苷酸 BLAST。将引物序列粘贴至输入查询序列框中。
    2. 在选择搜索集部分，点击其他（nr 等），在数据库选项中选择参考 RNA 序列（refseq_rna），并指定生物体（例如，Mus musculus（taxid:10090)），以将分析限制在目标物种内。
    3. 在程序选择中选择优化为一定程度相似序列（blastn）。在算法参数部分将词大小降低至 7，以提高获得比对结果的概率。
  11. 为设计具有选择性的引物，应仅保留那些与非目标 cDNA 序列相比至少有 3 个错配的引物（如可能）。
  12. 订购脱盐引物时应采用相对较高的浓度（例如，200 µM），以确保所有外引物可混合至终浓度为 1 µM。

3. 反转录试剂的制备

  1. 5x RT混合液：在无RNase的水中配制400 µL的5x工作用RT混合液，其中包含25 µM的随机引物和每种2.5 mM的dNTP。将该工作混合液分装为每管20 µL，置于500 µL离心管中保存。
  2. 20x 二硫苏糖醇（DTT）：在无RNase的水中配制1 mL的0.2 M DTT溶液，并分装为每管50 µL保存。
  3. 将2,500 U的RNase抑制剂（40 U/µL）和10,000 U的逆转录酶（RTase，200 U/µL）分别分装为每管5 µL保存。
  4. 为确保RT试剂的最佳质量，将分装后的试剂保存于-80 °C。每批试剂仅用于最多10个细胞，且仅限当日使用。

4. PCR 验证

  1. 通过在感兴趣结构中提取的总RNA（通常为1 µg）上进行逆转录来制备cDNA38。
    1. 不要使用专用于单细胞RT-PCR的移液器进行这些初步步骤，而应使用无RNase的移液器。将总RNA稀释至1 µg/µL。
    2. 在500 µL PCR管中加入1 µL稀释后的总RNA和8 µL无RNase水。于95 °C变性1分钟，然后将管子置于冰上冷却。
    3. 加入4 µL厂家提供的RT 5×缓冲液、4 µL RT混合溶液、1 µL RT酶、1 µL RNase抑制剂和1 µL 200 mM DTT（见第3节）。
    4. 轻弹管子，短暂离心，然后在37 °C下孵育过夜。
    5. 将cDNA在-80 °C下保存，可保存数年。准备一份cDNA等效于1 ng/µL总RNA的稀释液备用。
  2. 使用专用于单细胞RT-PCR的移液器将每对引物混合并稀释至1 µM。每100 µL PCR反应使用20 µL引物混合液。
  3. 在冰上为每对引物配制预混液，包含：水（q.s.，80 µL）、10 µL 10×缓冲液、1 µL 100× dNTPs（各50 µM）、500–1,000 pg稀释至1 ng/µL的cDNA，以及0.5 µL Taq聚合酶（2.5 U，5 U/µL）。
  4. 使用与PCR仪孔紧密贴合的PCR管以实现最佳温度控制。向预混液中加入两滴矿物油（约100 µL），避免接触PCR管壁或管盖。
  5. 为尽量减少引物二聚体的形成，将PCR管放入已预热至95 °C的热循环仪中进行热启动。30秒后，迅速将20 µL引物混合液排入油层上方。
  6. 在95 °C下反应3分钟后，运行40个循环（95 °C，30秒；60 °C，30秒；72 °C，35秒），最后在72 °C下延伸5分钟。
  7. 通过琼脂糖凝胶电泳（2%，质量/体积）39分析每个PCR产物的10 µL。若某些PCR产物大小不符合预期，需重新设计引物（见第2节）。
    注意：溴化乙锭是一种可插入DNA并诱导突变的化学物质。使用前请咨询当地安全管理部门。操作时务必佩戴手套。为降低吸入风险，应使用市售的溴化乙锭溶液（10 mg/mL），避免使用粉末。同样，紫外线可能有害，务必佩戴防紫外线护目镜或面罩。受污染的凝胶、枪头、手套和缓冲液应投入专用于溴化乙锭废弃物的容器中。
  8. 当所有引物对均经单独验证后，测试多重PCR方案（图3）。
    1. 将所有外侧引物混合并共同稀释至1 µM。将多重引物混合液在-20 °C下保存，可保存数周。
    2. 在冰上配制预混液，包含：水（q.s.，80 µL）、10 µL 10×缓冲液、1 µL 100× dNTPs（各50 µM）、500–1,000 pg稀释至1 ng/µL的cDNA，以及0.5 µL Taq聚合酶（2.5 U，5 U/µL）。
    3. 轻弹PCR管，短暂离心，加入两滴矿物油（约100 µL）。
    4. 如步骤4.5所述进行热启动，加入20 µL多重引物混合液。在95 °C下反应3分钟后，运行20个与步骤4.6相同的PCR循环。
    5. 准备与待分析基因数量相同的PCR管。按照步骤4.8.2配制预混液，但每管以第一个PCR产物1 µL作为模板。根据待分析基因数量调整总体积，并额外增加10%体积以补偿移液误差。
    6. 轻轻混匀，短暂离心，将80 µL预混液分装至各PCR管中，每管加入两滴矿物油（约100 µL），避免接触管壁或管盖。
    7. 进行热启动（见步骤4.5），排出20 µL在步骤4.2中配制的内侧引物混合液。运行35个与步骤4.6相同的PCR循环。
    8. 通过琼脂糖凝胶电泳分析第二轮PCR产物。确保每个第二轮PCR均产生预期大小的扩增子。若扩增效率低或出现非特异性扩增，需重新设计新引物（步骤2.5–2.12）并进行验证（步骤4.2–4.8）。

5. 细胞内膜片钳溶液的配制与验证

注意：以下方案描述了基于K+/谷氨酸盐的内液的配制与验证方法，但原则上可使用任何类型的膜片钳溶液，只要其不影响RT-PCR的效率即可。为获得无RNase的内液，必须佩戴手套操作。

  1. 配制60 mL细胞内膜片钳记录液时，现配10 mL 0.1 M KOH溶液。
  2. 将11.4 mg EGTA（终浓度0.5 mM）溶解于0.9 mL 0.1 M KOH中。
  3. 加入40 mL无RNase水，溶解2.02 g K-葡萄糖酸盐（终浓度144 mM）、143 mg HEPES（终浓度10 mM）和180 µL 1 M MgCl2（终浓度3 mM）。
  4. 通过加入约6 mL 0.1 M KOH将pH值调节至7.2。
  5. 用约13 mL无RNase水将渗透压调节至295 mOsm。
  6. 由于该细胞内溶液也用作逆转录反应的缓冲液，需严格控制Mg2+浓度。若细胞内溶液中Mg2+浓度较低，后续应在逆转录反应中添加MgCl2，使终浓度达到2 mM。
  7. 为在膜片钳记录后标记收获的细胞，向上述细胞内溶液（步骤5.1–5.5）中加入2–5 mg/mL无RNase的生物胞素。
  8. 用0.22 µm孔径滤器过滤细胞内溶液，并以100–250 µL分装储存于-80 °C。
  9. 为验证该细胞内溶液是否适用于单细胞RT-PCR，将0.5 µL浓度为1 ng/µL的总RNA加入6 µL膜片钳溶液中，室温放置约30分钟。
  10. 用2 µL移液器加入2 µL 5x RT混合液、0.5 µL 20x DTT、0.5 µL RNase抑制剂和0.5 µL逆转录酶，在37 °C孵育过夜。
  11. 离心管中反应液后，冰上加入水（q.s.，80 µL）、10 µL 10X缓冲液和0.5 µL（2.5 U，5 U/µL）Taq DNA聚合酶。
  12. 使用一组已验证的引物进行40个循环的PCR扩增（见步骤4.4–4.6）。
  13. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（见步骤4.7），确认其大小符合预期。
    注意：省略0.5 µL总RNA，替换为0.5 µL无RNase水，可确保细胞内溶液无RNA和/或DNA污染。

6. 急性脑片制备

注意：本方案描述了幼年（juvenile）动物的切片步骤即，出生后28天以内的雄性和雌性小鼠。其他切割溶液，例如基于蔗糖的人工脑脊液（aCSF），也可使用40.

  1. 配制2 L人工脑脊液（aCSF），其中含有（单位为 mM）：125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 葡萄糖和15 蔗糖。为在脑片制备过程中降低谷氨酸能活性，可通过添加1 mM 犬尿酸（kynurenic acid）制备切割溶液。
  2. 在切片前，准备一套解剖工具，包括手术剪、精细虹膜剪、两把刮铲、镊子、滤纸片和氰基丙烯酸酯胶水。
  3. 使用经O2/CO2（95%/5%）饱和的冰冻切割溶液，并将切片室预冷至-20 °C。
  4. 用浸有异氟烷的小块纸巾麻醉小鼠。约2分钟后，通过检测足垫夹捏无反应确认小鼠已进入深度麻醉状态。
  5. 迅速将小鼠断头，去除头皮并打开颅骨。小心取出脑组织，放入盛有冰浴（约4 °C）且经O2/CO2氧合的切割溶液的小烧杯中。
  6. 将切片室从-20 °C环境中取出，并用纸巾擦去表面水分。
  7. 仔细解剖脑组织以分离目标区域，将其用胶水固定在切片室上，并加入经O2/CO2氧合的冰冻切割溶液。
  8. 使用振动切片机切割300 µm厚的脑片。将切好的脑片转移至室温下的孵育室中，孵育室内盛有氧合的切割溶液，使其恢复至少0.5小时。

7. 膜片钳记录后的单细胞 RT-PCR

  1. 定期使用约 100 mL 的 30% H2O2 溶液清洗灌流系统，并用约 500 mL 蒸馏水充分冲洗，以防止细菌生长，因为这是常被忽视的 RNase 污染来源。
  2. 每次收获细胞时，使用装有浓漂白剂的膜片钳电极对电极丝进行氯化处理。不要使用移液器填充膜片钳电极，而应使用连接在 1 mL 注射器上的 20 µL 长、细且柔韧的吸头。随后，用无 RNase 水充分冲洗，并用气体除尘器干燥。
  3. 准备一个装有冰的小盒子，内含 5x RT-混合液和 20x DTT 分装液。将 RTase 和 RNase 抑制剂分装液储存在台式冷却器中的 -20 °C 条件下。
  4. 将脑片转移至以 1–2 mL/min 速度灌流含氧 aCSF 的记录室中。
  5. 佩戴手套后，从硼硅酸盐玻璃毛细管拉制膜片钳电极（敞口端直径 1–2 µm，电阻 3–5 MΩ），并用 8 μL 内液填充其中一支。请注意，电极拉制仪的旋钮可能是 RNase 污染的来源。
  6. 佩戴新手套，将电极装入电极夹持器中，避免手指接触电极丝。
  7. 以正压推进膜片钳电极，进行全细胞记录以表征目标细胞（图 4）。
  8. 为保护 mRNA，应将全细胞记录配置下的时间限制在 20 分钟以内41。
  9. 记录结束后，准备一个含有 2 µL 5x RT 混合液和 0.5 µL 20x DTT 的 500 µL PCR 管，短暂离心后置于冰上保存。
  10. 通过施加轻柔的负压收集细胞质（图 4）。在保持紧密封接的同时，目视确认细胞内容物已进入电极内。
    1. 若关注无内含子基因，应尽可能避免收集细胞核。在此情况下，务必包含一组用于扩增基因组 DNA 的引物，以检测是否存在基因组污染。
    2. 若细胞核接近电极尖端，应释放负压并将电极移离细胞核。确保紧密封接仍保持完好，并在新的电极位置重新开始收集细胞质。
  11. 当无更多物质进入电极或在失去紧密封接前，停止收集。
  12. 轻柔撤回电极以形成外翻膜片，从而减少细胞外碎片的污染（图 4），并有利于细胞膜闭合，便于后续组织化学分析。
  13. 请注意，旋钮、微操纵器、计算机键盘或鼠标均可能成为 RNase 污染源。若在记录过程中触碰过这些物品，应更换手套。
  14. 将电极连接至排液装置，通过施加正压将内容物排入 PCR 管中（图 1）。
  15. 将电极尖端折断于 PCR 管内，以帮助完全收集其内容物。
  16. 短暂离心管子，加入 0.5 µL RNase 抑制剂和 0.5 µL RTase，轻轻混匀后再次离心，并在 37 °C 下孵育过夜。
  17. 离心后，将样品在 -80 °C 保存数月，直至进行 PCR 分析。
  18. 直接在含有约 10 µL RT 产物的管中进行第一轮扩增：加入水（q.s. 至 80 µL）、10 µL 10x 缓冲液和 0.5 µL（2.5 U）Taq 聚合酶。随后按照步骤 4.8.2–4.8.8 所述操作进行。

8. 已记录细胞的组织化学染色（可选）

  1. 电生理记录完成后，将脑片置于充氧的人工脑脊液（aCSF）中孵育20分钟，以促进生物胞素在轴突和树突中的扩散。
  2. 将脑片放入24孔板的一个孔中，加入1 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液，在4 °C下固定过夜。
  3. 用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗脑片4次，每次5分钟。
  4. 在同一孔中，加入1 mL含0.25% Triton X-100和0.2%冷水鱼皮明胶的磷酸盐缓冲液（PBS-GT），在室温下孵育1小时，以进行透化和封闭。
  5. 加入250–500 µL PBS-GT稀释的荧光标记亲和素（1:400），在4 °C下孵育过夜。
  6. 用1 mL PBS清洗5次，每次5分钟，随后将脑片贴片封片。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多重RT-PCR的代表性验证结果如图3所示。该实验方案旨在同时检测12个不同基因的表达。囊泡型谷氨酸转运蛋白vGluT1被用作谷氨酸能神经元的阳性对照42。GABA合成酶（GAD65和GAD67）、神经肽Y（NPY）以及生长抑素（SOM）被用作GABA能中间神经元的标志物3,5,11。环氧化酶-2（COX-2）被用作锥体细胞亚群的标志物3,16。

选择Na+/K+ ATP酶的ATP1α1-3亚基以及AT...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在膜片钳记录后进行单细胞多重RT-PCR，可同时且可靠地检测电生理学鉴定细胞中超过30个基因的表达5。在单细胞水平上分析基因表达需要高效能的PCR引物。其中最关键的限制步骤之一是细胞内容物的收集。其效率取决于膜片钳电极尖端的直径，该直径应尽可能大，同时与细胞大小相匹配。研究表明，尖端开口直径为1–2 µm的电极适用于大多数类型的神经元。还必须确保仅收集细胞内容物，而不混入周围组织。这可通过电生理手段监控采集过程中紧密封接的维持情况来实现。在撤回电极时形成外向-out膜片构型，可进一步保护所采集的细胞质免受细胞碎片污染。单细胞多重RT-PCR的成功率还取决于目标细胞类型中mRNA的丰度。例如，星形胶质细胞的mRNA表达量相对较低3，因此从中获得的产物量通常低于神经元，需增加样本数量以补偿15,16。逆转录反应在离心管中的效率较低48，是单细胞多重RT-PCR的限速步骤。因此，使用高...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Alexandre Mourot 博士对本文手稿的评论。本工作得到了法国国家研究署（ANR 2011 MALZ 003 01；ANR-15-CE16-0010 和 ANR-17-CE37-0010-03）的资助；BLG 得到了阿尔茨海默病研究基金会博士后奖学金的支持。感谢 IBPS 动物实验中心（法国巴黎）提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MACAW v.2.0.5NCBI用于引物设计的多序列比对
二硫苏糖醇VWR443852ART
随机引物Sigma-Aldrich（默克）11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52逆转录与聚合酶链式反应
RNasin 核糖核酸酶抑制剂PromegaN2511RT
SuperScript II 逆转录酶Invitrogen18064014RT
Taq DNA聚合酶Qiagen201205PCR
矿物油Sigma-Aldrich（默克）M5904-5MLPCR
PCR 引物Sigma-Aldrich（默克）PCR / 脱盐并稀释至200 µM
0.5 mL平盖管赛默飞世尔科技AB0350逆转录与聚合酶链式反应
BT10 系列 - 10 µL滤芯吸头Neptune ScientificBT10逆转录与聚合酶链式反应
BT20 系列 - 20 µL滤芯吸头Neptune ScientificBT20逆转录与聚合酶链式反应
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溴化乙锭Sigma-Aldrich（默克）E1510-10ML琼脂糖凝胶电泳
Tris-硼酸-EDTA缓冲液Sigma-Aldrich（默克）T4415-1L琼脂糖凝胶电泳
UltraPure 琼脂糖Life Technologies16500-500琼脂糖凝胶电泳
ΦX174 DNA-Hae III 酶切NEB（New England BioLabs）N3026S琼脂糖凝胶电泳
EDA 290柯达琼脂糖凝胶电泳
电泳电源 EPS 3500Pharmacia Biotech琼脂糖凝胶电泳
中型水平电泳仪型号 SHU13Sigma-Aldrich（默克）琼脂糖凝胶电泳
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氢氧化钾Sigma-Aldrich（默克）60377膜片钳内液
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犬尿喹啉酸Sigma-Aldrich（默克）K3375切片制备
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24孔板Greiner Bio-One662160组织化学显色

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