自支撑电化学装置用于现场富集呼吸阳极细菌

摘要

现场微生物富集或 原位 培养技术有助于分离难以培养的微生物类群，尤其适用于低生物量或地球化学极端环境。本文介绍一种无需外接电源的电化学装置，用于富集具有胞外电子传递（EET）能力的微生物菌株。

摘要

厌氧呼吸与不溶性矿物的电子传递（称为胞外电子传递 [EET]）被认为在许多地下环境中对微生物的能量生成和长期存活至关重要，尤其是在缺乏可溶性末端电子受体的环境中。尽管已成功从多种环境中分离出具备 EET 能力的微生物，但能够进行 EET 的细菌多样性仍不清楚，特别是在采样困难、能量水平低或极端环境（如许多地下生态系统）中尤为如此。本文介绍了一种现场电化学系统，利用阳极作为呼吸作用的末端电子受体，以富集具备 EET 能力的细菌。该阳极连接 至一个能够 催化非生物氧还原反应的阴极。与使用恒电位仪控制电极电势的电培养方法相比，这种双电极系统无需外部电源。我们以美国加利福尼亚州北部陆地蛇纹石化地点“雪松斯”（Cedars）的一处碱性池塘为例，展示了该现场富集技术的应用。此前尝试培养矿物还原细菌均未成功，这可能归因于该地点生物量极低和/或金属还原微生物相对丰度较低。在实施双电极富集之前，我们测量了溶解氧浓度的垂直分布剖面，从而将碳毡阳极和铂电镀碳毡阴极分别置于适合厌氧和好氧过程发生的深度。现场孵育后，我们在实验室中进一步富集阳极上的微生物，并确认 其微生物群落与通常在雪松斯观察到的附着于表面或生物膜中的群落显著不同。该富集最终促成了从雪松斯分离出首个产电微生物。这种现场微生物富集方法有望显著提升从低生物量或难以采样的生境中分离 EET 能力细菌的成功率。

引言

多种矿物还原微生物已被证实能够利用固相矿物作为末端电子受体，通过胞外电子传递（EET）过程，将电子经由氧化还原酶传递至细胞外¹。EET不仅在微生物-矿物相互作用过程中至关重要，也在微生物燃料电池²、电极合成³和生物修复⁴等应用能源与环境技术中发挥关键作用。目前对具备EET能力的新细菌需求迫切，并已从基础或应用角度进行了广泛研究⁵。然而，我们对这些细菌的 生态学或生物地球化学意义仍了解有限。大多数具备EET能力的微生物是通过在实验室中以MnO₂、Fe₂O₃或极化电极等固态电子受体，从水体、沉积物或厌氧消化器中富集分离获得的^6,7,8。然而，这些方法通常获得相似的微生物群落，可能遗漏在低能量或低生物量系统中占主导地位的更敏感类群，从而导致这些微生物在实验室或无菌培养条件下适应能力的偏差⁹。通常对于低生物量环境，需采集大量现场水样进行过滤以浓缩细菌细胞。但具备EET能力的细菌常表现出厌氧代谢特性....

方案

1. 用于环境孵育的双电极系统的构建

1. 阳极材料的制备及碳毡电极的处理图2).
   1. 根据所需的生物量富集程度，将碳毡裁剪成相同尺寸。将每个电极在90%乙醇中浸泡30分钟，然后用去离子水至少冲洗8次，每次冲洗后超声处理1分钟。
   2. 将电极在1 M HCl中清洗两次，每次清洗至少搅拌12小时。
   3. 在37 °C的温热烘箱中将电极干燥6–12小时，或直至液体完全去除。
   4. 在聚四氟乙烯板（不粘表面）上，按照制造商方案使用石墨环氧树脂将电极固定到钛丝上。
      注意：我们使用了钛丝，因为它具有较高的耐 aerobic 腐蚀能力。
   5. 将电极在120 °C下烘烤6 h。
   6. 使用欧姆表检测钛丝与碳毡之间的电阻，并确认丝状电极与毡状电极之间的电阻小于5欧姆。
2. 在碳毡电极上电镀铂以制备阴极材料
   1. 将步骤1.1中制备的碳毡电极浸入玻璃容器中的2 M KOH溶液中，浸泡时间不少于12小时。
   2. 进行电化学清洗时，将电极作为工作电极（WE）放入三电极反应器中，该反应器还包含参比电极（RE）和对电极（CE）。使用鳄鱼夹将WE、RE和CE连接至恒电位仪。使用欧姆表确认所有连接。
      注意：我....

结果

使用电压数据记录仪成功测量了约3个月的电流产生情况，如图3所示。选择该时间段是因为春季的稳定培养期最长，而秋季强降雨会影响春季的实验条件。虽然较短的时间可能已足够，但更长的培养时间可能有助于生物量的更充分富集。电化学培养结束后，我们确认了双电极系统的连接状态，并未观察到系统存在腐蚀现象。与电阻为100 kΩ的阴性对照相比，电阻较低（1,000 Ω）的双电极系统表现出更高的电流产生能力。在第一个月内电流产量逐渐增加，可能表明微生物在电极表面生长、积累或适应；随后两个月电流产量保持稳定。值得注意的是，在整个电化学富集期间，电流产量呈现出大约24小时的周期性振荡。

为验证附着在电极上的微生物群落当前的产电能力，我们在实验室中使用三电极电化学反应器对收集的阳极进行计时安培法检测。将电极电位固定在相对于标准氢电极+0.4 V. 在存在各种碳水化合物电子供体的条件下，标准氢电极（SHE.......

讨论

在本项研究中，我们展示了与微生物群落相关的富集过程 原位 当前产电情况表明，该系统在短期和长期尺度上均支持微生物活性。构建功能性双电极（燃料电池型）系统的关键步骤是确定并利用环境中水位稳定且氧气浓度恒定的区域。阴极暴露于空气与水界面处的氧气，而阳极则维持在厌氧条件下，电极间的电势差促进具备胞外电子传递（EET）能力的细菌进行厌氧呼吸。

在环境电化学系统中，我们观察到电流存在每日周期性振荡，但在实验室反应器中未观察到该现象。由于这种电流波动出现在白天时段，且最大和最小电流值均出现在黎明至黄昏之间，因此光照和/或温度的影响可能解释了微生物产电的变化。测量温度、光照和/或其他环境变量，可进一步加深对环境中微生物电子传递过程的调控机制和驱动因素的理解。或者，可通过添加遮光元件以阻隔光照，从而消除或减轻产氧光合作用和/或电极上潜在光化学反应的影响，这有助于更好地创造最优的胞外电子传递（EET）条件。然而，对其他环境因子的测量将更有助于阐明具有EET能力的微生物所处的生态背景，包括潜在的微生物群落相互作用，以及微生物与 环境之间的关系。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
碳毡片	n/a	n/a	用作阳极和阴极
钛丝	The Nilaco Cooporation	TI-451485	用于构建燃料电池系统
石墨环氧树脂	Electrolytica lnc.	n/a	用于连接 电极与钛丝
干燥烘箱	Yamato	DY300	烘烤电极以 固化导电石墨环氧树脂
数字万用表	Fluke	616-1454	用于检测电阻的 欧姆值
溶解氧探头	Sper Science	# 850045	用于检测环境中 的氧气浓度
电阻器	Sodial		用于构建燃料电池 系统
导线	Pico	81141s	用于构建燃料电池 系统
电压表和数据记录仪	T&D corporation	VR-71	用于数据记录
六水合六氯铂酸(IV)	wako	18497-13-7	用于电沉积
柠檬酸	Wako	038-06925	用于电沉积
硫酸	Wako	192-04696	用于电沉积
HCl	Wako	083-01095	用于电极清洗
玻璃量筒	N/A	N/A	定制，用作电化学反应器
聚四氟乙烯（PTFE）盖板和底座	N/A	N/A	定制，用作电化学反应器的盖子和基座
丁基橡胶	N/A	N/A	定制，插入电化学反应器各组件之间
橡胶隔垫	GL Science	3007-16101	用作电化学反应器的进样口
氧化铟锡（ITO）电极	GEOMATEC	No.0001	用作工作电极，5Ω/sq
氯化银/银（Ag/AgCl）饱和KCl电极	HOKUTO DENKO	HX-R5	用作参比电极，Φ0.30mm
铂丝	The Nilaco Cooporation	PT-351325	用作对电极
NaHCO3	Wako	191-01305	用于Cedars培养基（CMS）
CaCO3	Wako	030-00385	用于CMS
NH4Cl	Wako	011-03015	用于CMS
MgCl2 • 6H2O	Wako	135-00165	用于CMS
NaOH	Wako	198-13765	用于CMS
Na2SO4	Wako	194-03355	用于CMS
K2HPO4	Wako	164-04295	用于CMS
CABS	SANTA CRUZ	SC-285279	用于CMS
培养箱	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	用于预培养
高压灭菌器	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	用于电化学反应器和培养基的灭菌
超净工作台	SANYO	MCV-91BNF	用于防止其他微生物污染电化学反应器和培养基
离心分离机	Eppendorf	5430R	要求转速可达6000×g
氮气发生器	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	也可使用氮气钢瓶替代气体发生器
紫外-可见分光光度计	SHIMADZU	UV-1800	用于优化细胞密度
电化学工作站	BioLogic	VMP3	用于生物膜形成和动力学同位素效应实验
恒温水循环器	AS ONE	TR-1A	用于维持电化学反应器的温度
法拉第屏蔽笼	HOKUTO DENKO	HS-201S	用于电化学实验
厌氧培养箱	COY	TypeB (Vinyl)	用于在厌氧条件下 进行实验
超纯DNA提取试剂盒	MoBio