本文介绍了一种用于开发和表征耐受性树突状细胞（TolDCs）并评估其免疫治疗效用的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
免疫系统通过在针对外来抗原的免疫应答与对自身抗原以及共生微生物来源抗原的耐受状态之间维持精密平衡来发挥作用。这种免疫稳态的破坏可导致慢性炎症以及自身免疫性疾病的发生。树突状细胞（Dendritic cells, DCs）是天然免疫系统中的专职抗原呈递细胞，能够激活初始T细胞，从而启动针对外来抗原的免疫应答。然而，DCs也可被诱导分化为耐受性树突状细胞（Tolerogenic dendritic cells, TolDCs），后者通过维持和促进T细胞耐受、抑制效应细胞活性，防止自身免疫或慢性炎症性疾病的发生。近年来对TolDCs的深入研究揭示，通过调控DCs的分化条件可实现其耐受表型的建立。这一发现极大地推动了以TolDCs为基础的免疫疗法在多种因免疫耐受失衡所致免疫紊乱疾病中的应用发展。在多种自身免疫性疾病的临床前小鼠模型中，相关研究已成功验证了TolDCs作为免疫治疗手段的有效性。目前，TolDCs已成为临床中一种极具前景的免疫治疗工具，可在不影响保护性免疫的前提下，靶向抑制致病性自身免疫反应，从而重建多种免疫紊乱疾病中的免疫耐受。尽管多个实验室已提出多种诱导TolDCs的策略，但目前在这些细胞的细胞表型与功能特征鉴定方面仍缺乏统一标准。本实验方案提供了一套逐步操作指南，用于大量制备骨髓来源的DCs，采用合成三萜类化合物2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸-二氟丙基酰胺（CDDO-DFPA）将其特异性诱导分化为TolDCs，并介绍用于确认其表型的技术方法，包括对TolDCs关键分子标志物的分析。最后，我们展示了一种通过检测其免疫抑制功能来评估TolDCs生物学活性的方法。 耐受性树突状细胞，免疫耐受，树突状细胞，CDDO-DFPA，骨髓来源树突状细胞，免疫疗法，自身免疫，慢性炎症，T细胞耐受，免疫稳态 体外 和 体内 在多发性硬化症的临床前模型中。
引言
树突状细胞（DCs）是先天免疫系统的重要组成部分，由拉尔夫·斯坦曼（Ralph Steinman）和赞维尔·科恩（Zanvil Cohn）于1973年首次发现并鉴定为主要的专业抗原呈递细胞1树突状细胞（DCs）已被证实通过在次级淋巴器官中经由主要组织相容性复合体（MHC）向T细胞和B细胞呈递经处理的抗原，在连接先天免疫与适应性免疫系统中发挥重要作用。2在哺乳动物免疫系统中，至少存在两类树突状细胞（DC），即髓系树突状细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。3髓样树突状细胞（也称为传统树突状细胞，cDCs）以表达CD11c为特征，可分化为未成熟树突状细胞（iDCs） 体外 分别从鼠源或人源的骨髓前体细胞或外周血单核细胞，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和IL-4诱导生成4.
激活“危险”信号（如病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP））可通过与树突状细胞（DC）表面多种模式识别受体结合，驱动未成熟DC（iDCs）向具有免疫原性的成熟DC（mDCs）分化5。具有免疫原性的DC通过上调MHCII2、共刺激配体（CD80、CD86和CD40）
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方案
所有研究均按照凯斯西储大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。
1. 准备骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）
- 通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌，并在II级生物安全柜中按照适当的安全规程进行实验。
- 使用CO2麻醉箱处死8至10周龄的C57BL/6小鼠。将小鼠置于解剖板上，用70%乙醇冲洗。使用手术剪剪下胫腓骨和股骨，并将其放入盛有70%乙醇的10 cm培养皿中。
- 在10 cm培养皿盖上使用手术刀片和镊子尽可能剥离组织，分离出胫骨和股骨，并将其转移至盛有70%乙醇的6 cm培养皿中。
- 使用手术刀片切除胫骨和股骨两端。使用装有3 mL PBS的3 mL注射器（配备23G针头），从骨的一端将骨髓内容物冲洗至含有12 mL PBS的锥形管中。对每根骨的两端重复此步骤3次。
- 将细胞悬液在300 × g条件下离心5分钟。
- 弃去上清液，用1 mL ACK裂解缓冲液重悬细胞沉淀，孵育5分钟以去除红细胞。
- 加入9 mL PBS稀释ACK裂解缓冲液，并在300 × g条件下离心5分钟。
- 弃去上清液，用10 mL培养基（RPMI-1640，含L-谷氨酰胺、10% FBS、1%非必需氨基酸（100×）、10 mM HEPES、50 nM β-巯基乙醇和5%青霉素/链霉素）重悬细胞。
注意：....
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结果
骨髓来源树突状细胞的分化与筛选：
骨髓祖细胞在含有GM-CSF和IL-4的完全RPMI培养基中培养7天，以诱导其分化为不成熟树突状细胞（iDCs）（图1A）。第1天时，细胞体积较小，呈球形。在第3天更换新鲜培养基前用PBS洗涤，有助于细胞形成聚集体，并增加CD11c+细胞的比例。第4天时，骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）体积增大，并开始形成聚集体；同时在培养板底部观察到贴壁的巨噬细胞转化为长梭形。第5天时，BMDCs形成较大规模的细胞聚集体。第6天时，可观察到大量半贴壁和悬浮生长的BMDCs。第7天收获BMDCs，并通过流式细胞术检测CD11c的表达，作为小鼠树突状细胞的特异性标志物。如图1B所示的代表性流式细胞术图谱，该方法获得的BMDCs中约有83.6%表达CD11c。
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讨论
本文描述了一种高效且可重复的实验方案，可用于生成未成熟树突状细胞（iDCs），并进一步将其分化为耐受性树突状细胞（TolDCs）。我们建议该方案可用于评估新型分子靶向药物诱导TolDC表型的能力。如本报告所述，我们采用以下流程：首先通过流式细胞术分析TolDC表面配体的表达，随后利用qRT-PCR和ELISA检测DC的细胞因子谱型。最后，通过验证TolDC抑制T细胞增殖的能力，确认其免疫调节功能。 体外 及其在体内抑制自身免疫的疗效，使用多发性硬化症的临床前小鼠EAE模型。
在我们的实验方案中，未成熟树突状细胞（iDCs）由小鼠骨髓前体细胞在GM-CSF和IL-4联合诱导下生成并分化。其他方案则在培养基中使用类似酪氨酸激酶3配体（Flt3L）来生成iDCs44。尽管使用Flt3L可提高iDCs的产量，但这些iDCs通常需要更长的培养时间（9天）才能收获，而使用GM-CSF/IL-4则仅需7天44。更重要的是，由Flt3L生成的iDCs通常会分化为cDCs（CD8
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致谢
我们感谢Reata Pharmaceuticals提供了CDDO-DFPA。同时感谢Jane和Lee Seidman儿科癌症创新讲席（John Letterio）的支持。本研究得到了美国国防部[W81XWH-12-1-0452]、凯斯综合癌症中心Angie Fowler青少年与年轻成人癌症研究计划以及F.J. Callahan基金会授予Hsi-Ju Wei的Callahan研究生学者奖的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | 自行合成 | 细胞培养 |
| 小鼠 GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | 骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化 |
| 小鼠 IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | 骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化 |
| 脂多糖（LPS） | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | 细胞培养 |
| β-巯基乙醇 | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | 细胞培养 |
| 百日咳毒素（PTX） | R&D systems | 3097 | EAE 诱导 |
| MOG (35–55) 肽段 | 21stCentury Biochemicals | 自行合成 | EAE 诱导 |
| 台盼蓝 | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | 细胞培养 |
| RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺） | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | 细胞培养 |
| 非必需氨基酸（100X） | ThermoFisher Scientific | 11140050 | 细胞培养 |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | 细胞培养 |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 细胞培养 |
| 40 μm 细胞筛 | Corning | 352340 | 细胞分离 |
| PE 标记 CD80 抗体 | BD Biosciences | 557227 | 流式细胞术 |
| PE 标记 CD86 抗体 | BD Biosciences | 555665 | 流式细胞术 |
| PE 标记 PD-L1 抗体 | BioLegend | 124307 | 流式细胞术 |
| APC 标记 MHCII 抗体 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | 流式细胞术 |
| APC 标记 CD11c 抗体 | BD Biosciences | 340544 | 流式细胞术 |
| 同型对照 PE 抗体 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | 流式细胞术 |
| 同型对照 APC 抗体 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | 流式细胞术 |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T 细胞增殖实验 |
| 泛树突状细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T 细胞增殖实验 |
| FcR 封闭试剂 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T 细胞增殖实验 |
| 泛树突状细胞生物素标记抗体混合物 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T 细胞增殖实验 |
| 抗生物素微珠 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T 细胞增殖实验 |
| CD4+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T 细胞增殖实验 |
| CD4+ T 细胞生物素标记抗体混合物 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T 细胞增殖实验 |
| 抗生物素微珠 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T 细胞增殖实验 |
| ACK 裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | A1049201 | 骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化 |
| 1 ml 注射器 | BD Biosciences | 309626 | T 细胞增殖实验 |
| 3 ml 注射器 | BD Biosciences | 309588 | 骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化 |
| 25G 针头 | BD Biosciences | 309626 | T 细胞增殖实验 |
| 23G 针头 | BD Biosciences | 309588 | 骨髓来源树突状细胞（BMDC）分化 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T 细胞增殖实验 |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T 细胞增殖实验 |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T 细胞增殖实验 |
| 分离前过滤器 | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T 细胞增殖实验 |
| 胶原酶 D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T 细胞增殖实验 |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T 细胞增殖实验 |
| 卵清蛋白（OVA）肽段 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T 细胞增殖实验 |
| 小鼠 IFN-γ TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| 小鼠 IL-12a TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| 小鼠 IL-12 p70 DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| 小鼠 EDN-1 ELISA 试剂盒 | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| 小鼠 TNF-α Quantikine ELISA 试剂盒 | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| 小鼠 IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒 | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| 小鼠 IL-23 DuoSet ELISA 试剂盒 | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan 探针 | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| 抗血红素氧合酶 1 抗体 | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| 抗-β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur 细胞分析仪 | BD Biosciences | 流式细胞术 |
参考文献
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Inaba, K., et al.
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