利用 Microrespiration 分析和显微解剖研究 Teliospore 萌发

摘要

黑穗病真菌引起许多破坏性的农业病害。它们被分散为休眠冬孢子, 在响应环境提示时发芽。我们概述了两种方法来研究发芽过程中的分子变化: 测量呼吸增加, 以检测代谢活化和评估变化的分子事件通过隔离冬孢子在不同的形态学阶段。

摘要

黑穗病真菌是几种破坏性农业病害的致病因子。它们的特点是冬孢子的生产, 这是厚壁分散剂。冬孢子可以保持休眠数十年。休眠的特点是低代谢率, 暂停大分子生物合成和大大降低呼吸水平。在接收到所需的环境信号后, 冬孢子发芽产生单倍体细胞, 这会引发新一轮的感染。Teliospore 萌发的特点是恢复大分子生物合成, 增加呼吸和戏剧性的形态学变化。为了精确测量发芽初期细胞呼吸的变化, 我们开发了一种使用克拉克型呼吸的简单协议。发芽的后期阶段是由特定的形态学变化来区分的, 但发芽是异步的。我们开发了一种显微切割技术, 使我们能够收集冬孢子在不同的发芽阶段。

引言

黑穗病真菌 (Ustilaginales) 由1600多个物种组成, 其中包括玉米、大麦和小麦等重要谷物作物, 每年造成的农作物损失数以亿计.¹。这些真菌的特点是冬孢子的生产, 其中有黑暗的色素细胞壁和分散剂。冬孢子在寄主植物间分散的压力下保护遗传物质的作用, 并且可以在休眠状态持续多年 2.因此, 冬孢子是疾病传播的一个重要组成部分。

为了研究 teliospore 生物学, 我们的实验室利用了黑穗病真菌黑穗病玉米(U 玉米), 这是该病 "玉米常见黑穗病" 的因果动因。成熟的U. 玉米冬孢子的特点是生长骤停, 细胞代谢减少, 细胞呼吸的水平低 3.在有利的环境条件下 (e. g., 特定糖的存在), U. 玉米冬孢子发芽和完全减数分裂, 产生 basidiospores, 可引发新一轮的感染。发芽的特点是增加的呼吸, 恢复代谢活动, 并通过可见的形态学阶段的发芽⁴的进展。

发芽的初始阶段包括增加的呼吸和新陈代谢功能, 但是, 没有形态学的变化迹象。最初测量的呼吸变化在U. 玉米是50年前进行的, 测量耗氧量 manometrically 与华宝瓶设备⁵。我们开发了一种新的, 简单的方法来研究在 teliospore 发芽过程中的呼吸的精确变化, 用克拉克型 microrespirometer 测量在发芽的时间过程中的耗氧量。我们以前使用这种方法来研究野生型U. 玉米单倍体细胞和突变体与缺陷线粒体⁶之间呼吸速率的变化, 并在这里修改了该协议来研究 teliospore 呼吸过程中的变化。萌发。这为准确确定呼吸变化的时间提供了一种方法, 以便我们能够在发芽开始后适当的时间针对冬孢子进行研究, 以调查早期的分子事件。一旦 promycelia 从 teliospore 出现, 就可以微观地观察萌发过程, 但异步性质抑制了在特定阶段对足够冬孢子的隔离, 以供调查。我们开发了一种类似于体外受精的显微切割技术, 用于在不同形态的萌发阶段物理地收集冬孢子。

方案

1. 玉米芯感染

1. 种植玉米玉蜀黍(cv 金矮脚鸡), 直到棒子形成, 并开始丝绸 (约60天)。
2. 与以前描述的⁷使用标准协议的区域性兼容的单倍体U. 玉米菌株。
3. 使用以前描述的⁷标准协议感染玉米棒子。

2. Teliospore 收获

1. 蒸压设备 (Büchner 漏斗, Büchner 烧瓶, 搅拌器, 250 毫升离心瓶, 扁平铲子, 和水) 使用标准的干燥循环, 至少30分钟的灭菌121摄氏度 (水的标准液体循环)。
2. 使用剃刀将受感染的棒子从植物中取出 (大约28–35天后感染), 并将棒子放在工作台保护罩上的托盘上。
3. 用剃刀刀片从棒子上取出肿瘤, 然后在烧杯中采集。
4. 填充250毫升实验室搅拌器杯与肿瘤, 直到大约1/3 满, 并添加蒸压 dH₂O, 直到搅拌机杯约3/4 满。通过在低的搅拌机中脉冲来扰乱肿瘤, 直到均匀。
5. 将真空泵连接到一个疏水器, 然后再用1升 Büchner 瓶。
6. 将大型 Büchner 漏斗插入瓶中, 并在 Büchner 漏斗底部排上四层棉布。
7. 打开真空泵。
8. 将匀质肿瘤的一部分倒入棉布, 用刮刀刮。
9. 将一些 dH₂O 倒入棉布中, 以刷新冬孢子。
10. 重复直到通过棉布的 dH₂O 是清楚的。
11. 将含有匀质肿瘤材料的棉布拧出过滤器, 以确保最大 teliospore 回收率。
12. 当1升 Büchner 瓶接近满, 清空它成一个大的锥形瓶, 并把它放在一边。
13. 将新的棉布放入过滤器中, 重复步骤 (2.7–2.12), 直到所有肿瘤被破坏和过滤。
14. 将过滤后的冬孢子倒入蒸压250毫升离心机瓶和离心机, 1000 x 克5分钟, 醒酒上清。
15. 重复步骤 2.14, 直到所有的过滤冬孢子被离心颗粒化。
16. 将小球悬浮在少量的水中, 转移到50毫升离心管。
17. 离心管在 1000 x g 5 分钟, 醒酒上清。
18. 将颗粒悬浮在大约50毫升的 dH 中₂O, 离心管在 1000 x g 处为5分钟, 醒酒上清。用刮刀轻轻刮掉灰色的顶层, 然后把它扔掉。重复, 直到上面不再有灰色图层。
19. 用真空干燥在一夜之间干燥样品。
20. 将干燥的冬孢子在4摄氏度, 直到使用。
21. 如果需要, 在诱导发芽前用硫酸铜⁸治疗冬孢子。如果不治疗, 则对冬孢子进行彻底的显微分析, 以确认样品代表纯冬孢子, 缺乏细菌或其他污染物。
    1. 在1.5 毫升离心管中称量约50毫克的冬孢子。
    2. 将大约1.0 毫升0.75% 丘索₄添加到包含冬孢子的1.5 毫升离心管中。吸管向上和向下悬浮在丘索₄解决方案中的冬孢子, 然后将该样本搅拌3小时。
    3. 将样品离心 2500 x 克5分钟, 取出上清液。用无菌水并用重悬 teliospore 颗粒, 重复离心, 取出上清液。
    4. 重复步骤2.21.3 两次。

3. Teliospore 活力和发芽试验

1. 在1.5 毫升离心管中称量出大约10毫克的玉米冬孢子, 以评估它们的生存能力和发芽时间。
2. 在生物安全柜中, 制备马铃薯葡萄糖汤 (PDB, 24 克/升), 辅以硫酸链霉素 (160 µg/毫升)。
3. 在 PDB 的500µL 中暂停冬孢子。轻轻的吸管, 混合和打破所有的冬孢子团簇。
4. 将 teliospore 悬浮液转移到含10毫升 PDB 的蒸压250毫升锥形烧瓶中。
5. 孵化的烧瓶在28°c 颤抖在 90 rpm 为 12–16 h。
6. 在生物安全柜中, 取出20µL 样品, 冬孢子诱导发芽并准备显微镜滑动。
7. 使用显微镜, 直观地评估存在的发芽阶段和细菌污染的存在。
   1. 使用 hemocytometer 计算第一阶段冬孢子的数量, 并确定发芽的百分比。
   2. 如果只有一级冬孢子存在, 在评估 teliospore 发芽之前, 继续孵化24小时的烧瓶。在认定样品不可行之前, 继续孵化48小时。
   3. 如果细菌污染存在, 补充 PDB 硫酸卡那霉素 (50 µg/毫升) 以及硫酸链霉素 (160 µg/毫升), 然后重复步骤3.1 到3.7。如果细菌污染持续, 用硫酸铜治疗冬孢子, 重复步骤3.1 至3.7。

4. 呼吸监测的发芽诱导

1. 对每种呼吸实验的冬孢子量相等 (e.g, 50 毫克)。
2. 在生物安全柜中, 将冬孢子添加到蒸压呼吸室。
3. 用 PDB (24 克/升) 补充硫酸链霉素 (160 µg/毫升) 和硫酸卡那霉素 (50 µg/毫升) 填充腔室。
4. 吸管向上和向下创建 teliospore 悬浮。
5. 将室盖放在会议厅内, 以制造空气密封。

5. 获得氧气消耗率 (OCR) 测量

1. 安置房间在房间架子在水浴之内 (预热到28°c)。
2. 将 O₂探头置于会议厅的开口内。
3. 监视实时显示在 "SensorTrace 速率" 程序上的数据点, 并让探头稳定 (在探头放置在腔室中3分钟)。
4. 单击 "度量值" 以连续6小时测量 O₂级别, 并以2秒为间隔记录测量值。
5. 停止测量, 并对每个要分析的示例重复步骤4.1–5.4。
6. 通过单击 "文件 |" 将数据导出到 Microsoft Excel 中出口 |另存为. xls "。

6. 数据分析

1. 计算 OCR
   1. 在 "Within_Rates" 选项卡下的导出的 Excel 文件中, 记录每个分庭测量的 "速率" (nmol/小时)。
   2. 对于每个实验样本, 从实验样品室的 "速率" 中减去空白腔的 "速率" 以获得修正的 OCR 值, 并取该数字的绝对值。
   3. 计算每毫克冬孢子的总 ocr, 方法是用所用的细胞质量除以校正后的绝对 ocr 值。
   4. 每个应变的平均复制 "每毫克冬孢子的 OCR" 值。
2. 使用其他统计软件的 Microsoft Excel, 使用适当的统计方法 (e. g、学生的t测试、方差分析) 分析数据。
3. 若要绘制原始数据, 请计算要绘制的每个时间点的剩余氧气百分比。先将自己的读数除以 100 (剩余的100% 氧气), 然后除以一读后的每一次读数, 乘以 100, 以获得腔内剩余氧气的百分比。

7. 诱导 Teliospore 萌发分离冬孢子在萌发的不同阶段

1. 准备 PDB (24 克/升) 在生物安全柜中辅以硫酸链霉素 (160 µg/毫升)。
2. 将大约10毫克的U 玉米冬孢子放入1.5 毫升离心管中。
3. 在 PDB 的500µL 中暂停冬孢子。轻轻吸管混合, 直到没有在培养基中的冬孢子团簇。
4. 将 teliospore 悬浮液转移到含 PDB 的蒸压250毫升锥形烧瓶中, 并用硫酸链霉素补充。
5. 在90转每分钟28摄氏度的抖动中孵化烧瓶。

8. 培养皿和机器人的制备

1. 通过吹打排的水滴进行 microcapillary 准备和样品收集, 准备一个培养皿 (57 厘米²)。
   1. 吸管5µL (x4) dH₂O 滴横跨培养皿的顶部。
   2. 吸管2µL (x3) 的 RNA 稳定溶液在培养皿用于标本收集。
   3. 吸管5µL (x30) 在培养皿上萌发冬孢子的水滴。
2. 在培养皿中加入15毫升矿物油。在继续之前, 确保所有的水滴都被油覆盖。
3. 准备一个具有15µm 内径, 1 毫米法兰, 55 毫米长度的 microcapillary, 并把它放在 microcapillary 持有者, 并将其浸入矿物油中, 毛细管作用将允许矿物油进入 microcapillary。在把 microcapillary 的压力放到水滴之前, 先释放它。吸水准备 microcapillary。

9. 特定阶段萌发冬孢子的分离

1. 使用机器人的控制, 将准备好的 microcapillary 移动到其中一个发芽水滴。穿透液滴, 降低 microcapillary, 并使 microcapillary 的嘴在萌发的过程中发芽 teliospore。
2. 慢慢地吸入捕捉发芽的 teliospore。一旦 teliospore 进入 microcapillary, 停止吸气。重复, 直到有大约五冬孢子在 microcapillary。
3. 用机器人提高 microcapillary, 并将其带到 RNA 稳定溶液的收集液滴上。穿透液滴并将冬孢子注入液滴中。
4. 重复步骤8.1 到 8.3, 直到捕获了大约1000冬孢子。

10. 回收液滴

1. 将收集液滴吸干并将其转移到 RNase/DNase 2.0 毫升离心管的盖子上。小心地用吸管除去矿物油而不干扰收集液滴。
2. 将冬孢子用于下游应用程序, 如 RNA 隔离。

结果

利用克拉克型 microrespirometer 测量 teliospore 休眠和萌发过程中呼吸变化的方法, 我们证实休眠冬孢子与发芽相比具有低呼吸水平 (约1075µmol/小时/毫克)冬孢子 (2614 µmol/小时/毫克;图 1A)。这表示休眠冬孢子和冬孢子诱导发芽的平均呼吸速率有2.4 倍的变化。此外, 我们还发现, 诱导发芽的冬孢子在吸氧量上有45分钟的延迟 (图1B)。这是由30分钟的氧摄取延迟 (图 1B) 所示, 除了诱导发芽和氧气测量开始之间的 ~ 15 分钟的延迟。这确定了一个时间点开始评估的冬孢子发芽的分子变化, 没有明显变化。

在发芽过程中的后续变化可以显微镜观察。确定了发芽的五阶段。萌芽期的第一阶段代表冬孢子诱导发芽, 但仍与休眠冬孢子无法区分。...

讨论

担子 biotrophic 植物病原体每年造成数以亿计的农作物损失。绝大多数这些病原体产生冬孢子, 是真菌散布和性繁殖不可分割的组成部分。了解冬孢子的发展和发芽对理解这些真菌造成的破坏性疾病的传播至关重要。为了识别关键控制点的分子变化, 我们设计了一种方法来确定生理移位的时间, 另一种是在萌发的不同阶段分离冬孢子。et 等。(未发表) 注意到 teliospore 萌发的五个阶段的光显微术 (图 2)。为了研究 i. 期的生理活化, 并对发芽过程中呼吸速率进行评估, 我们用克拉克型 microrespirometer 精确测量了氧消耗的变化。我们的样本数据表明, 我们的方法是精确和高度重现性。我们的发现证实, 发芽的U. 玉米冬孢子与未诱导的休眠冬孢子相比, 细胞呼吸的急剧增加。我们首次发现, 被诱导发芽的U. 玉米冬孢子在吸氧量上的延迟为45分钟。这表明,玉米冬孢子可能需要一些时间来处理发芽信号 (e.g), 在反应之前, 增加的吸氧量不是对发芽信号的立即反应, 也不是我们的化验不够灵敏...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸链霉素	BioShop	STP101
硫酸卡那霉素	BioShop	KAN201
马铃薯葡萄糖汤	BD Difco	254920
1 L Waring 实验室搅拌机	Waring	7011S
粗棉布	VWR	470150-438
Nalgene 聚丙烯干燥器，带旋塞阀	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration 传感器 （O2）	Unisense	OX10
MicroOptode 仪表放大器	Unisense	N/A
MR-CH 小型	Unisense	MR-Ch
传感器跟踪率软件	Unisense	N/A
微呼吸架	Unisense	MR2-机架
微呼吸搅拌器	Unisense	MR2-Co
显微切割系统
Axio Vert.A1 倒置光学显微镜	蔡司
粗调作器	Narishige	MMN-1
三轴悬挂式纵杆 油压显微作器	Narishige	MMO-202ND
气动显微注射机	Narishige	IM-11-2
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