免疫刺激性剂评价: 淋巴组织提取与注射路径依赖性树突状细胞活化

摘要

在 immunostimulating 纳米材料治疗后, 对淋巴组织进行后续提取实验, 以检测淋巴树突状细胞活化。

摘要

为评估一种新的免疫治疗药物或疫苗接种, 分析淋巴组织中的免疫细胞活化是必不可少的。在这里, 我们研究了一种新的脂质 DNA immunostimulant 在纳米粒形态中的免疫效应, 从小鼠的不同管理途径: 口服, 鼻腔, 皮下, 都安, 腹腔和静脉。这些注射将直接影响免疫反应, 收获淋巴组织和分析的树突状细胞 (DC) 激活的组织是这些评价的关键部分。纵隔淋巴结的提取 (mLNs) 是重要的, 但由于该器官的大小和位置而相当复杂。本文介绍了用流式细胞仪采集腹股沟淋巴结 (iLN)、mLN 和脾脏的逐步过程, 并分析了直流活化的方法。

引言

免疫学和纳米材料的进步导致了大量的潜在的新的治疗策略应用于生物医学, 包括药物的传递和免疫刺激。优化管理路径是影响免疫刺激性剂疗效的重要方面。由 dna 组成的免疫刺激性纳米粒子 (相) 是一种新研制的纳米免疫佐剂, 自组装而成, 其两亲性结构为脂 dna¹。因此, 涉及在体内通过不同途径管理物质¹的方案, 以及三种采集适当组织的程序, 如腹股沟淋巴结 (iLN)、纵隔 LN (mLN) 和脾脏, 都是描述。最后, 对这些组织进行了树突状细胞 (DC) 活化、免疫系统中功能最强的抗原呈现细胞的分析。该协议也可用于评估抗原, 抗体, 或其他免疫佐剂²。 

我们测试了它的配方, 因为它是一个显示了巨大的承诺的代理。核核是一种类似于收费的受体 9 (TLR9) 佐剂材料, 含有核酸, 对免疫刺激疗效的评估需要测试不同的注射方法³。在这种情况下, 对 DCs 的刺激是体内评价的一个有效端点。在抗原或免疫刺激性分子由 DCs 吞噬的外围组织或血液, 这些细胞迁移到淋巴器官, 如脾脏和 LNs^4,5。因此, 对注射动物的脾脏、iLN 和 mLN 进行了 DC 活化分析。因此, 适当地收割这些组织对评估免疫应答的新的佐剂或病原体也是至关重要的⁵。这种组织收获对于开发一种新的免疫方法作为癌症治疗也很重要。此外, 该议定书可用于验证其他药物的效率, 如抗人体免疫机能丧失病毒疗法⁶。

方案

所有实验程序, 包括动物处理, 牺牲和器官隔离都严格按照国际动物保育和使用委员会的规则, 在上海公共卫生临床中心和峨山医疗中心。《研究议定书》获得了上海市公共卫生临床中心 (小鼠协议号: SYXK-2010-0098) 和峨山医疗中心 (2016-02-168) 的动物实验伦理学委员会的批准。

1. 材料的制备

注: 一种纳米佐剂, 由自组装的脂质 DNA 载体组成, 即 U4T 和含有寡核苷酸的 CpG-eCpG, 在目前的研究中被使用, 用于测试小鼠免疫治疗和疫苗接种的适当注射途径².重要的是, 其他潜在的治疗分子, 如抗原, 抗体, 佐剂, 可以替代的, 并测试使用相同的方法如下所述。

1. ^2、4、7
   1. 退火 U4T (160 µM, 载体) 与 eCpG (80 µM, 包含 TLR9 激动剂序列) 存在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 和氯化镁₂ (2 毫米)。标准的退火量是在50和110µL 之间的 PCR 管。加热混合物到95°c 10 分钟, 然后慢慢冷却 (1 °c/16 分钟) 到25°c 使用 thermocycler。退火协议要求大约2小时。
      注意: U4T-containing 液体非常泡沫, 必须小心处理。
   2. 使50µL 整除数的制备;使用50µL 的材料, 每次注射。
      注: 在每次注射100µL 的情况下, 重复步骤 1.1, 适当地计算配料。

2. 一般动物程序

注: 处理小鼠的替代方法可根据实验室要求和批准的动物协议⁸使用。使用的老鼠类型是6周大的 C57BL/6 和雌性小鼠。

1. 材料一览表
   1. 准备液体麻醉剂 (异氟醚), 麻醉机, 二氧化碳 (CO₂) 吸入室, 消毒纱布, 镊子, 小鼠抑制剂, 手套, 钩钳, 1 英寸解剖剪刀, 2 英寸解剖剪刀, 酒精杀菌和胰岛素注射器。
2. 吸入麻醉
   注: 麻醉是强制性的鼻腔, 皮下, 都安和静脉注射的小鼠⁹。一个感应室与蒸发器机器和氧气罐连接用于这个做法。
   1. 把动物放在感应室里, 确保紧紧地关上盖子。
   2. 以1升/分的氧气流, 将蒸发器设置设置为异氟醚的感应水平为4%。
   3. 根据动物的体重改变室内动物的暴露时间;然而, 超过十年代的暴露和监测每5分钟是必要的麻醉¹⁰。
      注意: 没有踏板反射表明成功的麻醉。
   4. 关闭异氟醚电感, 流动1升/分钟氧气, 防止人员接触异氟醚气体。
3. 牺牲
   1. 根据 NIH "使用二氧化碳的啮齿类动物安乐死指南"¹¹, 为₂吸入性牺牲准备一个分庭。
4. 测试的插科打诨反应, 以确认动物是完全牺牲。
   1. 通过捏住脚尖并确认没有任何插科打诨反应, 验证鼠标是否被正确地牺牲了。如果有响应, 请重复步骤2.2。
5. 消毒
   1. 用酒精喷雾和消毒纱布消毒所有用于注射或解剖的表面区域。
6. 器官存贮
   1. 使用镊子去除所有的脂肪和血液周围的收获器官。将这些收获的组织单独存放在培养皿中, 填充3毫升 PBS。容器和介质可能会因后续过程要求而异。

3. 注塑路线

1. 使用六注射方法来调查注射依赖性免疫应答: 口腔, 鼻腔, 皮下, 都安, 腹腔, 和静脉注射^8,12,13。

4. 淋巴结和脾脏的分离

注: 使用年轻和健康的瘦老鼠 (6 周大) 为这些程序, 因为脂肪, 通常建立在周围的淋巴结在老鼠是很难删除, 并可以防止适当的可视化的器官。

1. 收割前步骤
   注: 本节描述了 iLN、脾脏和 mLN 从小鼠注射后的免疫刺激分析。请参阅步骤 2.3-2.5 为牺牲, 插科打诨反应和消毒方法。
   1. 将鼠标的四肢钉在手术泡沫板上, 用70% 乙醇消毒鼠标的腹侧。
   2. 选择一个位置2厘米以上的生殖器, 并使用钩钳拉起外皮盖像一个帐篷。在这个位置做一个大约1厘米的切口, 并在皮肤下面滑动剪刀 (2 英寸), 进行进一步的解剖切口。
   3. 对于外壳, 用剪刀 (2 英寸) 的双臂从外层皮肤垂直切开。用腹膜暴露内脏。
   4. 把皮肤的外层钉住。
2. 腹股沟淋巴结的分离 (iLN)
   1. 找到腿左侧的 iLN, 沿着左腿向下的血管的连接, 显示为倾斜字母 ' Y '。
      注: 对于皮下注射的小鼠, 选择注射部位同一侧的 iLN。
   2. 用两个钳揭开层, 撕裂覆盖的脂层, 收获淡黄色 iLN (豆状, 2 毫米)。有关组织的后续处理和存储, 请参见步骤2.6。
3. 脾脏的分离¹⁴
   1. 一方面用钩钳在腹膜中心做一个帐篷, 另一方面用小剪刀 (1 英寸) 来切开腹膜。
   2. 用钩钳在左手抓住肚腑并且翻转它发现红色豆象脾脏 (大约14毫米的长度) 附上到老鼠腹部的左上侧。
   3. 用另一组钳子轻轻拔出脾脏, 同时用钩形钳分离其他器官。按照步骤2.6 储存脾脏。
      注意: 在收获脾脏时需要注意, 因为它是一种容易受损的软器官。
4. 纵隔淋巴结的分离 (mLN)
   注: mLN 位于肋骨下方约1厘米处, 由心脏和肺部等其他器官覆盖。由于其位置和体积小, 重要的是要小心暴露周围地区使用钳和剪刀 (1 英寸)。
   1. 切开隔膜, 把它从肋骨上取下。用镊子按住肋骨的身体, 然后用剪刀 (1 英寸) 切开肋骨的左、右侧。将切除后的肋骨固定在鼠标的肩上, 在右侧露出心脏和肺部。
      注意: 小心不要切断心脏和肺部周围的任何血管, 因为泄漏的血液使得很难找到微小的半透明 mLN。如果任何血管被切割, 用纱布轻轻地吸收该区域的血液。
   2. 使用钩钳在右手, 轻轻翻转心脏和肺部的权利, 直到骨干暴露。使用左手的一对常规钳, 用右手钩钳取出 iLN, 以协助收割。
   3. 抓住肺部, 翻转, 直到骨干广泛暴露。mLN (一个半透明的豆状结构大约2毫米大小) 位于肺和脊柱之间。
   4. 利用钩钳暴露周围的 mLN 和其他钳提取的组织。
      注: mLN 周围有许多其他组织, 必须在收割前用镊子小心取出。
   5. 有关存储收获的 mLN 的说明, 请参阅步骤2.7。

5. 流式细胞仪样品的制备

注: 为检测 iLN、脾、mLN 中 DCs 的活化, 这些组织的单细胞悬浮液被荧光共轭抗体染色, 为 DC 特异标记物、共刺激分子和主要组织相容性复合物。分子和流式细胞仪分析。

1. 单细胞悬浮液的制备: 脾脏
   1. 将5毫升新鲜培养基 (厘米) 加入6毫米培养皿中, 将样品放在冰上。
   2. 清除周围的血液和脂肪组织, 并将组织放在培养皿的盖子上。
   3. 用弯剪刀将组织切成小块 (< 1 毫米)。在 PBS 中暂停片段, 然后用离心机在 646 x g处旋转5分钟并除去上清液。
   4. 在3毫升的 CM 中再次悬浮样品, 并以200µL 的2% 胎牛血清 (血清) 的溶液为20分钟, 消化这些片段。
   5. 轻轻摇动和孵化样品在37°c 1 小时, 通过尼龙网 (100 nm) 过滤消化组织, 并将其旋转。清洗5毫升 PBS 中的单细胞, 并通过离心去除上清液。
   6. 在5毫升细胞隔离溶液中重新悬浮细胞。重新加载另一层5毫升的透明细胞隔离溶液, 形成一层水层堆叠。
   7. 离心机的细胞准备在 2012 x g 10 分钟获得上清, 这是较轻的密度分数 (< 1.077 克/厘米³), 为后续流式细胞术分析。
   8. 计算具有 hemocytometer 的单元格数。
2. 单细胞悬浮液的制备: 淋巴结
   1. 按照步骤 5.1. 1-5. 1.2。
   2. 用10毫升的吸管添加5毫升的 CM, 吹打3-4 次将细胞悬浮。在彻底悬浮细胞后, 使用无菌尼龙网过滤细胞以收集15毫升锥形管。
   3. 以 646 xg为7分钟, 在4摄氏度处旋转细胞, 取出上清。
   4. 添加一个额外的5毫升厘米到10毫升吸管, 以更好地暂停细胞通过吹打。
   5. 用 PBS 清洗并计数细胞数。
3. 流式细胞仪分析
   1. 整除 0.5-1 x 10⁶细胞进入每个荧光活化细胞分选 () 管。
   2. 离心机在 646 x g在4°c 5 分钟和吸入上清。
   3. 添加5µL 的稀释荧光-共轭抗体制备细胞, 以重新悬浮细胞颗粒和漩涡。
      注意: 重要的是要尽可能多地屏蔽细胞颗粒, 因为荧光标记的抗体是光敏的。生成抗体主组合, 并始终添加 Fc 块。
   4. 使用100µL 的 PBS, 1% 的热灭活常规的血清和0.1% 叠氮化钠, 制备出该缓冲器。
   5. 把样品放在管子里4摄氏度, 30 分钟. 用2-4 毫升的流化器缓冲器冲洗细胞, 将样品在 1700 rpm 处以7摄氏度为4分钟。
   6. 在黑暗中, 在500µL 中重新悬浮细胞。用流式细胞仪分析细胞。

结果

为评价 CD11c 在淋巴组织 dc 活化中的合适注射途径, 将 dc 种群作为谱系定义为^-脾 、iLN、mLN 中的多细胞, 并分析了共刺激分子的表达水平。经皮下 (南卡罗来纳州) 和静脉注射 (静脉注射) 注射治疗, 促进了脾脏和 iLN DCs 中 CD40、CD80 和 CD86 表达的大幅增加 (图 2B和2C)。与 PBS 治疗的控制相比, 都安和腹腔 (ip) 注射的对 CD40、CD80 和 CD86 在脾脏和 iLN DCs 中的表达水平也有相当大的调节 (图 2B和2C)。在受刺激的 mLN DCs 中, 经鼻腔 (i.n.) 注射液的注射, 促进了协同刺激分子的最高调节与 PBS 治疗的控制 (图 2D

讨论

通过药物传递和免疫刺激的治疗研究, 纳米技术和免疫学取得了许多进展。仔细选择注射方法对免疫刺激是很重要的, 这是目前研究的重点。

对一种天然无毒和可生物降解的基于 DNA 的材料 (免疫刺激性纳米粒子) 进行了不同的注射路线评估, 以确定哪条路线取得了最佳结果。这种方法也适用于提供其他治疗药物, 包括抗体, 抗原, 或其他佐剂。

为了分析这种注射的免疫反应, 需要进行淋巴组织 (脾脏、iLN 和 mLN) 的收获。淋巴组织的分离是本议定书最关键的方面, 需要使用以前未详细描述的技术。此外, 为进一步分析免疫细胞而制备单细胞悬浮液还没有得到很好的描述。本研究的重点是提取淋巴组织, 特别是 iLN, mLN, 脾, 以分析 DC 活化。免疫反应的系统性激活主要发生在脾脏的免疫细胞中。此外, 在特定组织的免疫应答是由附近的淋巴结控制的。应该对新近开发的免疫调节分子进行评估, 以确定分子是否能诱导组织中的免疫刺激。因此, 淋巴组织分离的方法和对组织中 DC 活化的分析可以用于新开发的免疫刺激分子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
磷酸盐缓冲盐水	康宁	21-040-CVR	洗涤器官
（PBS，pH 7.4）
异氟醚溶液	Aesica Queenborough limited	26675-46-7	麻醉过程
结核菌素 1mL 注射器 -	Junglim	N/A	注射
50 mL 锥形管	S.P.L	50050	麻醉过程
1mL 胰岛素注射器	（BD Ultra-FineTM­II）_short针	324826	注
DMEM 高糖	海克隆	SH30081.01	储存器官
组织图透明	Sigma-Aldrich	10771	FACS 分析
无水乙醇 99.5 %	大中	4022-4110	消毒剂
设备
FineCycler C100 （热循环仪）	不锈钢		退氧
离心机
FACS 管	FALCON	2052	FACS 分析
自动高性能流式细胞仪	BD（美国），FACSVerse-FACS		分析