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方法文章

自支撑电化学装置用于现场富集呼吸阳极细菌

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DOI：

10.3791/57632

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2018年7月24日

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

本文内容

摘要

现场微生物富集或 原位 培养技术有助于分离难以培养的微生物类群，尤其适用于低生物量或地球化学极端环境。本文介绍一种无需外接电源的电化学装置，用于富集具有胞外电子传递（EET）能力的微生物菌株。

摘要

厌氧呼吸与不溶性矿物的电子传递（称为胞外电子传递 [EET]）被认为在许多地下环境中对微生物的能量生成和长期存活至关重要，尤其是在缺乏可溶性末端电子受体的环境中。尽管已成功从多种环境中分离出具备 EET 能力的微生物，但能够进行 EET 的细菌多样性仍不清楚，特别是在采样困难、能量水平低或极端环境（如许多地下生态系统）中尤为如此。本文介绍了一种现场电化学系统，利用阳极作为呼吸作用的末端电子受体，以富集具备 EET 能力的细菌。该阳极连接 至一个能够 催化非生物氧还原反应的阴极。与使用恒电位仪控制电极电势的电培养方法相比，这种双电极系统无需外部电源。我们以美国加利福尼亚州北部陆地蛇纹石化地点“雪松斯”（Cedars）的一处碱性池塘为例，展示了该现场富集技术的应用。此前尝试培养矿物还原细菌均未成功，这可能归因于该地点生物量极低和/或金属还原微生物相对丰度较低。在实施双电极富集之前，我们测量了溶解氧浓度的垂直分布剖面，从而将碳毡阳极和铂电镀碳毡阴极分别置于适合厌氧和好氧过程发生的深度。现场孵育后，我们在实验室中进一步富集阳极上的微生物，并确认 其微生物群落与通常在雪松斯观察到的附着于表面或生物膜中的群落显著不同。该富集最终促成了从雪松斯分离出首个产电微生物。这种现场微生物富集方法有望显著提升从低生物量或难以采样的生境中分离 EET 能力细菌的成功率。

引言

多种矿物还原微生物已被证实能够利用固相矿物作为末端电子受体，通过胞外电子传递（EET）过程，将电子经由氧化还原酶传递至细胞外1。EET不仅在微生物-矿物相互作用过程中至关重要，也在微生物燃料电池2、电极合成3和生物修复4等应用能源与环境技术中发挥关键作用。目前对具备EET能力的新细菌需求迫切，并已从基础或应用角度进行了广泛研究5。然而，我们对这些细菌的 生态学或生物地球化学意义仍了解有限。大多数具备EET能力的微生物是通过在实验室中以MnO2、Fe2O3或极化电极等固态电子受体，从水体、沉积物或厌氧消化器中富集分离获得的6,7,8。然而，这些方法通常获得相似的微生物群落，可能遗漏在低能量或低生物量系统中占主导地位的更敏感类群，从而导致这些微生物在实验室或无菌培养条件下适应能力的偏差9。通常对于低生物量环境，需采集大量现场水样进行过滤以浓缩细菌细胞。但具备EET能力的细菌常表现出厌氧代谢特性，因此氧气暴露可能进一步抑制甚至阻碍其培养。开发无需暴露于氧气即可在现场浓缩细胞的替代方法，有助于促进EET能力细菌的分离。本文报道了一种无需外部电源的现场电化学技术的构建细节，可用于长期富集具备EET能力的微生物。

利用我们在加利福尼亚州北部名为Cedars的高碱性泉中开展的电培养实验10我们在此介绍这种现场电化学技术。塞德尔斯泉的地球化学特征受到地下蛇纹石化作用的影响。这些泉水具有高度还原性，其氧气浓度低于检测限，尤其是在气水界面以下，这凸显了在这一功能性缺氧环境中通过胞外电子传递（EET）实现微生物能量生成的潜力。11然而，目前没有证据支持在雪松泉（Cedars）环境中存在具有电子传递能力的微生物（无论是在16S rRNA还是宏基因组分析中）。尽管该环境被描述为电子受体受限，但仍有可能利用不溶性矿物作为末端电子受体，包括蛇纹石化过程中产生的含铁矿物即，磁铁矿）尚未得到充分研究12因此，我们在塞德尔斯地区一处高pH值的泉眼——营地泉（Campsite Spring）部署了我们的电化学系统，以富集具有胞外电子传递能力的微生物（图1)13.

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方案

1. 用于环境孵育的双电极系统的构建

  1. 阳极材料的制备及碳毡电极的处理图2).
    1. 根据所需的生物量富集程度，将碳毡裁剪成相同尺寸。将每个电极在90%乙醇中浸泡30分钟，然后用去离子水至少冲洗8次，每次冲洗后超声处理1分钟。
    2. 将电极在1 M HCl中清洗两次，每次清洗至少搅拌12小时。
    3. 在37 °C的温热烘箱中将电极干燥6–12小时，或直至液体完全去除。
    4. 在聚四氟乙烯板（不粘表面）上，按照制造商方案使用石墨环氧树脂将电极固定到钛丝上。
      注意：我们使用了钛丝，因为它具有较高的耐 aerobic 腐蚀能力。
    5. 将电极在120 °C下烘烤6 h。
    6. 使用欧姆表检测钛丝与碳毡之间的电阻，并确认丝状电极与毡状电极之间的电阻小于5欧姆。
  2. 在碳毡电极上电镀铂以制备阴极材料
    1. 将步骤1.1中制备的碳毡电极浸入玻璃容器中的2 M KOH溶液中，浸泡时间不少于12小时。
    2. 进行电化学清洗时，将电极作为工作电极（WE）放入三电极反应器中，该反应器还包含参比电极（RE）和对电极（CE）。使用鳄鱼夹将WE、RE和CE连接至恒电位仪。使用欧姆表确认所有连接。
      注意：我们使用饱和KCl的Ag/AgCl电极和铂丝分别作为参比电极和对电极。
    3. 将电极电位调节至相对于1.0 V. 在含有 2 M KOH 的电解液溶液中（使用足量以完全浸没整个电极），将电极在 Ag/AgCl 条件下反应 600 秒。从电化学反应器（由玻璃制成）中取出电极。用去离子水冲洗电极 在去离子水中至少清洗8次，每次冲洗后超声处理1分钟。将电极在100 °C下干燥至少12小时。
    4. 配制镀液时，将100 g柠檬酸、5 g硫酸钠和2 g六水合二氯六氯铂酸(IV)加入1 L 2 M硫酸溶液中。
    5. 称量按步骤1.2.1–1.2.2制备的洁净干燥电极，然后将其浸入按步骤1.2.3制备的电镀液中。在电镀液中对电极进行超声处理，每次30秒，共三次。
    6. 将电极在镀液中相对于 Ag/AgCl 参比电极施加 -0.2 V 电位，电镀 460 秒。随后用去离子水冲洗电极两次，并妥善处理铂废液。
    7. 将电极在去离子水中至少冲洗3次，每次冲洗后超声20秒。再至少用去离子水冲洗3次，此过程不进行超声。
    8. 将电极在 100 °C 下干燥至少 12 小时。称量电极以测定碳毡电极上电沉积的铂含量。

2. 双电极系统的构建与安装

  1. 研究 每个电极在自然环境中的安装位置。
    1. 使用溶解氧（DO）探头测定氧浓度。
    2. 检测该站点溶解氧的深度分布。
      注意：阳极所需环境条件为持续湿润和无氧状态。如需排除产氧光合作用的影响，可将阳极遮光处理。阴极放置的理想条件为持续湿润，并靠近含氧的地表水体。必要时，固定 漂浮以维持 阴极表面接触
  2. 构建燃料电池型双电极培养系统
    1. 将所需长度的绝缘导线与电极（一个阳极和一个镀铂阴极）上的钛丝引线通过绞合方式连接。用防水蜡覆盖连接处，并使用船用级热缩管进一步保护。
    2. 使用已知阻值的电阻将连接阴极和阳极的两根导线连接起来。
      注意：对于生物系统，较低的电阻（10 至 1,000 Ω）可产生更稳定的生物活性。如需要，使用高电阻电阻器可抑制生物活性。 作为阴性对照。为防止电阻器与导线之间连接处发生腐蚀，我们使用热缩管对其进行保护。
  3. 电压和温度随时间变化的测量
    1. 通过测量电阻两端的电压来估算燃料电池反应产生的电流。
    2. 使用数据记录电压表，通过适当连接至阳极和阴极的导线，随时间测量电压差（参见制造商说明书）。
      注意：同时进行温度数据记录是可选的，但这些信息有助于将电流变化与非生物因素而非生物因素的波动相关联。
  4. 数据记录仪和电气连接的保护
    1. 使用固定的 和/或使用塑料袋保护记录仪及所有电气连接，以防雨水侵入。
    2. 将塑料袋和电缆牢固固定，以防强风破坏。示例如下所示 图1.

3. 从自然环境中采集电极样品

  1. 为防止阳极样品因氧气污染而受损，应在厌氧条件下采集电极。
  2. 在采集电极样品前至少30分钟，将一支试管置于厌氧环境中。例如，将试管及管盖分别放置于池底，使试管内部处于厌氧状态。
  3. 使用剪线钳剪断电极上的钛导线，小心将电极样品放入试管中，并在厌氧水层中密封。为保持样品新鲜，样品采集后应立即于4 °C保存。
    注意：也可将电极直接转移至无氧（经N2吹扫）培养基中。我们使用了一种Cedars培养基（由 Suzuki et al.11描述），该培养基根据采样点测得的水相地球化学参数设计，并添加了足够微生物生长所需的营养成分。该培养基已根据不同实验室实验需求进行了改良。

4. 当前生产与DNA 分析的实验室确认

  1. 电化学验证附着于电极的微生物群落的产电能力。
    1. 构建电化学反应器14,15 使用采样电极，一个 铂丝，以及一个 在厌氧室中，分别使用Ag/AgCl（KCl饱和）电极作为工作电极、对电极和参比电极。向电化学反应器中注入电解液 使用含可溶性碳水化合物电子供体的Cedars培养基。
    2. 将电极电位稳定在相对于Ag/AgCl的+0.2 V，测量电流产生情况。
  2. 使用微生物DNA试剂盒从电极样品中提取DNA（参见材料表）。
    1. 用70%乙醇清洁厌氧手套箱内部，并在铝箔上放置一个灭菌培养皿。
      注：厌氧培养箱 通过维持氢气环境，使氧气浓度保持在1 ppm以下 在钯催化剂存在下，将气氛调节至约2–3%以清除氧气。
    2. 打开电化学反应器 手套箱中，将样品电极置于培养皿上，并裁剪至适合DNA试剂盒所用管子的大小，然后按照制造商提供的操作步骤进行。

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结果

使用电压数据记录仪成功测量了约3个月的电流产生情况，如图3所示。选择该时间段是因为春季的稳定培养期最长，而秋季强降雨会影响春季的实验条件。虽然较短的时间可能已足够，但更长的培养时间可能有助于生物量的更充分富集。电化学培养结束后，我们确认了双电极系统的连接状态，并未观察到系统存在腐蚀现象。与电阻为100 kΩ的阴性对照相比，电阻较低（1,000 Ω）的双电极系统表现出更高的电流产生能力。在第一个月内电流产量逐渐增加，可能表明微生物在电极表面生长、积累或适应；随后两个月电流产量保持稳定。值得注意的是，在整个电化学富集期间，电流产量呈现出大约24小时的周期性振荡。

为验证附着在电极上的微生物群落当前的产电能力，我们在实验室中使用三电极电化学反应器对收集的阳极进行计时安培法检测。将电极电位固定在相对于标准氢电极+0.4 V. 在存在各种碳水化合物电子供体的条件下，标准氢电极（SHE...

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讨论

在本项研究中，我们展示了与微生物群落相关的富集过程 原位 当前产电情况表明，该系统在短期和长期尺度上均支持微生物活性。构建功能性双电极（燃料电池型）系统的关键步骤是确定并利用环境中水位稳定且氧气浓度恒定的区域。阴极暴露于空气与水界面处的氧气，而阳极则维持在厌氧条件下，电极间的电势差促进具备胞外电子传递（EET）能力的细菌进行厌氧呼吸。

在环境电化学系统中，我们观察到电流存在每日周期性振荡，但在实验室反应器中未观察到该现象。由于这种电流波动出现在白天时段，且最大和最小电流值均出现在黎明至黄昏之间，因此光照和/或温度的影响可能解释了微生物产电的变化。测量温度、光照和/或其他环境变量，可进一步加深对环境中微生物电子传递过程的调控机制和驱动因素的理解。或者，可通过添加遮光元件以阻隔光照，从而消除或减轻产氧光合作用和/或电极上潜在光化学反应的影响，这有助于更好地创造最优的胞外电子传递（EET）条件。然而，对其他环境因子的测量将更有助于阐明具有EET能力的微生物所处的生态背景，包括潜在的微生物群落相互作用，以及微生物与 环境之间的关系。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Roger Raiche和David McCrory允许我们进入Cedars地区，并就长期孵育的选址提供了咨询建议。我们还要感谢2013-2014年度Cedars野外工作团队成员：Shino Suzuki、Shunichi Ishii、Greg Wanger、Grayson Chadwick、Bonita Lam和Matthew Schechter。特别感谢Shino Suzuki和Gijs Kuenen在研究思路和培养技术方面提供的支持。本研究由日本促进科学会（JSPS）科学研究费补助金（KAKENHI）青年研究（A）和（B）项目（资助编号分别为17H04969和26810085）以及日本医疗研究开发机构（17gm6010002h0002）提供资助。美国方面的资助来自美国全球海军研究办公室（N62909-17-1-2038）、深部生物圈研究计划中心（C-DEBI）（OCE0939564）以及美国国家航空航天局天体生物学研究所——地下生命项目（NAI-LU）（NNA13AA92A）。本研究的部分工作是在日本促进科学会短期博士后奖学金（Annette Rowe，项目编号PE15019）资助下，于东京大学桥本一仁实验室完成的。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碳毡片n/an/a用作阳极和阴极
钛丝The Nilaco CooporationTI-451485用于构建燃料电池系统
石墨环氧树脂Electrolytica lnc.n/a用于连接
电极与钛丝
干燥烘箱YamatoDY300烘烤电极以
固化导电石墨环氧树脂
数字万用表Fluke616-1454用于检测电阻的
欧姆值
溶解氧探头Sper Science# 850045用于检测环境中
的氧气浓度
电阻器Sodial用于构建燃料电池
系统
导线Pico81141s用于构建燃料电池
系统
电压表和数据记录仪T&D corporationVR-71用于数据记录
六水合六氯铂酸(IV)wako18497-13-7用于电沉积
柠檬酸Wako038-06925用于电沉积
硫酸Wako192-04696用于电沉积
HClWako083-01095用于电极清洗
玻璃量筒N/AN/A定制，用作电化学反应器
聚四氟乙烯（PTFE）盖板和底座N/AN/A定制，用作电化学反应器的盖子和基座
丁基橡胶N/AN/A定制，插入电化学反应器各组件之间
橡胶隔垫GL Science3007-16101用作电化学反应器的进样口
氧化铟锡（ITO）电极GEOMATECNo.0001用作工作电极，5Ω/sq
氯化银/银（Ag/AgCl）饱和KCl电极HOKUTO DENKOHX-R5用作参比电极，Φ0.30mm
铂丝The Nilaco CooporationPT-351325用作对电极
NaHCO3Wako191-01305用于Cedars培养基（CMS）
CaCO3Wako030-00385用于CMS
NH4ClWako011-03015用于CMS
MgCl2 • 6H2OWako135-00165用于CMS
NaOH Wako198-13765用于CMS
Na2SO4Wako194-03355用于CMS
K2HPO4Wako164-04295用于CMS
CABSSANTA CRUZSC-285279用于CMS
培养箱TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SD用于预培养
高压灭菌器TOMY SEIKO CO. LTD.LSX-500用于电化学反应器和培养基的灭菌
超净工作台SANYOMCV-91BNF用于防止其他微生物污染电化学反应器和培养基
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进行实验
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参考文献

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