方法文章

利用 Microrespiration 分析和显微解剖研究 Teliospore 萌发

DOI：

10.3791/57628

⸱

2018年5月13日

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1Environmental and Life Sciences Graduate Department, Trent University, 2Forensic Science Department, Trent University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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黑穗病真菌引起许多破坏性的农业病害。它们被分散为休眠冬孢子, 在响应环境提示时发芽。我们概述了两种方法来研究发芽过程中的分子变化: 测量呼吸增加, 以检测代谢活化和评估变化的分子事件通过隔离冬孢子在不同的形态学阶段。

摘要

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黑穗病真菌是几种破坏性农业病害的致病因子。它们的特点是冬孢子的生产, 这是厚壁分散剂。冬孢子可以保持休眠数十年。休眠的特点是低代谢率, 暂停大分子生物合成和大大降低呼吸水平。在接收到所需的环境信号后, 冬孢子发芽产生单倍体细胞, 这会引发新一轮的感染。Teliospore 萌发的特点是恢复大分子生物合成, 增加呼吸和戏剧性的形态学变化。为了精确测量发芽初期细胞呼吸的变化, 我们开发了一种使用克拉克型呼吸的简单协议。发芽的后期阶段是由特定的形态学变化来区分的, 但发芽是异步的。我们开发了一种显微切割技术, 使我们能够收集冬孢子在不同的发芽阶段。

引言

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黑穗病真菌 (Ustilaginales) 由1600多个物种组成, 其中包括玉米、大麦和小麦等重要谷物作物, 每年造成的农作物损失数以亿计.1。这些真菌的特点是冬孢子的生产, 其中有黑暗的色素细胞壁和分散剂。冬孢子在寄主植物间分散的压力下保护遗传物质的作用, 并且可以在休眠状态持续多年 2.因此, 冬孢子是疾病传播的一个重要组成部分。

为了研究 teliospore 生物学, 我们的实验室利用了黑穗病真菌黑穗病玉米(U 玉米), 这是该病 "玉米常见黑穗病" 的因果动因。成熟的U. 玉米冬孢子的特点是生长骤停, 细胞代谢减少, 细胞呼吸的水平低 3.在有利的环境条件下 (e. g., 特定糖的存在), U. 玉米冬孢子发芽和完全减数分裂, 产生 basidiospores, 可引发新一轮的感染。发芽的特点是增加的呼吸, 恢复代谢活动, 并通过可见的形态学阶段的发芽4的进展。

发芽的初始阶段包括增加的呼吸和新陈代谢功能, 但是, 没有形态学的变化迹象。最初测量的呼吸变化在U. 玉米是50年前进行的, 测量耗氧....

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方案

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1. 玉米芯感染

  1. 种植玉米玉蜀黍(cv 金矮脚鸡), 直到棒子形成, 并开始丝绸 (约60天)。
  2. 与以前描述的7使用标准协议的区域性兼容的单倍体U. 玉米菌株。
  3. 使用以前描述的7标准协议感染玉米棒子。

2. Teliospore 收获

  1. 蒸压设备 (Büchner 漏斗, Büchner 烧瓶, 搅拌器, 250 毫升离心瓶, 扁平铲子, 和水) 使用标准的干燥循环, 至少30分钟的灭菌121摄氏度 (水的标准液体循环)。
  2. 使用剃刀将受感染的棒子从植物中取出 (大约28–35天后感染), 并将棒子放在工作台保护罩上的托盘上。
  3. 用剃刀刀片从棒子上取出肿瘤, 然后在烧杯中采集。
  4. 填充250毫升实验室搅拌器杯与肿瘤, 直到大约1/3 满, 并添加蒸压 dH2O, 直到搅拌机杯约3/4 满。通过在低的搅拌机中脉冲来扰乱肿瘤, 直到均匀。
  5. 将真空泵连接到一个疏水器, 然后再用1升 Büchner 瓶。
  6. 将大型 Büchner 漏斗插入瓶中, 并在 Büchner 漏斗底部排上四层棉布。
  7. 打开真空泵。
  8. 将匀质肿....

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结果

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利用克拉克型 microrespirometer 测量 teliospore 休眠和萌发过程中呼吸变化的方法, 我们证实休眠冬孢子与发芽相比具有低呼吸水平 (约1075µmol/小时/毫克)冬孢子 (2614 µmol/小时/毫克;图 1A)。这表示休眠冬孢子和冬孢子诱导发芽的平均呼吸速率有2.4 倍的变化。此外, 我们还发现, 诱导发芽的冬孢子在吸氧量上有45分钟的延迟 (图1B)。这是由30分钟的氧摄取延迟 (图 1B) 所示, 除了诱导发芽和氧气测量开始之间的 ~ 15 分钟的延迟。这确定了一个时间点开始评估的冬孢子发芽的分子变化, 没有明显变化。

在发芽过程中的后续变化可以显微镜观察。确定了发芽的五阶段。萌芽期的第一阶段代表冬孢子诱导发芽, 但仍与休眠冬孢子无法区分。.......

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讨论

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担子 biotrophic 植物病原体每年造成数以亿计的农作物损失。绝大多数这些病原体产生冬孢子, 是真菌散布和性繁殖不可分割的组成部分。了解冬孢子的发展和发芽对理解这些真菌造成的破坏性疾病的传播至关重要。为了识别关键控制点的分子变化, 我们设计了一种方法来确定生理移位的时间, 另一种是在萌发的不同阶段分离冬孢子。et 等。(未发表) 注意到 teliospore 萌发的五个阶段的光显微术 (图 2)。为了研究 i. 期的生理活化, 并对发芽过程中呼吸速率进行评估, 我们用克拉克型 microrespirometer 精确测量了氧消耗的变化。我们的样本数据表明, 我们的方法是精确和高度重现性。我们的发现证实, 发芽的U. 玉米冬孢子与未诱导的休眠冬孢子相比, 细胞呼吸的急剧增加。我们首次发现, 被诱导发芽的U. 玉米冬孢子在吸氧量上的延迟为45分钟。这表明,玉米冬孢子可能需要一些时间来处理发芽信号 (e.g), 在反应之前, 增加的吸氧量不是对发芽信号的立即反应, 也不是我们的化验不够灵敏.......

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披露

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作者没有竞争的金融利益或其他利益冲突来披露。

致谢

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我们要感谢保罗. 弗罗斯特医生使用他的 microrespirometer, 妮可瓦格纳和亚历克斯贝尔的技术援助。这项工作由 NSERC 赠款资助 B.J.S。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硫酸链霉素BioShopSTP101
硫酸卡那霉素BioShopKAN201
马铃薯葡萄糖汤BD Difco254920
1 L Waring 实验室搅拌机Waring7011S
粗棉布VWR470150-438
Nalgene 聚丙烯干燥器，带旋塞阀ThermoFisher Scientific5310-0250
Unisense MicroRespiration system
MicroRespiration 传感器 （O2）UnisenseOX10
MicroOptode 仪表放大器UnisenseN/A
MR-CH 小型UnisenseMR-Ch
传感器跟踪率软件UnisenseN/A
微呼吸架UnisenseMR2-机架
微呼吸搅拌器UnisenseMR2-Co
显微切割系统
Axio Vert.A1 倒置光学显微镜蔡司
粗调作器NarishigeMMN-1
三轴悬挂式纵杆 油压显微作器NarishigeMMO-202ND
气动显微注射机NarishigeIM-11-2
TransferTip （ES）Eppendorf5175107004

参考文献

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  1. Saville, B. J., Donaldson, M. E., Doyle, C. E. Meiosis - Molecular Mechanisms and Cytogenetic Diversity. Swan, A. , InTech. 411-460 (2012).
  2. Christensen, J. J. Monograph Number 2. , The American Phytopathological Society. Worcester, MA. (1963).
  3. Caltrider, P. D., Gottlieb, D. Respiratory activity and enzymes for glucose catabolism in fungal spores. Phytopathology. 53, 1021-1030 (1963).

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