在给予免疫刺激性纳米材料处理后，描述了后续提取淋巴组织以检测淋巴样树突状细胞活化的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
为了评估一种用于免疫治疗或疫苗接种的新治疗剂，对淋巴组织中免疫细胞活化的分析至关重要。本文研究了以纳米颗粒形式存在的新型脂质-DNA 免疫刺激剂在小鼠中通过不同给药途径（口服、鼻内、皮下、足垫、腹腔和静脉注射）所产生的免疫学效应。这些注射方式会直接影响免疫反应，而获取淋巴组织并分析其中树突状细胞（DC）的活化状态是此类评估的关键环节。纵隔淋巴结（mLN）的提取因该器官的大小和位置而显得尤为重要且较为复杂。本文详细描述了一种分步获取腹股沟淋巴结（iLN）、纵隔淋巴结（mLN）和脾脏，并通过流式细胞术分析 DC 活化状态的操作流程。
引言
免疫学和纳米材料领域的进步已催生出大量潜在的新型治疗策略，可用于生物医学领域，包括药物递送和免疫刺激。给药途径的优化是影响免疫刺激剂疗效的关键因素之一。一种由DNA组成的免疫刺激性纳米颗粒（INP）是一种新开发的纳米免疫佐剂，其通过脂质-DNA的两亲性结构引发微相分离而自组装形成1。因此，本文描述了通过不同途径将该材料1 in vivo给药的INP操作方案，以及三种获取适当组织（如腹股沟淋巴结（iLN）、纵隔淋巴结（mLN）和脾脏）的程序。最后，对这些组织中的树突状细胞（DC）活化情况进行分析，树突状细胞是免疫系统中最强大的抗原呈递细胞。该方案也可用于评估抗原、抗体或其他免疫佐剂2。
我们测试了INP制剂，因为它是一种具有良好前景的试剂。INP是一种含核酸的Toll样受体9（TLR9）佐剂材料，需评估其免疫刺激效能，以验证不同注射方法的效果3在此背景下，树突状细胞（DCs）的刺激是一个强有力的终点指标 体内 评估。当抗原或免疫刺激分子被外周组织或血液中的树突状细胞（DCs）吞噬后，这些细胞会迁移至脾脏和淋巴结等淋巴器官4,5因此，需分析注射动物脾脏、iLN 和 mLN 中的 DC 活化情况。正确采集这些组织对于评估新型佐剂或病原体的免疫应答也至关重要5此类组织采集对于开发新型免疫学方法作为癌症治疗手段也具有重要意义。此外，本方案还可用于验证其他药物（如抗人类免疫缺陷病毒药物）的疗效。6.
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方案
所有实验操作，包括动物处理、处死和器官分离，均严格遵循上海公共卫生临床中心和峨山医学中心国际动物护理与使用委员会的规定进行。本研究方案已获得上海公共卫生临床中心动物实验伦理委员会（小鼠实验许可编号：SYXK-2010-0098）和峨山医学中心（2016-02-168）的批准。
1. 材料准备
注意：本研究采用了一种由自组装脂质-DNA载体U4T和含CpG基序的寡核苷酸eCpG组成的纳米佐剂INP，用于测试在小鼠中进行免疫治疗和疫苗接种的合适注射途径2。重要的是，其他潜在的治疗分子，如抗原、抗体和佐剂，可替代INP，并使用下述相同的方法进行测试。
- INP 制剂2,4,7
- 在 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 MgCl2（2 mM）存在下，将 U4T（160 µM，载体）与 eCpG（80 µM，含 TLR9 激动剂序列）退火。退火的标准体积为 50 至 110 µL，置于 PCR 管中。使用热循环仪将混合物加热至 95 °C 持续 10 分钟，然后缓慢冷却（1 °C/16 分钟）至 25 °C。退火程序约需 2 小时。
警告：含 U4T 的液体极易起泡，必须小心操作。 - 将 INP 制备物分装为每份 50 µL；每次注射使用 50 µL 材料。
注意：若每次注射需 100 µL，则应按照适当计算重新进行步骤 1.1。
- 在 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和 MgCl2（2 mM）存在下，将 U4T（160 µM，载体）与 eCpG（80 µM，含 TLR9 激动剂序列）退火。退火的标准体积为 50 至 110 µL，置于 PCR 管中。使用热循环仪将混合物加热至 95 °C 持续 10 分钟，然后缓慢冷却（1 °C/16 分钟）至 25 °C。退火程序约需 2 小时。
2. 动物实验通用操作规程
注意：可根据实验室要求和批准的动物实验方案采用不同的小鼠操作方法8。所使用的小鼠为6周龄C57BL/6品系雌性小鼠。
- 材料清单
- 准备液态麻醉剂（异氟烷）、麻醉机、二氧化碳（CO2) 吸入室、灭菌纱布、镊子、小鼠固定器、手套、弯头镊、1英寸解剖剪、2英寸解剖剪、用于消毒的酒精以及胰岛素注射器。
- 吸入麻醉
注意：对小鼠进行鼻内、皮下、足垫及静脉注射时，必须实施麻醉9。本操作使用连接有挥发器和氧气瓶的诱导室。- 将动物放入诱导室，并确保盖子紧密关闭。
- 以1 L/min的流速通入氧气，并将挥发器设定为4%的异氟烷诱导浓度。
- 根据动物体重调整其在诱导室内的暴露时间；但至少需暴露10秒以上，并每5分钟监测一次麻醉状态10。
注意：无足底反射表明麻醉成功。 - 关闭异氟烷诱导装置，继续以1 L/min流速通入氧气，以防止操作人员接触异氟烷气体。
- 安乐死
- 按照美国国立卫生研究院（NIH）"使用二氧化碳对啮齿类动物实施安乐死的指南"11准备用于CO2吸入法安乐死的密闭室。
- 测试咽反射以确认动物已完全死亡。
- 通过夹捏小鼠足尖并确认无咽反射来验证其是否已正确实施安乐死。若存在反应，则重复步骤2.2。
- 消毒
- 使用酒精喷雾和灭菌纱布对所有用于注射或解剖的表面区域进行消毒。
- 器官储存
- 使用镊子去除所采集器官周围的所有脂肪和血液。将这些采集的组织分别存放于含有3 mL PBS的培养皿中。容器和保存液可根据后续实验要求有所不同。
3. 注射途径
- 采用六种注射方法研究与注射途径相关的免疫反应：口服、鼻内、皮下、足垫、腹腔和静脉注射8,12,13。
4. 淋巴结和脾脏的分离
注意：应使用年轻且健康的瘦型小鼠（6周龄）进行这些操作，因为老年小鼠淋巴结周围通常会积聚脂肪，难以清除，可能影响器官的清晰观察。
- 收获前步骤
注意：本节描述了从小鼠中收获注射后腹股沟淋巴结（iLN）、脾脏和纵隔淋巴结（mLN）的步骤，用于分析免疫刺激。有关处死、gag反应及消毒方法，请参见步骤2.3-2.5。- 将小鼠四肢用大头针固定于手术泡沫板上，并用70%乙醇对小鼠腹侧进行消毒。
- 选择距生殖器区域上方约2 cm处，使用弯头镊子将外层皮肤向上提起呈帐篷状。在此位置做约1 cm切口，将剪刀（2英寸）插入皮下并继续剪开组织。
- 对于皮肤组织，使用剪刀双臂（2英寸）垂直剪开外层皮肤，暴露被腹膜覆盖的内脏器官。
- 将外层皮肤用大头针固定。
- 腹股沟淋巴结（iLN）的分离
- 在腿部左侧沿左后肢下行血管的分叉处（呈倾斜的“Y”形）定位iLN。
注意：对于皮下注射的小鼠，应选择与注射部位同侧的iLN。 - 使用两把镊子分离组织层，撕开覆盖的脂肪层，收获呈浅黄色、豆状、长约2 mm的iLN。后续组织处理与保存方法见步骤2.6。
- 在腿部左侧沿左后肢下行血管的分叉处（呈倾斜的“Y”形）定位iLN。
- 脾脏的分离14
- 一手使用弯头镊子在腹膜中央提起形成帐篷状，另一手持小而细的剪刀（1英寸）剪开腹膜。
- 左手持弯头镊子抓住肠道并翻转，以定位附着于小鼠腹部左上方、形似红芸豆的脾脏（长约14 mm）。
- 右手使用另一把镊子轻轻拉出脾脏，同时用弯头镊子分离周围其他组织。脾脏的保存方法见步骤2.6。
注意：脾脏为柔软易损器官，收获时需格外小心。
- 纵隔淋巴结（mLN）的分离
注意：mLN位于肋骨下方约1 cm处，被心脏和肺等器官覆盖。由于其位置较深且体积较小，需使用镊子和剪刀（1英寸）仔细暴露周围区域。- 剪开膈肌并将其从肋骨分离。用镊子夹住肋骨部分，再用剪刀（1英寸）剪开左右两侧肋骨。将切断的肋骨翻折至小鼠右肩上方，以暴露心脏和肺。
注意：操作时需避免切断心脏和肺周围的血管，否则血液渗出会严重影响透明微小的mLN的定位。若发生出血，可用纱布轻轻吸除局部血液。 - 右手持弯头镊子将心脏和肺轻轻向右翻转，直至脊柱充分暴露。左手持普通镊子，在右手弯头镊子协助下完成mLN的收获。
- 抓住肺组织并翻转，直至脊柱区域广泛暴露。mLN（透明、豆状结构，大小约2 mm）位于肺与脊柱之间。
- 使用弯头镊子暴露mLN周围区域，另一把镊子用于取出组织。
注意：mLN周围存在多种其他组织，收获前需用镊子小心去除。 - mLN收获后的保存方法见步骤2.7。
- 剪开膈肌并将其从肋骨分离。用镊子夹住肋骨部分，再用剪刀（1英寸）剪开左右两侧肋骨。将切断的肋骨翻折至小鼠右肩上方，以暴露心脏和肺。
5. 流式细胞术样品的制备
注意：为了检测收获的iLN、脾脏和mLN中树突状细胞（DC）的活化情况，需将这些组织的单细胞悬液用荧光标记的抗体进行染色，抗体针对DC特异性标志物、共刺激分子以及主要组织相容性复合体分子，随后通过流式细胞术进行分析。
- 单细胞悬液制备：脾脏
- 向6 mm培养皿中加入5 mL新鲜培养基（CM），并将样品置于冰上。
- 去除周围的血液和脂肪组织，将组织置于培养皿盖内。
- 用弯头剪刀将组织剪成小片段（<1 mm），用PBS重悬后，以646 × g离心5 min，弃上清。
- 再次将样品重悬于3 mL CM中，加入200 µL含胶原酶IV的2%胎牛血清（FBS）溶液，消化20 min。
- 轻轻振荡并在37 °C孵育1 h。将消化后的组织通过尼龙滤网（100 nm）过滤，离心收集细胞。用5 mL PBS洗涤单细胞，离心弃上清。
- 将细胞重悬于5 mL细胞分离液中。再加入一层5 mL透明的细胞分离液，形成水相分层结构。
- 以2012 × g离心10 min，收集上清液，即为低密度组分（<1.077 g/cm3），用于后续流式细胞术分析。
- 用血细胞计数板计数细胞数量。
- 单细胞悬液制备：淋巴结
- 按照步骤5.1.1–5.1.2操作。
- 用10 mL移液器加入5 mL CM，吹打3–4次使细胞充分悬浮。将细胞悬液通过无菌尼龙滤网过滤，收集至15 mL离心管中。
- 在4 °C下以646 ×g离心7 min，弃上清。
- 再用10 mL移液器加入额外5 mL CM，通过吹打使细胞更好地重悬。
- 用PBS洗涤细胞并计数。
- 流式细胞术分析
- 将0.5–1 × 106个细胞分装至每支荧光激活细胞分选（FACS）管中。
- 在4 °C下以646 × g离心5 min，吸除上清。
- 向细胞中加入每种稀释后的荧光标记抗体溶液各5 µL，重悬细胞沉淀并涡旋混匀。
注意：应尽可能避免细胞沉淀暴露于光线下，因为荧光标记抗体对光敏感。建议配制抗体主混合液，并始终加入Fc阻断剂。 - 使用100 µL PBS、1%热灭活常规FBS和0.1%叠氮化钠配制FACS缓冲液。
- 将样品置于4 °C避光孵育30 min。用2–4 mL FACS缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以1700 rpm离心7 min。
- 在避光条件下将细胞重悬于500 µL FACS缓冲液中，进行流式细胞术分析。
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结果
为了评估INP在淋巴组织树突状细胞（DC）激活中的合适注射途径，将脾脏、iLN和mLN中的DC群体定义为-CD11c+细胞，并分析了共刺激分子的表达水平。通过皮下（s.c.）和静脉（i.v.）注射INP处理后，脾脏和iLN中DC的CD40、CD80和CD86表达水平显著升高（图2B和2C）。与PBS处理的对照组相比，足垫和腹腔（i.p.）注射INP也显著上调了脾脏和iLN中DC的CD40、CD80和CD86表达水平（图2B和2C）。在mLN DC中，与PBS对照组相比，鼻内（i.n.）注射INP对共刺激分子的上调作用最为显著（图2D）。i.p.和i.v.注射INP也在mLN中诱导...
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讨论
通过药物递送和免疫刺激的治疗研究，纳米技术和免疫学领域已取得诸多进展。众所周知，注射方法的谨慎选择对于免疫刺激至关重要，这也是本研究的重点。
评估了不同注射途径对一种天然无毒且可生物降解的基于DNA的材料INP（免疫刺激性纳米颗粒）的效果，以确定哪种途径能产生最佳结果。该方法也适用于递送其他治疗剂，包括抗体、抗原或其他佐剂。
为了分析对这类注射的免疫应答，需要采集淋巴组织（脾脏、肠系膜淋巴结[iLN]和肠系膜淋巴结[mLN]）。淋巴组织的分离是本实验方案中最关键的步骤，且需要使用一种此前尚未详细描述过的技术。此外，制备用于进一步分析免疫细胞的单细胞悬液的方法也未被充分阐明。本研究重点在于提取淋巴组织，特别是iLN、mLN和脾脏，以分析树突状细胞（DC）的活化情况。全身性免疫应答主要通过脾脏中的免疫细胞介导。此外，特定组织的局部免疫应答则由邻近的淋巴结调控。对于新开发的免疫调节分子，应评估其是否能够在组织中诱导免疫刺激作用。因此，该淋巴组织分离方法及组织中DC活化分析技术可用于评估新开发的免疫刺激分子。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过创意材料发现计划资助，该计划由韩国科技、信息通信和未来规划部资助（NRF-2017M3D1A1039421），并由韩国海洋水产部资助的海洋生物技术计划及一项拨款（20150220）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CVR | 器官清洗 |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| 异氟烷溶液 | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | 麻醉过程 |
| 1 mL 结核菌素注射器 - | Junglim | N/A | 注射 |
| 50 mL 锥形管 | S.P.L | 50050 | 麻醉过程 |
| 1 mL 胰岛素注射器 | (BD Ultra-FineTMII)_短针 | 324826 | 肌肉注射 |
| DMEM 高糖培养基 | Hyclone | SH30081.01 | 器官保存 |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS 分析 |
| 无水乙醇 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | 消毒剂 |
| 设备 | |||
| FineCycler C100（热循环仪） | Ssufine | - | 退火 |
| 离心机 | 离心 | ||
| FACS 管 | FALCON | 2052 | FACS 分析 |
| 自动化高性能流式细胞仪 | BD (USA), FACSVerse | - | FACS 分析 |
参考文献
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