利用微呼吸分析和显微解剖技术研究冬孢子萌发

摘要

黑粉菌会引起多种严重的农业病害。它们以休眠的冬孢子形式传播，这些冬孢子会响应环境信号而萌发。我们概述了两种研究萌发过程中分子变化的方法：通过测量呼吸作用的增强来检测代谢活化，以及通过在不同形态发育阶段分离冬孢子来评估分子事件的动态变化。

摘要

黑粉菌是多种毁灭性农业病害的病原体。其特征是产生厚壁的传播体——冬孢子。冬孢子可休眠数十年之久。休眠状态表现为代谢率极低、大分子生物合成停滞以及呼吸作用显著减弱。当接收到适当的环境信号后，冬孢子萌发产生单倍体细胞，从而启动新一轮侵染。冬孢子的萌发过程以大分子生物合成的恢复、呼吸作用增强以及显著的形态学变化为特征。为了精确测量萌发早期阶段细胞呼吸的变化，我们建立了一种使用克拉克型呼吸仪的简单实验方案。萌发的后期阶段具有特定的形态变化特征，但萌发过程是不同步的。我们开发了一种显微解剖技术，能够分离并收集处于不同萌发阶段的冬孢子。

引言

黑粉菌目（Ustilaginales）包含超过1600种真菌，可侵染禾本科植物，包括玉米、大麦和小麦等重要谷类作物，每年造成数十亿美元的农作物损失¹。这类真菌的特征是产生担孢子（teliospores），其细胞壁具有深色色素，是病原体的传播载体。担孢子可在寄主植物间传播过程中保护遗传物质，抵御各种环境胁迫，并能以休眠状态长期存活数年之久²。因此，担孢子是病害扩散的关键组成部分。

为了研究冬孢子生物学，本实验室采用模式黑粉菌真菌 Ustilago maydis (U. maydis），它是玉米黑粉病的致病因子。成熟 U. maydis 休眠孢子的特征是生长停滞、细胞代谢降低以及细胞呼吸水平低下³. 在适宜的环境条件下（例如，特定糖类的存在）， U. maydis 担孢子萌发并完成减数分裂，产生可启动新一轮感染的担孢子。萌发的特征包括呼吸作用增强、代谢活性恢复，以及经历可观察到的萌发形态学阶段的进程⁴.

萌发的初始阶段包括呼吸作用和代谢功能的增强，然而尚无形态学上的变化迹象。关于呼吸变化的最初测量数据 U. maydis 50 多年前进行的实验，使用沃堡呼吸计装置通过测压法测量氧气消耗量⁵我们开发了一种新的简易方法，通过使用克拉克型微呼吸仪在担孢子萌发的时间过程中测定氧气消耗量，以研究萌发期间呼吸作用的精确变化。我们此前已采用该方法研究了野生型之间呼吸速率的变化。 U. maydis 单倍体细胞及线粒体功能缺陷的突变体⁶，并在此调整了该方案以研究冬孢子萌发过程中呼吸作用的变化。这为我们准确识别呼吸变化的时间点提供了手段，从而能够在萌发启动后的适当时机靶向冬孢子，以探究早期分子事件。一旦原菌丝从冬孢子中伸出，即可通过显微镜观察萌发进程，但由于其异步性，难以在特定阶段获得足够数量的冬孢子用于研究。我们开发了一种显微解剖技术，类似于此前用于 体外 从受精到在不同形态发育阶段物理收集担孢子。

方案

1. 玉米穗感染

1. 培养 玉米（Zea mays） (cv. Golden Bantam) 至果穗形成并开始吐丝（约60天）。
2. 与培养兼容的单倍体 U. maydis 使用先前所述的标准方案对菌株进行处理⁷.
3. 使用先前所述的标准方案感染玉米穗⁷.

2. 冬孢子采集

1. 使用标准干热灭菌程序对设备（布氏漏斗、布氏烧瓶、匀浆器、250 mL 离心瓶、平头刮刀和水）进行高压灭菌，在 121 °C 下至少灭菌 30 分钟（水采用标准液体灭菌程序）。
2. 使用剃刀从植株上取下被感染的玉米穗（接种后约 28–35 天），并将玉米穗放置在铺有实验台保护垫的托盘上。
3. 用剃刀片将玉米穗上的肿瘤组织切除，并收集至烧杯中。
4. 将肿瘤组织加入 250 mL 实验室匀浆杯中，至约 1/3 满，然后加入已灭菌的 dH₂O 至匀浆杯约 3/4 满。以低速脉冲方式启动匀浆器，直至组织完全匀浆。
5. 将真空泵连接至水分捕集器，再连接至 1 L 布氏烧瓶。
6. 将大号布氏漏斗插入烧瓶中，并在布氏漏斗底部铺四层纱布。
7. 开启真空泵。
8. 将部分匀浆后的肿瘤组织倒入纱布中，并用刮刀刮取残留物。
9. 向纱布中加入少量 dH₂O，以冲洗出担孢子。
10. 重复此步骤，直至穿过滤布的 dH₂O 变为澄清。
11. 将含有匀浆肿瘤材料的纱布拧干，确保最大程度回收担孢子。
12. 当 1 L 布氏烧瓶接近装满时，将其内容物倒入一个大锥形瓶中并暂置一旁。
13. 在过滤装置中更换新的纱布，重复步骤（2.7–2.12），直至所有肿瘤组织均被破碎并过滤完毕。
14. 将过滤后的担孢子倒入已灭菌的 250 mL 离心瓶中，在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
15. 重复步骤 2.14，直至所有过滤后的担孢子均通过离心形成沉淀。
16. 用少量水重悬沉淀物，并转移至 50 mL 离心管中。
17. 在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
18. 用约 50 mL 的 dH₂O 重悬沉淀物，在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用刮刀轻轻刮除表面的灰色上层物质并丢弃。重复该步骤，直至不再出现灰色表层。
19. 将样品在真空干燥器中过夜干燥。
20. 将干燥的担孢子储存于 4 °C，待用。
21. 如需要，可在诱导萌发前用硫酸铜⁸处理担孢子。若不进行处理，则需对担孢子进行彻底的显微镜检查，以确认样品为纯担孢子，且无细菌或其他污染物。
    1. 称取约 50 mg 担孢子置于 1.5 mL 微量离心管中。
    2. 向含有担孢子的 1.5 mL 微量离心管中加入约 1.0 mL 的 0.75% CuSO₄ 溶液。用移液器反复吹打使担孢子充分悬浮于 CuSO₄ 溶液中，随后震荡样品 3 小时。
    3. 在 2,500 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用无菌水重悬担孢子沉淀，重复离心后弃去上清液。
    4. 重复步骤 2.21.3 两次。

3. 冬孢子活力与萌发试验

1. 称取约 10 mg 的 U. maydis 冬孢子至 1.5 mL 微量离心管中，用于评估其活力及萌发时间。
2. 在生物安全柜中，配制添加硫酸链霉素（160 µg/mL）的马铃薯葡萄糖肉汤（PDB，24 g/L）。
3. 将冬孢子悬浮于 500 µL PDB 中，轻轻吹打混匀，彻底分散所有冬孢子团块。
4. 将冬孢子悬浮液转移至含有 10 mL PDB 的已灭菌 250 mL 锥形瓶中。
5. 将锥形瓶置于 28 °C、12–16 h 摇床振荡培养，转速为 90 rpm。
6. 在生物安全柜中，取 20 µL 诱导萌发的冬孢子样品，制备显微镜玻片。
7. 使用显微镜观察存在的萌发阶段以及是否存在细菌污染。
   1. 使用血细胞计数板统计处于 I 至 V 阶段的冬孢子数量，并计算已萌发冬孢子的百分比。
   2. 若仅观察到 I 阶段的冬孢子，则继续培养至总时长 24 h 后再次评估萌发情况；若培养时间最长达 48 h 仍无萌发，则判定该样品无活力。
   3. 若存在细菌污染，需在 PDB 中同时添加硫酸卡那霉素（50 µg/mL）和硫酸链霉素（160 µg/mL），然后重复步骤 3.1 至 3.7；若细菌污染持续存在，应对冬孢子进行硫酸铜处理，并重复步骤 3.1 至 3.7。

4. 呼吸监测的萌发诱导

1. 称取等量（例如，50 mg）的冬孢子用于每项呼吸作用实验。
2. 在生物安全柜中，将冬孢子加入已灭菌的呼吸室中。
3. 向呼吸室中加入补充有硫酸链霉素（160 µg/mL）和硫酸卡那霉素（50 µg/mL）的PDB培养基（24 g/L）。
4. 反复吹打以制成冬孢子悬浮液。
5. 将呼吸室盖子盖上，确保形成密闭密封。

5. 获取氧消耗率（OCR）测量值

1. 将腔室放置于水浴中的腔室架内（预热至 28 °C）。
2. 将 O₂ 探头置于腔室的开口中。
3. 在 "SensorTrace Rate" 程序中实时监测数据点，并让探头稳定（探头放入腔室后约 3 分钟）。
4. 点击 "Measure"，以每 2 秒记录一次的频率连续测量 O₂ 水平，持续 6 小时。
5. 停止测量，并对每个待分析样品重复步骤 4.1–5.4。
6. 通过点击 "File | Export | Save as .xls" 将数据导出至 Microsoft Excel。

6. 数据分析

1. 计算 OCR
   1. 导出的 Excel 文件中，位于 "在速率范围内" 标签，记录 "速率" 每个腔室测量值（nmol/h）。
   2. 对于每个实验样本，减去 "速率" 空白室的 "速率" 校正实验样品室的OCR值，并取该数值的绝对值。
   3. 通过将校正后的绝对OCR值除以所用的孢子质量（mg），计算每毫克冬孢子的总OCR。
   4. 平均重复 "每毫克冬孢子的OCR值" 每种菌株的数值。
2. 使用适当的统计方法分析数据例如，学生的 t使用 Microsoft Excel 或其他统计软件进行 t 检验、方差分析。
3. 绘制原始数据时，计算每个需要绘图的时间点所对应的剩余氧气百分比。将第一个读数除以自身再乘以100（即剩余氧气100%），然后将后续每个读数除以第一个读数，再乘以100，得到腔室内剩余氧气的百分比。

7. 诱导冬孢子萌发以分离处于不同萌发阶段的冬孢子

1. 在生物安全柜中配制含硫酸链霉素（160 µg/mL）的PDB（24 g/L）。
2. 放置约 10 mg 的 U. maydis 将担孢子放入1.5 mL微量离心管中。
3. 将冬孢子悬浮于500 µL PDB培养基中，轻轻吹打混匀，直至培养基中无冬孢子团块。
4. 将冬孢子悬液转移至含有添加链霉素硫酸盐的PDB的灭菌250 mL锥形瓶中。
5. 28 °C、90 rpm 振荡过夜培养。

8. 培养皿和显微操作仪的准备

1. 准备一个培养皿（57 cm²），通过移液形成液滴排，用于微毛细管制备和样品收集。
   1. 在培养皿顶部加入 5 µL（×4）去离子水（dH₂O）液滴。
   2. 在培养皿中加入 2 µL（×3）RNA稳定溶液，用于样品收集。
   3. 在培养皿中加入 5 µL（×30）萌发的冬孢子液滴。
2. 向培养皿中加入 15 mL 矿物油。确保所有液滴均被油覆盖后，再进行下一步操作。
3. 取一根内径为 15 µm、法兰直径为 1 mm、长度为 55 mm、尖端角度为 20° 的微毛细管，将其放入微毛细管 holder 中，并浸入矿物油中，使毛细作用引导矿物油进入微毛细管内部。在将微毛细管移至水滴前，释放其内部压力，然后进行吸液操作，用水预处理微毛细管。

9. 特定发育阶段萌发冬孢子的分离

1. 使用显微操作仪的控制装置，将制备好的微毛细管移至其中一个萌发液滴。穿入液滴，降低微毛细管，使微毛细管口接近处于目标萌发阶段的冬孢子。
2. 缓慢抽吸以捕获正在萌发的冬孢子。当冬孢子完全进入微毛细管后停止抽吸。重复此操作，直至微毛细管中收集约五个冬孢子。
3. 使用显微操作仪将含有冬孢子的微毛细管提起，并移至RNA稳定化溶液的收集液滴。穿入液滴后，将冬孢子注入其中。
4. 重复步骤8.1至8.3，直至总共捕获约1,000个冬孢子。

10. 收集液滴的回收

1. 用移液器吸取收集液滴，并将其转移至无RNase/DNase的2.0 mL微量离心管盖中。用移液器小心去除矿物油，注意不要扰动收集的液滴。
2. 将冬孢子用于后续应用，如RNA提取。

结果

利用基于克拉克型微呼吸计的方法检测冬孢子休眠和萌发过程中呼吸作用的变化，我们证实休眠态冬孢子的呼吸水平较低（约1,075 µmol/h/mg），而萌发中的冬孢子呼吸水平较高（约2,614 µmol/h/mg；图1A）。这表明休眠冬孢子与诱导萌发的冬孢子之间的平均呼吸速率相差约2.4倍。此外，我们发现被诱导萌发的冬孢子在氧气吸收上存在约45分钟的延迟（图1B）。该延迟包括氧气吸收本身约30分钟的滞后（图1B），以及诱导萌发与开始氧气测定之间约15分钟的时间差。这一时间点可用于起始评估那些尚未表现出可见形态变化的萌发中冬孢子的分子变化。

萌发过程中的后续变化可通过显微镜观察。我们确定了萌发的五个阶段。萌发I期代表已被诱导萌发但形态上仍与休眠担孢子无法区分的担孢子。II期担孢子已长...

讨论

担子菌门中的专性寄生植物病原菌每年造成数十亿美元的农作物损失。这些病原菌中的绝大多数能够产生担孢子，该孢子在真菌的传播和有性生殖过程中起着关键作用。深入了解担孢子的发育与萌发过程，对于理解这些真菌所引发的毁灭性病害的传播机制至关重要。为了鉴定关键调控节点处的分子变化，我们设计了一种方法用于确定生理转变发生的时间点，另一种方法用于分离处于不同萌发阶段的担孢子。Seto 等 （未发表）通过光学显微镜观察到担孢子萌发的五个阶段图2）。为了研究第一阶段的生理激活情况并评估萌发过程中的呼吸速率，我们采用克拉克型微呼吸计精确测量氧气消耗量的变化。我们的样本数据表明，该方法精确且具有高度可重复性。研究结果证实，萌发中的 U. maydis 休眠孢子在诱导后其细胞呼吸作用相较于未诱导的休眠孢子显著增强。我们首次发现 U. maydis 萌发诱导后的冬孢子在氧气吸收上表现出约45分钟的延迟。这表明 U. maydis 休眠孢子可能需要一定时间来处理萌发信号（例如，糖类的存在）后才作出响应，因此耗氧...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸链霉素	BioShop	STP101
硫酸卡那霉素	BioShop	KAN201
马铃薯葡萄糖肉汤	BD Difco	254920
1 L Waring 实验室搅拌器	Waring	7011S
纱布	VWR	470150-438
带活塞的Nalgene聚丙烯干燥器	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration 系统
微呼吸传感器（O2）	Unisense	OX10
MicroOptode 计量放大器	Unisense	N/A
MR-Ch 小型装置	Unisense	MR-Ch
SensorTrace Rate 软件	Unisense	N/A
微呼吸支架	Unisense	MR2-Rack
微呼吸搅拌器	Unisense	MR2-Co
显微解剖系统
Axio Vert.A1 倒置光学显微镜	Zeiss
粗调操纵器	Narishige	MMN-1
三轴悬挂式液压微操纵器	Narishige	MMO-202ND
气动微量注射器	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004