细胞突起力显微技术：一种量化细胞突起产生作用力的方法

摘要

本文详细介绍了用于评估 podosome 对可变形薄膜施加的突出力的实验技术，内容涵盖薄膜的制备到形貌图像的自动化分析。

摘要

在多种生物学背景下，动物细胞需要通过产生机械力与周围环境发生物理相互作用。其中，牵引力已被充分表征，但目前尚缺乏能够测量细胞垂直于基底方向施加的突出力的技术。我们设计了一种实验装置，用于测量贴壁细胞对其基底施加的突出力。接种在可变形的Formvar膜上的细胞会使其基底发生形变，随后通过原子力显微镜（AFM）在纳米尺度上对所产生的表面形貌进行成像。然后，基于突出性细胞结构的几何特征分析形变轮廓，从而提取出力的数值。因此，可以随时间测量活细胞中各个突出单元所施加的力。该技术将有助于研究涉及细胞突出的多种细胞过程中力的产生及其调控机制。本文中，我们描述了该方法在测量人巨噬细胞形成的浆膜足（podosomes）所产生的突出力中的应用。

引言

动物细胞与其所处环境中的基质及其他细胞发生物理相互作用¹。这种相互作用对于细胞的迁移、吞噬颗粒、获取外界信息或分化等过程至关重要。在这些过程中，细胞必须产生机械力；近年来大量研究表明，细胞产生机械力并探测其周围环境的能力会影响其生物学行为，例如调控细胞增殖或分化^2,3。因此，对细胞力的测量成为研究力生成调控机制的重要手段，并有助于理解其在细胞行为和组织命运决定中的作用^4,5。

近年来，已开发出多种技术用于测量细胞对其周围环境施加的力⁶。其中大多数技术在揭示细胞牵拉可移动探针或可变形基底时所产生的牵引力方面发挥了重要作用。然而，对于细胞向细胞外环境突出过程中所涉及的机械力，目前仍缺乏有效的测量手段，其特征至今尚不明确。

为了克服这一局限性，我们提出了一种测量细胞施加于基底垂直方向上作用力的方法。该方法包括将活细胞接种在可沿垂直方向发生形变的薄弹性基片上，从而能够测量细胞引起的基底形变，并据此推导出相关作用力。基底的表面形貌通过原子力显微镜以纳米级分辨率进行测量，而由形变评估作用力则依赖于对细胞突出结构几何特征的了解^7,8,9。

本文描述了该装置的设置及其在测量巨噬细胞在三维环境中进行间充质迁移时所形成的 podosome（突起性黏附结构）产生之力的应用^{10,11,12,13,14,15,16,17}。我们相信，该技术将推动对涉及细胞突起的多种细胞过程中力的产生及其调控机制的理解。

方案

1. 甲酸盐薄膜包被载网的制备

1. 用纯丙酮清洗透射电镜载网，并在滤纸上晾干。随后用纯乙醇清洗载玻片，用镜头纸擦拭，并用吹气球去除灰尘。
2. 将经乙醇清洁的玻璃载玻片垂直放入薄膜浇铸装置的漏斗中，漏斗下部含有Formvar溶液。盖上漏斗顶部。
3. 用喷雾器将100 mL聚乙烯醇缩甲醛溶液（0.5%溶于二氯乙烷）泵入载玻片，直至液面达到载玻片高度的三分之二。
4. 将载玻片置于溶液中 1 分钟。
5. 打开装置的阀门，使Formvar溶液以稳定流速排出。流速控制在10至15 mL/s时，可获得厚度为30–80 nm的Formvar膜。膜的厚度取决于Formvar溶液的浓度和排液速率。
   注意：可通过释放压力来控制排水速率 通过 通过缓慢打开阀门来开启排气阀。排水越快，膜越厚。实践中，由于难以根据Formvar的流速预测膜的厚度，我们制备多批Formvar膜，并通过原子力显微镜（AFM）控制其厚度（见步骤2）。
6. 从培养室中取出载玻片，并用滤纸轻轻吸干以去除残留的液态Formvar。
7. 用剃刀从Formvar膜上切割出一个20 mm × 50 mm的矩形。
8. 将烧杯装入洁净的蒸馏水，然后缓慢将载玻片垂直浸入水中，使膜脱离并漂浮于水面：膜应漂浮在水面上。
9. 将经丙酮清洁并干燥的载网放置于膜上，光面朝上。
10. 放置一个圆形玻璃盖玻片（Ø 将盖玻片（12 mm）放置在部分载网之上，用于测量膜的厚度（见步骤2）。
11. 用裁剪至合适大小的白色贴纸覆盖载玻片。将载玻片垂直浸入漂浮的Formvar膜边缘，直至整个膜附着在载玻片上。用滤纸吸去载玻片上的多余水分，并在室温下静置过夜使其干燥。

2. 薄膜厚度的测量

1. 用镊子在盖玻片周围的Formvar膜上剪开，使其从载玻片上分离。
2. 用笔标记盖玻片下方网格的位置。
3. 在已标记的网格周围剪开Formvar膜，使其从盖玻片上分离。这样在剩余的Formvar膜上会留下一个孔洞，可用于测量膜的厚度。用PBS覆盖盖玻片，并将其放置在显微镜的玻璃载片上。
4. 将氮化硅悬臂安装到AFM玻璃块上，确保金条纹未被弹簧尖端覆盖。
   注意：悬臂的灵敏度和弹簧常数应已在PBS中完成校准。
5. 将玻璃块安装到AFM模块上，然后将模块放置到显微镜上。
6. 将涂有Formvar的盖玻片放入观察室，并加入500 µL PBS覆盖。
7. 使用原子力显微镜（AFM）接触模式和0.5 nN的设定力，扫描Formvar膜上孔洞的边缘。
8. 以玻璃盖玻片表面作为高度测量的参考，通过截面高度评估Formvar膜的厚度（每批Formvar膜至少进行10次测量）。

3. 在网格上接种细胞

1. 在无菌操作台内，将一条双面胶带（12 mm × 3 mm）贴在盖玻片上。
2. 用镊子夹取一片涂有Formvar的载网，将其倒置放在胶带条上（仅需将载网边缘粘附在胶带上）。Formvar膜必须朝向盖玻片一侧。
3. 将此装置放入培养孔中。
4. 加入10 µL不含FCS的RPMI培养基，其中含有由人单核细胞分化而来的10⁴个巨噬细胞¹⁶。
   注意：加样时确保移液器枪头不接触载网，以免损坏Formvar涂层。
5. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟，使细胞贴附。
6. 向孔中补加2 mL含10% FCS的RPMI培养基。
7. 在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育2小时，使细胞充分贴附，随后进行原子力显微镜（AFM）观察。

4. 由巨噬细胞足体诱导的形变的形貌测量

1. 在玻璃底培养皿上粘贴两条双面胶带。
   注意：两条胶带之间的距离应小于网格的直径。
2. 小心地将接种有巨噬细胞的网格从胶带上取下。
3. 将网格翻转，使细胞面朝向玻璃，然后将网格固定在两条双面胶带之间。
4. 用两条新的双面胶带固定网格，使网格被夹在两层胶带之间，从而让网格的中央区域可被原子力显微镜（AFM）探针接触。
   注意：确保网格固定牢固且无扭曲；否则AFM悬臂可能无法接近Formvar表面。
5. 向培养皿中加入2 mL预热至37 °C的培养基（含10%胎牛血清的RPMI），并添加10 mM HEPES（pH 7.4）。
6. 将培养皿置于37 °C的加热板上。
7. 将加热板安装到AFM载物台上。
8. 让系统稳定在37 °C。
9. 在接触模式下以0.5 nN的力进行首次全局成像以定位小体结构，随后以约20 nm的像素尺寸、3 Hz的扫描速率对Formvar表面形貌进行扫描。
   注意：避免在网格边缘附近进行扫描。

结果

上述方案描述了如何制备实验装置，以定量测定巨噬细胞足体在 Formvar 基底上施加的突出力。该过程使用原子力显微镜（AFM）实现，如图1所示。

使用 JPK 数据处理软件分析 podosome 下方隆起结构的形貌图像时，应对每条扫描线独立减去三阶多项式拟合。可通过在图像侧边添加 z 颜色标尺来评估 podosome 诱导隆起的最大高度。导出为 TIFF 格式后，进一步使用在线提供的专用自制 ImageJ 宏对形貌图像进行分析⁸。该宏可根据给定参数（Formvar 膜厚度和 podosome 环半径）在修正后的高度图像上定位隆起结构，并生成力图（图 2）。此外，该宏还会生成一个文本文件，记录 Formvar 表面上每个检测到的隆起结构的坐标、高度及计算得到的力值。

讨论

材料特性

在我们的实验中，可变形膜材料的选择（以Formvar为例）需要满足若干要求。该材料必须对可见光透明，并具有较低的自发荧光，以便在明场和荧光显微镜下进行观察。薄膜的表面粗糙度必须远低于10 nm，以避免对细胞黏附产生拓扑效应，并确保可通过原子力显微镜（AFM）清晰观察到细胞诱导形成的突起结构。最后，膜的刚度（取决于材料的杨氏模量和厚度）需足够高，以促进podosome的形成，同时在典型podosome位点产生的应力（约为10–100 kPa）作用下仍保持可观测的形变能力。厚度为30–80 nm的Formvar薄膜在上述各项约束条件之间达到了良好的平衡。值得注意的是，通过调节Formvar膜的厚度，可调控其刚度，从而研究podosome的力学感知特性⁷。

Formvar 制备的可重复性与质量

某些批次的火棉胶膜会在载网上产生褶皱，因此无法使用：这一点可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200目镍网格	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
滤纸	Sigma-Aldrich	1001-055
显微镜载玻片	Fisher Scientific	10235612
白色标签 26 × 70 mm	Avery	DP033-100
出口带阀门的成膜装置	Electron Microscopy Sciences	71305-01
剃须刀片	Electron Microscopy Sciences	72000
乙醇	VWR	1.08543.0250
丙酮	VWR	20066.321
0.5% 甲酰膜乙二氯溶液	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm 盖玻片	VWR	631-0666
倒置显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 200
原子力显微镜	JPK Instruments	NanoWizard III
温度控制样品台	JPK Instruments	BioCell
标称弹性常数为 0.01 N/m 的氮化硅悬臂梁	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
双面胶带	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm 玻璃底培养皿	WPI	FD35-100