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允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

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DOI：

10.3791/57643

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2018年5月12日

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1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

本文内容

摘要

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。

摘要

研究蛋白质的时空动态可以揭示其在不同背景下的功能重要性。本文讨论了如何利用光漂白后荧光恢复（FRAP）和光激活技术来研究蛋白质在亚细胞区域的时空动态。我们还展示了这些技术如何能够简便地测定与肌动蛋白细胞骨架调控及细胞运动性相关的多种参数。此外，本文进一步描述了细胞显微注射作为一种替代处理方法（可能在前述光操控技术之前或同时进行），以触发转位蛋白对细胞形态和功能的即时效应。诸如蛋白质注射或局部施加细胞膜通透性药物或细胞骨架抑制剂等显微操作手段，可作为强大工具，用于记录特定处理对单个细胞及亚细胞水平上细胞行为的即时影响。本文以注射重组Rac1蛋白后立即诱导片状伪足边缘突起为例，该现象早在二十五年前即已确立。此外，我们提供了一项实验方案，用于测定增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-VASP的周转率，该蛋白是一种肌动蛋白丝聚合酶，在B16-F1细胞的片状伪足尖端显著富集，实验采用FRAP技术，并包含相应的数据分析与曲线拟合方法。我们还提供了估算片状伪足中肌动蛋白网络聚合速率的指导原则，以表达EGFP标记的β-actin的细胞为例进行说明。最后，本文给出了如何利用光激活方法研究细胞质中肌动蛋白单体的移动速率及其在快速纤维组装位点（如突出的片状伪足尖端）整合过程的指导步骤。这些方案均 不仅限于肌动蛋白细胞骨架的组分或调控因子，还可轻易扩展应用于以类似方式探究各种不同亚细胞结构或功能背景下蛋白质的时空动态与功能。

引言

监测活细胞中蛋白质及其他分子的时空动态已成为细胞生物学和分子生物学多个领域的基本工具。先进的荧光显微技术，包括荧光共振能量转移（FRET）和FRET-荧光寿命成像（FRET-FLIM），以及光漂白后荧光恢复（FRAP）、光漂白过程中的荧光丢失（FLIP）和光激活等技术，以及其他多种方法，能够实现对蛋白质-蛋白质相互作用、构象变化以及细胞内不同蛋白质扩散和定位动力学的时空追踪1，2。特别是FRAP和光激活技术，广泛适用于研究肌动蛋白细胞骨架和细胞迁移的调控因子。这些技术可单独使用，也可与其他微操作技术（如显微注射3）结合使用，并涉及荧光标记蛋白的表达。它们可用于估算蛋白质与富含肌动蛋白的结构（如丝状伪足或片状伪足）结合的动力学过程、局灶性黏附4或分支状肌动蛋白网络5中蛋白质的更新速率。此外，这些技术还可用于测定片状伪足中肌动蛋白聚合速率、评估单体肌动蛋白在细胞质中的扩散情况，以及测定亚细胞内单体肌动蛋白向突出片状伪足中正在聚合的肌动蛋白丝转运的速率6等其他参数。

FRAP 是一种用于在活细胞内可视化并定量蛋白质移动性的方法，最初由 Axelrod 于 20 世纪 70 年代开发7。在细胞内选择一个感兴趣区域（ROI），该区域含有荧光标记的蛋白质，短暂暴露于高强度激光下，足以在给定的短时间内使该区域内存在的荧光分子发生淬灭。在淬灭期间位于 ROI 外部的未淬灭荧光标记蛋白质会根据其时空动态扩散并侵入淬灭区域，导致光淬灭分子随时间发生置换。淬灭区域中荧光恢复的速率取决于多种因素，包括特定分子的大小、扩散速率，以及其在假定相关淬灭结构中的周转速率。因此，可溶性蛋白质将通过扩散迅速介导淬灭 ROI 内荧光的恢复，而与结构（如黏着斑）紧密结合的蛋白质则具有较长的周转时间，因为其荧光恢复既依赖于蛋白质可溶部分的扩散，也依赖于与结构结合部分的解离-结合动力学。通常，荧光恢复过程会被持续采集并定量，直至达到初始淬灭前的荧光强度水平。然而，如果初始荧光强度的一部分属于所谓的不可移动组分（即无法通过扩散补充，或其补充速率远慢于构成可移动组分的大多数分子），则无法完全恢复。为了确定蛋白质周转速率，可生成 FRAP 曲线，用以表示荧光恢复程度随时间的变化。从这些恢复曲线中可计算出蛋白质恢复的平均半衰期。通过对平均 FRAP 数据进行曲线拟合，进而开展数学分析，还可以推断可移动组分的平均周转速率是否由单一均质分子群体构成，或是否由两个或多个以不同速率周转的亚群组成。除了通过定量方法估算蛋白质周转速率外，追踪伪足中光淬灭区域的恢复过程还可实现对伪足运动参数的精确定量，例如逆行流、前伸运动以及肌动蛋白聚合速率。因此，FRAP 是一种多功能工具，可用于评估活细胞内多种结构的相关参数。

光激活是一种用于追踪源自特定细胞位置的蛋白质或分子扩散与运动性的方法。该技术采用例如由Patterson和Lippincott-Schwartz最初开发的野生型绿色荧光蛋白（GFP）的一种变体8，该蛋白经过突变，使其在暴露于紫外光（UV）（约400 nm；此处为405 nm）后荧光显著增强。根据Patterson 等的描述，野生型GFP的发色团以中性酚和阴离子酚盐的混合群体存在，分别在约397 nm处产生主要吸收峰，在475 nm处产生次要吸收峰。当用紫外光照射该蛋白时，该群体发生光转化，向阴离子形式转变。在488 nm激发下，光转化/光激活的蛋白荧光增强约3倍，但由于固有的背景荧光较高，实际中不足以区分激活与未激活的GFP。然而，通过在GFP序列中引入单个氨基酸突变（第203位组氨酸取代），已实现了背景强度的降低。由此产生的T203H突变体，也称为光激活型GFP（PA-GFP），其特征是次要吸收峰的吸收显著降低，而在经紫外光照射后，再用488 nm光激发时，其吸收几乎增加100倍。因此，过表达PA-GFP标记的蛋白是一种广泛应用的方法，可用于确定分子在细胞内的扩散和运动性。我们此前曾应用PA-GFP标记的肌动蛋白来测定肌动蛋白单体从胞质区域扩散的速率，不仅可探究其在胞质中的运动性，还可测定其掺入前缘片状伪足肌动蛋白网络的速率6。近期文献还描述了新型的光转化蛋白，原则上可类似地使用，并具有在光转化前即可被观察到的潜在优势。属于此类荧光蛋白的例子包括Dendra2和mEos29,10,11,12。

本文介绍了将蛋白质显微注射入细胞的方法学。进一步阐述了如何将该技术与荧光漂白后恢复（FRAP）技术相结合，通过光漂白参与肌动蛋白细胞骨架调控和细胞运动的蛋白质，并获得FRAP恢复曲线及可移动组分的半恢复时间。此外，我们提供了一个应用FRAP技术测定片状伪足网络中肌动蛋白聚合速率的实例。我们还提供了光激活实验的操作步骤与技术要点，该实验可用于测定胞质中单体肌动蛋白的流动性以及肌动蛋白掺入片状伪足的速率。当然，这些技术不仅限于追踪肌动蛋白细胞骨架组分，经过适当调整或优化后，亦可广泛应用于其他细胞类型，或用于研究不同的蛋白质、结构和参数。

方案

1. 盖玻片清洗与灭菌

  1. 将15 mm（直径）的盖玻片（1号）浸入一个500 mL的烧瓶中，烧瓶内含有40 mL 37% HCl和60 mL 100% EtOH的混合液（每100 mL清洗液中不超过100片盖玻片）。
    注意：即使为新购买的盖玻片，在接种细胞前也必须严格清洗。这是因为盖玻片表面可能含有肉眼不可见的薄层油脂，会显著干扰活细胞的贴附和正常铺展。虽然酸或碱性溶液可有效去除此类薄膜（参见Fischer et al.13），我们常规使用上述酸/醇混合液进行处理。
  2. 将装有盖玻片的烧瓶置于旋转摇床，振摇30分钟。选择适当的转速，使盖玻片能够自由旋转，但速度不宜过快以避免频繁破裂。若需重复使用该溶液，应过滤以去除破碎的玻璃碎片。
  3. 将盖玻片转移至另一烧瓶中，加入至少200 mL无菌水，并在旋转摇床上孵育，期间反复更换水直至酸味完全消失。建议持续多次换水数小时，以彻底清除HCl-EtOH残留。
  4. 将单个盖玻片置于滤纸上干燥。
  5. 将盖玻片放置于底部铺有滤纸的10 cm（直径）培养皿中，进行干热灭菌。避免使用高压灭菌，否则会导致盖玻片粘连。

2. 细胞处理、转染及接种至盖玻片

  1. 在含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM（4.5 g/L葡萄糖）培养基中，按照标准细胞培养条件培养B16-F1小鼠黑色素瘤细胞 37 °C，7% CO₂2.
  2. 在标准细胞培养条件下（组织培养箱，37°C，5% CO₂）培养 NIH3T3 成纤维细胞用于显微注射 37 °C，7% CO₂2在含10%胎牛血清、1 mM丙酮酸钠、1× MEM非必需氨基酸、2 mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM（4.5 g/L葡萄糖）中培养。
  3. 转染时，将B16-F1细胞在10 cm培养皿中培养至100%汇合，按1:5比例传代至3 cm（直径）塑料培养皿中。
  4. 同一天，在 B16-F1 细胞贴壁至少 6 小时后，每皿转染 500 ng 光激活型 PA-GFP-actin 或 EGFP 标记的 β-actin 质粒 DNA。对于 PA-GFP-actin 与编码 mCherry 的载体共转染，混合总量为 1 µg 每3 cm培养皿中加入质粒DNA的量。
  5. 使用转染试剂对 B16-F1 细胞进行转染材料表）。对于3 cm培养皿，混合 200 µL 含500 ng DNA质粒的150 mM NaCl溶液 200 µL 含150 mM NaCl 1 µL 转染试剂（即， DNAµg):试剂 (µL1:2 的比例被使用）。
  6. 室温（RT）孵育转染混合物20分钟，然后逐滴加入含细胞的3 cm培养皿中。轻轻摇动培养皿以混匀，随后在37°C、5% CO₂培养箱中过夜孵育 37 °C，7% CO₂2.
  7. 配制含有 50 mM Tris（pH 7.4）和 150 mM NaCl 的层粘连蛋白包被缓冲液。
  8. 对于B16-F1细胞，将15 mm的盖玻片铺板进行包被 150 µL 层粘连蛋白（laminin）25 µg/mL 在层粘连蛋白包被缓冲液中）中孵育，室温下放置1小时。对于NIH3T3细胞，用纤连蛋白溶液包被盖玻片25 µg/mL 在磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育，室温下孵育1小时。
  9. 用 PBS 清洗经层粘连蛋白或纤连蛋白孵育的盖玻片，吸除 PBS，加入 2 mL 转染的细胞。
  10. 转染后第二天，将转染的 B16-F1 细胞（按融合培养皿的 1:30 比例）接种至层粘连蛋白包被的盖玻片上；将 NIH3T3 成纤维细胞（按融合培养皿的 1:20 比例）接种至纤连蛋白包被的盖玻片上。
  11. 在组织培养孵育箱中，于涂有层粘连蛋白或纤连蛋白的盖玻片上孵育细胞过夜，使其充分铺展 37 °C 显微镜观察之前。或者，如果允许细胞铺展至少2–3小时，显微镜实验也可在同一天开始。

3. 显微成像室的组装

  1. 使用导热性良好的 RC-26 铝制显微成像腔进行显微观察（图 1a）。用注射器将硅脂均匀涂抹在塑料密封圈开口的边缘（图 1b）。
  2. 将带有细胞的盖玻片细胞面朝上放置于成像腔内（图 1c）。
  3. 将塑料密封圈置于盖玻片上方，使盖玻片与成像腔之间形成严密密封。通过将滑动夹以对角方式拧紧固定在腔体上，以避免盖玻片破裂，并防止培养基泄漏（图 1d）。
  4. 用移液器将预热至 37 °C 的显微镜用培养基加入中央区域。为降低自发荧光并优化显微成像效果，可采用与上述培养基相同配方，但以 F12-HAM 代替 DMEM，并额外添加 20 mM HEPES，以便在无 CO2 条件下培养细胞（图 1e）。
  5. 将温度探头插入成像腔指定插槽，并将腔体电极连接至 TC-324B 自动温度控制器，以维持 37 °C 的恒温环境（图 1f）。
  6. 在物镜上滴加少量浸油，然后将成像腔置于其上。
  7. 将含细胞的成像腔孵育至少 10–30 分钟，使细胞从装片过程中的温度下降中恢复，并适应显微镜用培养基环境。
  8. 在开始显微观察前，应更换成像腔中央储液区的培养基（约 800 µL），以避免因培养基蒸发导致的成分和血清浓度异常。长时间开放腔体进行显微观察时，需定期更换蒸发的培养基。

4. 显微注射步骤

  1. 包被盖玻片，制备细胞，并按上述方法组装成像腔室。
  2. 解冻一份待注射的纯化蛋白样品（通常 10 µL 或更少），并用相应的显微注射缓冲液稀释。
    注意：缓冲液的组成可能因蛋白质和细胞类型而异，但需注意将pH值控制在6.95至8.00之间，并避免使用PBS，因为大多数细胞不适用于PBS注射。
  3. 用于Rac1显微注射，配制含有100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MgCl的缓冲液2，1 mM DTT。Mg2+ 离子对小GTP酶的稳定性至关重要。
    注意：蛋白质浓度通常在 0.1–1 mg/mL 之间（最高可达 2 mg/mL），具体取决于蛋白质种类、实验类型和细胞类型。
  4. 如适用，加入荧光染料，例如惰性葡聚糖（0.5 µg/mL，70 kDa）加入蛋白质溶液中，可在注射前确认针头流体的存在，并在实验结束后用于记录注射是否成功。
    注意：本实验的目的并非追踪注射的 Rac1 蛋白的动态变化，因为只有在对蛋白进行直接荧光标记的情况下才可能实现。虽然可将蛋白与荧光染料偶联或融合荧光蛋白，但本实验中避免使用此类方法，因其可能干扰蛋白的信号转导功能，尤其是对于 Rac1（20 kDa）等小分子量的 Rho 家族 GTP 酶。
  5. 以10,000 × g离心蛋白溶液至少30分钟，以去除可能堵塞显微注射毛细管针头的蛋白聚集体。
  6. 将显微注射针（显微注射毛细管）装入 1 µL 使用柔性移液器吸头/微量上样吸头从背面注入混合液。
  7. 若针尖存在气泡，应轻弹针座以去除气泡。操作应迅速，避免针尖干燥导致针头堵塞。
  8. 仔细调整显微操作装置上的持针器。若使用倒置显微镜进行相差成像，在装针前应确保有足够的空间上下移动针头，以免阻碍显微镜聚光镜。
  9. 将微毛细管拧到持针器上后，在将针尖移入细胞培养基之前，使用显微注射加压装置对针尖施加20–50 hPa的背景压力。
    注意：当针头位于培养基中时启动压力，会导致培养基因毛细作用被吸起，从而阻碍目标溶液的注入。
  10. 将针置于视野中（使用低倍物镜有助于定位）。本实验采用40倍干镜进行显微注射。
  11. 将针尖宏观上垂直于物镜中心位置放置（这将加快找到针尖的过程）。使用相差显微镜，在明显高于细胞层的光学平面上，移动针尖使其相对于视野在水平面内运动。
    注意：针头最初在视野中呈现为阴影，随后可调节焦平面以观察针尖。一旦找到针尖，逐渐降低光学平面，再将针尖缓慢下移至接近细胞层的位置。
  12. 使用荧光葡聚糖时，切换至荧光通道以检查针尖流速，并通过压力装置调节，获得稳定的“背景”流速。
    注意：本文描述的是手动注射，该方法通过针尖接触细胞表面并在持续进针流速下轻柔移动以穿透质膜来实现。此方法需与自动注射装置相区别，后者在注射过程中伴随程序化的针头下降和针头压力增加，更适合大量细胞的注射及后续细胞群体分析。本文所述方法已优化用于显微注射前后及过程中的延时显微成像单细胞分析。
  13. 找到目标细胞，并逐渐将针头移至细胞上方。
  14. 准备显微注射时，使用显微操作器操纵杆的微调齿轮，将注射针逐渐移向细胞的核周区域，同时保持细胞处于焦点清晰状态。
  15. 进行显微注射时，轻轻接触细胞的质膜，这可能足以穿透细胞；或者通过非常轻柔地敲击显微镜装置，辅助实现细胞膜的瞬时破裂。
    注意：针尖出现白色小点表明已接触细胞膜；在细胞膜破裂后，针尖会重新封闭，并伴随少量注射液轻柔地流入细胞内。
  16. 一旦观察到液体流入细胞内（理想情况下在0.3秒内），立即将针尖上移至培养基中，停止注射过程。若使用荧光标记的葡聚糖，可通过荧光信号立即确认注射是否成功。
  17. 如有需要，可在显微注射前或后启动延时成像采集。
    注意：除显微注射步骤外，此处所有步骤均可进行药物或抑制剂的局部施用 本身对于局部施用，可通过流体压力控制活性分子的扩散，并利用荧光进行记录，同时可将针尖定位在所需高度。有关局部施用实验的示例，请参见 例如， Small 和 Rottner14 或 Kaverina 等15
  18. 显微注射后，等待蛋白质效应的发生。对于不同蛋白质，根据预期结果，孵育时间可能有所不同。对于小GTP酶Rac1，片状伪足形成的反应可在1分钟或更短时间内启动，但通常需要约10–15分钟才能完全发育。图1g, h).
  19. 评估显微注射后细胞的存活率。
    注意：不恰当或有害的注射可能导致细胞损伤，常伴随非特异性的细胞边缘回缩或质膜破裂。
    1. 避免同时刺穿顶部和底部的质膜，这种情况可能在平坦细胞区域进行注射时发生。
      注意：注射体积应尽可能小（理想情况下） <细胞体积的5％），通常在飞升级别。所需注射体积也可通过浓度变化来控制，但需注意，对于蛋白质而言，浓度 >2 mg/mL 的浓度可能会因针头频繁堵塞而变得不切实际。然而，这也取决于纯化后蛋白质的质量和性质； 例如，荧光标记肌动蛋白的注射会因针尖处浓度依赖性且不可避免的聚合而变得复杂，因此如今很少采用（参见 Small 等16).
  20. 在显微注射作用之前、期间或之后，可对同一细胞进行荧光漂白后恢复（FRAP）或光激活实验（参见第5和第6节）。

5. FRAP 实验步骤

  1. 将目的细胞类型（此处为 B16-F1 细胞）转染编码荧光标记目的蛋白的质粒 DNA（此处使用 EGFP 标记的 β-actin）。将细胞接种至层粘连蛋白包被的盖玻片上（步骤 2.10）。
  2. 组装成像室（第 3 节）。
  3. 进行伪足区域光漂白时采用以下设置：65 mW 激光功率（根据实验装置和激光光源可调）；10 像素激光束直径；1 ms 漂白驻留时间/像素；500 ms GFP 曝光时间；1,500 ms 时间间隔。本文中的实验结果使用 100X 1.4NA 复消色差物镜获得。
  4. 进行激光校准，以确保光漂白区域尺寸的准确性。校准前，将视野移至无细胞或荧光信号的区域，并在显示器上观察图像。
  5. 通过点击相应的放大倍数按钮选择物镜放大倍数，并在“Panel | Intensity”菜单中降低激光功率（3–5 mW）。若要在 Visiview 软件（v2.1.4）中启动手动校准，请选择“Configure | FRAP”菜单，然后点击“Calibrate | Adjust Manual”菜单。确保激光呈现为清晰的光点；若不清晰，需重新对焦或调整激光硬件。
  6. 通过手动引导激光至软件预设的 X-Y 坐标完成校准。此步骤使软件能够针对当前放大倍数精确定位激光至用户定义的区域。
  7. 在触发激光前，切换至 GFP 通道并启动图像/时间序列采集。
  8. 在 GFP 通道中，通过观察显示器手动绘制待光漂白的区域。
  9. 在图像采集开始后至少 3–4 帧，手动触发 405 nm 激光启动光漂白。光漂白前采集若干帧图像，用于后续数据分析中的图像归一化处理。

6. 光激活步骤

注意：除激光功率外，软件、显微镜设置和参数均与 FRAP 实验类似。在光激活实验中，与 FRAP 的一个重要区别是，必须使用远低于光漂白所用强度的 405 nm 激光功率，以激活 PA-GFP 而不会同时导致其光漂白。

  1. 共转染目标细胞类型（此处为 B16-F1 细胞；见步骤 2.5）与编码 PA-GFP-肌动蛋白及另一种荧光标记蛋白的质粒 DNA例如， mCherry 或 mCherry-Lifeact
    注意：在大多数情况下，mCherry阳性细胞也会对PA-GFP-actin载体呈阳性，后者在光激活前通常在GFP通道中不可见。为提高mCherry阳性细胞同时表达PA-GFP的可能性，建议采用mCherry : PA-GFP-actin为1:2的转染比例。按照本方案操作，超过90%表达mCherry的细胞均显示出PA-GFP-actin的成功激活。
  2. 将B16-F1细胞接种至层粘连蛋白包被的盖玻片上（步骤2.10）。
  3. 组装成像室（第3节）。
  4. 在开始光激活实验之前，如有需要，对所选物镜进行激光校准（步骤 5.4–5.6）。
  5. 将GFP/488 nm图像采集的曝光时间设为500 ms，时间间隔设为1,500 ms（根据实验设计而定）。
  6. 在“采集 | 波长”菜单中勾选“波长序列”选项，并选择所需的通道数量，以调整软件设置来获取双通道或三通道延时成像视频。建议使用相差和GFP通道采集延时成像视频。
    1. 可选择性地同时采集 mCherry 荧光通道；然而，过多的光照可能对细胞造成光损伤。可通过添加氧气清除剂（如 Oxyrase）来避免这一问题。17，尽管有效治疗需要密封细胞室。
  7. 在mCherry通道中找到转染的细胞。
  8. 在触发激光之前，启动图像/时间序列采集，并在观察显示器的同时，于相差通道上手动绘制需光激活的区域。
  9. 在开始图像采集后至少3–4帧，通过手动触发405 nm激光器（在“Panel | Intensity”菜单中将激光强度设置为5–15 mW）启动光激活。

7. FRAP 结果的数据分析与展示

注意：本方法用于研究在动态肌动蛋白组装位点富集的蛋白质的周转情况，此处以VASP为例，该蛋白与黏附位点及突出的片状伪足尖端相关联。我们正在分析VASP在片状伪足尖端的周转，但相同的分析原理也可适用于研究VASP或其他任何蛋白质在其他亚细胞区域的周转情况。

  1. 在 Metamorph 软件中打开由 Visiview 生成的时间序列电影文件。本文使用的是 Metamorph v7.8.10。
  2. 在 Metamorph 中通过手动勾画相应区域来获取光漂白区域的强度值。在片状伪足的末端绘制一个覆盖整个或部分光漂白区域的形状，并根据需要在后续帧中手动调整其位置（即， 如果边缘突出），以追踪尖端位移过程中各组分片状伪足强度的变化。
  3. 为校正背景和光漂白获取，需分析细胞内和细胞外区域。参见 图2a 用于测量强度的代表性区域。
  4. 当选定一个感兴趣区域（ROI）后，通过 Metamorph 软件中的“测量 | 区域测量”菜单提取其强度值。在“配置”菜单中，确保已选中“经过时间”和“平均强度”选项。点击“打开日志”，并选择“动态数据交换”。点击“确定”以打开一个 Excel 表格，然后再次点击“打开日志”按钮，将 Metamorph 的数值粘贴至 Excel 中。
    注意：这些数值用于生成荧光恢复曲线。
  5. 为生成光漂白区域（以光漂白前区域强度归一化）前缘伪足尖端的荧光恢复曲线，请应用以下公式：
    静态平衡公式；科学分析中使用的恢复方程；数学模型   公式 1
    其中：FRAPTn 是光漂白后每个感兴趣帧的光漂白区域强度；OutTn 是光漂白后每个感兴趣帧中细胞外区域的强度（背景）；InsTn 是光漂白后每个感兴趣帧的两个平均内部区域强度（用于随时间归一化采集过程中的光漂白）；FRAPT-1 是光漂白前光漂白区域的强度；OutT-1 是光漂白前在细胞外区域测得的强度（背景）；以及 InsT-1 是每个感兴趣帧在光漂白前两个平均内部区域强度的均值。
  6. 对于每个感兴趣的时间段，使用 公式 1 以获得包含所有待分析时间帧的荧光恢复曲线。实验时长严格取决于所研究的蛋白质。若未知，应先进行预实验以获取该蛋白质的周转率。
  7. 为计算恢复半衰期，将荧光恢复曲线的数值及其对应的时间（单位为秒）粘贴至 SigmaPlot（v.12）中，使用“动态拟合向导 | 指数上升至最大值”工具进行曲线拟合。根据最佳拟合效果，选择单指数（单相，3 参数）或双指数（双相，4 参数）函数。
  8. 使用以下单指数函数公式：
    指数增长函数公式 \(f(x)=y0+a(1-\exp(-bx))\) 的数学表达式。   公式 2
  9. 使用以下双指数函数公式：
    非线性拟合方程 f(x)=a(1-exp(-bx))+c(1-exp(-dx))；数学公式   公式 3
  10. 粘贴从 Sigma Plot 获得的参数“b”和“d”公式 2 或 公式 3) 导入 Excel 以计算恢复半衰期。应用以下公式：
    半衰期方程，t<sub>1/2</sub>=-(1/b)ln(0.5)，衰变公式，用于教学。   方程 4
    或
    指数衰减公式，t1/2 = -1/d ln(0.5)，用于图中半衰期的计算。   公式 5
  11. 当单指数函数能够实现准确的曲线拟合时，仅应用该方法 方程 4.
  12. 当单指数函数无法获得良好的曲线拟合时，应采用双指数公式，同时求解两个 方程 4 和 公式 5将得到的两个半恢复时间分别视为代表两种不同的蛋白质组分：快速交换组分和慢速交换组分。

8. 通过荧光漂白后恢复技术（FRAP）测定片状伪足肌动蛋白聚合速率

  1. 为测定片状伪足中肌动蛋白的聚合速率，将EGFP标记的β-actin转染至B16-F1细胞，并使用1.5秒时间间隔和500毫秒GFP曝光对片状伪足区域进行光漂白（步骤5.9）。
  2. 在 Metamorph 中打开从 Visiview 获取的时间序列图像，并校准像素/µm 根据“测量|校准距离”工具所用物镜的比率。
  3. 播放延时录像，当片状伪足的荧光恢复以线条形式向后流动至板状伪足区域，并到达板状伪足且无法再追踪到进一步的向后流动时，停止播放。
  4. 测量距离 µm lamellipodium 尖端与荧光恢复区域后缘之间的距离。该距离对应于向后流动距离与前伸距离的总和。
  5. 或者，为了区分前伸运动与逆行流动，在光漂白前一帧用一条线标记伪足尖端。将该线作为参考点，在后续各帧中对应于光漂白时刻伪足尖端的原始位置；该参考点可用于测量前伸距离和逆行流动。
  6. 记录光漂白后荧光恢复所需的时间（单位：秒）。该时间可通过帧率手动计算，或使用 Metamorph 软件中的“测量 | 区域测量”工具进行可视化分析。
  7. 利用以下公式计算肌动蛋白聚合速率（公式中的部分参数基于步骤 8.4 和 8.6 中 Metamorph 的测量结果）：
    肌动蛋白聚合速率公式：逆向流动 + 伪足突出/时间计算。   公式 6
    其中肌动蛋白聚合速率的单位为 µm/min，逆行流距离处于 µm，片状伪足突出距离处于 µm，时间单位为秒。

9. 光激活后蛋白质扩散与移动性的分析

注意：此处介绍的方法是通过光激活与光活化绿色荧光蛋白（PA-GFP）融合的肌动蛋白，来分析肌动蛋白单体的移动性，如通过可视化和定量蛋白质在细胞质中的扩散所示。

  1. 为测量光激活肌动蛋白从细胞质区域的扩散以及在片状伪足区域内的聚集情况，使用 Metamorph 确定以下区域随时间变化的荧光强度（示意图见 图3a）：细胞质光激活区域（PA）；板状伪足区域，预期光激活蛋白会随时间在此区域积累（Lam）；细胞外用于背景荧光归一化的区域（OUT）。
  2. 在确定细胞质中肌动蛋白的移动性时，应测量不同的细胞质区域（参见 图3a，区域R1-R5）。需要注意的是，由于激活后焦点处乃至整个细胞的荧光均会增强，光漂白成像的获取无法以与FRAP类似的方式确定。
  3. 按照步骤7.4所述，将Metamorph中所有区域的强度值转移至Excel电子表格中。
  4. 为检测光激活肌动蛋白从光激活胞质区域的移出速率，或其在片状伪足区域的掺入速率（两者均以光激活后0时刻胞质光激活区域的荧光强度百分比表示），请根据步骤9.3中的数据绘制荧光强度曲线，并应用以下公式：
    扩散方程，胞质区域，涉及随时间变化的浓度，科学公式。   方程 7
    增加片状伪足区域公式；用于生物过程分析的数学方程   方程 8
    其中：PATn 是光激活后每个感兴趣帧中细胞质光激活区域的强度；LAMTn 是每次光激活后各目标帧中片状伪足区域的强度；OUTTn 是光激活后每个感兴趣帧中细胞外区域（背景）的强度；PAT-1 是光激活前细胞质中光激活区域的强度；LAMT-1 是光激活前片状伪足区域的强度；OUTT-1 是光激活前在细胞外区域（背景）测得的强度；PAT0 是时间0时细胞质中光激活区域的强度（即， 光激活后的第一帧；以及 OUTT0 是细胞外区域（背景）在时间0时的强度（即， 光激活后的第一帧
  5. 可选地，为更清晰地展示数据，可通过从后续每一帧中减去光激活后第一帧的强度，将强度曲线归一化至0。
    注意：以下分析方法（步骤 9.6–9.8）还可用于计算光激活肌动蛋白在细胞质中的弥散情况。
  6. 测量细胞质区域的强度，这些区域依次位于激活区域的远端。
  7. 将这些区域的强度表示为光激活区域在时间0时强度的百分比，应用 方程 8，其中伪足区域的强度被替换为每个胞质 ROI 的强度。区域的大小和数量可根据细胞大小以及待测量的扩散距离而变化。
  8. 为了获得光激活蛋白进入每个细胞质区域速率的可量化数值，将各区域荧光强度增加曲线的时间和数值粘贴至 SigmaPlot（类似于第7节中的FRAP分析），使用 公式 2 和 公式 4 以计算荧光强度达到平台期的半衰期。比较 t1/2 不同实验组之间的数值。

结果

图1g，h 显示NIH3T3成纤维细胞在显微注射Rac1前及注射后10分钟的相差图像。Rac1是一种小分子Rho家族GTP酶，可通过与WAVE复合物相互作用诱导片状伪足的形成。细胞首先在显微注射前进行观察（图1g），以确认其活力和形态， 例如， 缺乏片状伪足。显微注射后10分钟，细胞形态已明显改变，此现象符合该处理的预期结果，表明注射成功。图1h).

为简便起见并提高清晰度，我们接下来提供未进行额外显微注射的细胞中荧光漂白恢复（FRAP）和光激活分析的示例结果。

EGFP标记的VASP在片状伪足尖端的周转分析如图2a-f所示。需注意，VASP除了定位于片状伪足尖端外，还靶向新生黏着斑和局灶性黏着部位，即细胞内部的小而细长的点状结构18,19。通过追踪ROI在光漂白前、中、后随片状伪足向前延伸的轮廓，对具有明显VASP聚集的片状伪足区域的荧光强度在每一时间帧进行漂白和测量。由于漂白的EGFP-VASP蛋白在此位点被未漂白的分子所替换，因此可观察到荧光逐渐恢复（图2b）。以漂白前强度（表示为1）归一化后得到的FRAP恢复曲线如图2c所示。光漂白效率可能有所不同，在本示例中约为漂白前值的20%，该值由t0时刻（光漂白后的第一帧）的数值确定。荧光增加在本示例中达到一个平台期，约为漂白前荧光强度的80%。在实验时间范围内保持静态的结构（如局灶性黏着斑）中，漂白前荧光强度与恢复后达到的平台期荧光强度之间的差值定义为不可移动组分（IF，图2c, e中的红色箭头），而从漂白时刻到完全恢复之间恢复的荧光量则定义为可移动组分（图2c, e中的绿色双头箭头）。需要注意的是，在本研究分析的动态变化结构（如片状伪足尖端）中，IF的程度可能不仅代表不可移动的分子，也可能源于前伸速度的降低，因为已知EGFP-VASP的荧光强度依赖于这一参数18。为计算恢复半衰期，使用SigmaPlot生成拟合曲线（图2d）。在此情况下，由求解公式2得到的“b”参数值为0.0754，将其代入对数函数（公式4）后，估算出恢复半衰期为9.19 s（图2d最右侧面板），与先前报道的平均值相比，该细胞的恢复速度相对较快5。必须指出的是，在同一细胞群体中，恢复半衰期有时在不同细胞间可能存在显著差异。因此，为获得具有代表性的结果，建议至少从15–20个细胞中计算该参数的平均值。为说明变异程度，我们生成了每个时间点来自15个细胞的EGFP-VASP恢复值的算术平均值（图2e），并以类似方式创建和展示了平均拟合曲线（图2f）。

片状伪足肌动蛋白网络的聚合速率由前向网络突出和向后流动的速率之和构成。可通过将细胞（本例为B16-F1细胞）转染表达EGFP标记的β-actin，并对突出的片状伪足区域进行光漂白，利用荧光漂白后恢复技术（FRAP）测量肌动蛋白的聚合速率（图2g）。在分析片状伪足肌动蛋白网络聚合时，需随时间评估EGFP标记的β-actin在光漂白后的荧光恢复情况。由于肌动蛋白单体在片状伪足肌动蛋白丝的钝端持续聚合（所有钝端均朝向前缘20），该网络不断向后方转运并同时向前推进，其速率可通过光漂白后荧光的极性恢复过程简便获得。当漂白区域到达片状伪足后部与片层之间的过渡区时，片状伪足的荧光恢复即告完成；该过渡区的特征是含有密度较低、排列更水平的纤维束，其周转速率远慢于片状伪足区域。如图2g所示，荧光恢复可表现为一条与边缘平行并向片层方向向后移动的线，由此可测量突出距离和向后流动距离（分别在图2g最右侧图中以橙色和红色双头箭头单独表示）。

我们还应用光激活技术处理转染了PA-GFP-肌动蛋白的B16-F1细胞，以追踪肌动蛋白单体在细胞质中的移动性及其掺入伸出的片状伪足的速率。如图3a, b所示，使用405 nm激光照射细胞质区域进行光激活，同时每1.5秒在GFP通道采集图像，以观察GFP标记的光激活肌动蛋白的分布情况。在图3b中可见，光激活的GFP-肌动蛋白从细胞质区域向外扩散。光激活细胞质区域内荧光强度下降的速率以t0时刻（光激活后的第一帧）初始强度的百分比表示（图3c）。光激活的肌动蛋白也会掺入片状伪足的尖端，在此处新的肌动蛋白单体在突出过程中被添加到延长的肌动蛋白丝的正端。为了估算片状伪足的掺入速率，我们测量了一个约5 µm宽、1 µm高的二维轮廓/区域随时间变化的荧光强度；随着片状伪足的突出，该区域持续重新定位至其尖端。肌动蛋白的掺入量以t0时刻光激活细胞质区域的荧光强度百分比表示（图3d）。随着肌动蛋白丝的延长，新的肌动蛋白单体被掺入到片状伪足前端。其中一部分肌动蛋白单体随机来源于细胞质池，即单体被光激活的区域。这导致在光激活后的前20秒内，片状伪足中的荧光迅速增加。当新的单体不断添加到片状伪足前端时，先前掺入的肌动蛋白单体则通过逆行流随纤维向内侧区域移动。随着时间推移，感兴趣区域（ROI）完全被荧光单体填充，荧光达到平台期（图3d）。随后，当光激活的单体扩散至整个细胞后，未被光激活的肌动蛋白单体越来越多地重新加入片状伪足前端，此时观察到荧光逐渐下降。这种荧光下降将最终达到一个新的平台期，即当整个细胞内光激活与非光激活单体之间达到平衡时（数据未显示）。

通过测量远离光激活区域的等尺寸区域内的荧光强度，可获得肌动蛋白单体在整个细胞质中的迁移情况（如图3a中以不同颜色标记的R1-R5区域所示）。如图3e所示，随着光激活的肌动蛋白单体逐渐被未激活（即非荧光）的单体稀释，各区域的荧光强度自细胞质光激活区域向外逐渐降低。此外，荧光峰值出现的时间也更晚：测量区域距离光激活区域越远，肌动蛋白单体扩散至该区域所需的时间就越长。通过量化达到荧光平台期所需时间的半衰期，可获得每个区域肌动蛋白单体渗透程度的代表性数值。区域距离越远，光激活的肌动蛋白扩散进入所需时间越长，因此达到荧光平台期所需时间也更长，最终导致更高的t1/2值（图3e）。

显微注射装置与过程；将物质注入细胞；显微镜成像结果。
图 1：成像腔室组装与显微注射操作流程。（a）成像腔室的组成部件。（b）将硅脂小心涂抹在塑料封片环的开口周围。（c）将盖玻片细胞面朝上放置于成像腔室开口的中央位置。（d）将塑料封片环置于盖玻片上方，并拧紧侧边夹具，以形成牢固的密封。（e）用移液器将显微镜成像用培养基加入腔室槽中。（f）将成像腔室放置于显微镜载物台上，温度传感器和电极连接至预设为 37 °C 的加热装置，细胞需适应环境至少 30 分钟后方可开始显微观察。在此示例中，显微镜载物台还配备了显微操作仪用于执行显微注射，显微注射针浸入覆盖在成像腔室内细胞层表面的培养基中。（g）通过相差显微镜在显微注射前观察 NIH3T3 成纤维细胞。细胞核周区域的红色十字标记了即将进行显微注射的位置，该位置靠近体积较大的细胞核，属于胞质较丰富的区域。（h）显微注射 Rac1 后 10 分钟，细胞在整个周边显著形成片状伪足（绿色箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

FRAP分析肌动蛋白聚合速率；荧光恢复曲线；显微图像；计算过程。
图2：FRAP可用于测定蛋白质周转速率或片状伪足中肌动蛋白的聚合速率。（a）表达EGFP-VASP的B16-F1细胞在片状伪足区域进行光漂白前的代表性示例，如图所示。不同颜色的轮廓/形状用于标记随时间进行荧光强度测量的区域。注意用感叹号标记的红色轮廓，其表示位于含有多个囊泡和细胞表面皱褶区域中的胞质区域。应避免将此类动态区域选作荧光参考区域，因为这些区域的荧光信号在短期内波动剧烈，可能导致结果不准确。（b）表达EGFP-VASP的细胞在光漂白前后片状伪足区域的变化。紫色标记区域内光漂白后荧光信号的恢复随时间变化情况被可视化显示。箭头指示微突起的尖端，该处VASP富集，可能是由于此处聚合的肌动蛋白丝密度较高所致19。（c）根据b图中光漂白片状伪足区域（紫色轮廓）的荧光强度定量分析所得的FRAP恢复曲线示例。右侧的红色和绿色线条分别表示不可移动组分和可移动组分。（d）c图中FRAP恢复曲线的拟合结果（左图），以及用于计算恢复半衰期的计算方法示例（右图）。（e）由15个细胞的荧光恢复曲线平均后得到的FRAP恢复曲线示例，误差条表示样本群体内的变异性程度。（f）由15个细胞的FRAP恢复曲线拟合结果平均后得到的曲线拟合（左图），以及用于计算恢复半衰期的计算方法示例（右图）。（g）表达EGFP标记的β-肌动蛋白的B16-F1细胞在片状伪足区域光漂白前后，片状伪足突出过程的时间序列图像，随后显示片状伪足中荧光信号随时间恢复的情况。最右侧图像中标注了测得的突出距离（橙色）和回撤距离（红色）。图像下方的计算说明展示了如何利用突出距离与回撤距离之和推导出片状伪足肌动蛋白网络的聚合速率。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光光激活、显微镜设置的静态平衡示意图。光谱拟合数据。
图3：在整个细胞中对PA-GFP-肌动蛋白进行光激活以追踪单体。（a）表达PA-GFP-肌动蛋白的B16-F1细胞在细胞质区域（由红色圆圈指示，PA）触发光激活前的代表性示例。不同颜色的轮廓标记用于指示随时间进行荧光强度测量所考虑的区域。（b）光激活后PA-GFP-肌动蛋白随时间分布的示意图。注意，在光激活的细胞质区域（红圈）中，由于光激活的肌动蛋白从该区域扩散出去，荧光逐渐减弱。由于扩散至前端并组装成网络，光激活的肌动蛋白单体在片状伪足（青色区域）以及整个细胞质（不同颜色编码的区域）中以距离和时间依赖的方式逐渐增强。（c）光激活细胞质区域（b中的红色轮廓）内荧光随时间的代表性衰减情况。（d）片状伪足区域（b中的青色轮廓）中荧光强度随时间的变化。（e）代表性的细胞质区域（在b中以颜色编码）中荧光强度随时间变化的曲线，这些区域与光激活区域的距离不同。注意，达到荧光平台期的半衰期（如右侧图例所示）随着给定区域与光激活区域之间距离的增加而延长，这可能与肌动蛋白单体扩散到相应区域所需时间的增加相关。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文讨论了本研究所述技术中的关键步骤，以及如何针对不同实验条件的应用对这些步骤进行优化。

显微注射是一种可用于监测细胞中引入外源蛋白、抑制剂或药物后瞬时效应的方法。该方法在确定难以转染的细胞类型中蛋白质功能，或在不希望实现长期表达的情况下尤为有利。需要注意的是，某些细胞类型的存活率会因其接种的细胞外基质不同而有所差异。大多数内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞样细胞类型，即使体积较小（如鱼类角质细胞，参见 Dang 等21 安德森和克罗斯22) 可成功进行显微注射。然而也存在例外情况，例如接种在层粘连蛋白（laminin）上的 B16-F1 细胞，虽然是细胞迁移研究的优良模型系统，但由于未知原因，无法在此类基质上进行注射。对于 NIH3T3 成纤维细胞，我们通常在纤连蛋白（fibronectin）基质上进行注射，且在此类成纤维细胞中同样可良好实施其他光操控技术，如荧光漂白恢复（FRAP）（包括光激活，本文中以 B16-F1 细胞为例展示）（参见 例如， Köstler 等3）。还必须考虑到，不同的蛋白质根据其功能特性和实验目的，引起变化所需的时间可能不同，从数秒到数小时不等。该技术的一个优点是，相较于整体水平，可在单细胞水平上更精确地控制外源试剂的剂量/浓度 例如，使用质粒转染时。此外，对蛋白质进行荧光标记并非确保其存在于细胞内的必要条件，这在需要同时进行其他荧光标记蛋白质的多通道可视化时可提高灵活性。显微注射在分析特定蛋白质或蛋白质混合物对细胞形态或细胞骨架动态变化的即时效应时尤为有用（例如， Dang 等21 以Arp2/3复合物抑制剂Arpin对细胞迁移的即时效应为例）。该技术的一个缺点是其侵入性，可能造成细胞损伤或影响细胞形态。因此，在进行显微注射时，一个重要考虑因素是监测细胞活力。本文所介绍的方法依赖于手动操作。在已验证与成功注射相容的条件下（如生长于纤连蛋白基质上的成纤维细胞），此处描述的手动注射方案可实现接近100%的成功率；这对于将该方法与复杂的、耗时的后续实验（包括视频显微镜观察或荧光漂白恢复技术（FRAP））相结合尤为关键，相关应用此前已有发表3这并不排除偶尔个别细胞可能受到显微注射事件的影响，可通过细胞核和细胞质对比度的突然变化，继而出现细胞边缘回缩的现象安全识别。此类罕见的实验情况将被排除，不纳入后续分析。

然而，半自动方法也常被采用，例如使用快速（<300 毫秒）的机械控制针头下降与注射压力升高同步进行，因此在每次注射前只需将针头定位在目标细胞上方即可。半自动注射的成功率从定义上低于上述手动方法，因为它优先考虑速度，随后对成功经受该处理的多个细胞进行分析；因此其结果不依赖于单个细胞注射的成功与否。因此，与单细胞分析不同，半自动注射更适用于分析数百个细胞的注射效应， 例如， 通过低倍视频显微镜观察或细胞固定与染色后进行检测。无论采用何种具体方法，显微注射本身并不构成终点检测，但可与多种技术联用，包括荧光漂白恢复（FRAP）或光激活3.

在利用FRAP测定蛋白质周转率时，必须根据显微镜配置和成像条件（放大倍数、物镜、 等等。，以及用于光漂白的细胞类型、结构和荧光蛋白）。需要注意的是，在最佳激光功率下，应实现高效的漂白效果，同时将光损伤降至最低，以避免分析结构发生收缩或完全回缩。例如， 片状伪足或丝状伪足）甚至造成细胞水平的损伤。理想情况下，漂白效率应达到至少70–80%，尽管在蛋白质周转极快的情况下，完全漂白可能受限，此时漂白效率高于50%也可接受。针对特定结构和荧光染料，最佳漂白功率应通过实验确定，从低激光功率开始，逐步增加。原则上，任何荧光染料均可使用接近其激发峰波长的激光进行漂白（例如常用绿色染料FITC或EGFP的激发波长为488 nm）。然而，波长较短的激光（如近紫外激光）可提供更高功率，因此也可用于常用荧光染料的高效漂白。我们常规使用405 nm二极管激光器（120 mW）对EGFP和红色荧光染料（如mCherry）进行漂白，尽管后者漂白效率略低（数据未显示）。由于405 nm二极管激光器还可用于PA-GFP的光激活（见下文），因此该系统具有最大的灵活性。

对于此处光漂白的 B16-F1 细胞结构和荧光蛋白，应用的 405 nm 激光功率范围为 65–100 mW。在分析光漂白区域时，需考虑在分析时间段内该结构是否保持其原始形态。例如，在分析板状伪足尖端蛋白质周转时，应注意板状伪足的曲率是否随时间发生显著变化，因为曲率的变化可能导致分析结果不准确，如果所分析的区域/轮廓未能在每一帧测量中完全覆盖该结构的全部范围。此外，应注意嵌入板状伪足的束状结构（如微棘）可能会引起荧光强度的偏差。如图 2b（9 秒时间点的白色箭头所示）所示，一个类似微棘的结构位于测量的光漂白区域旁边，但在整个测量过程中始终处于该区域之外，因此不会造成任何误差。在分析蛋白质周转时，选择分析区域的位置和大小需重点考虑：其随时间变化的荧光信号不应受到细胞形态变化或其他难以避免的成像过程中光漂白因素的显著影响。例如，在分析过程中，对所分析结构有显著定量贡献的结构不应移出测量区域；此外，与分析无关的荧光实体（如吸引该蛋白的囊泡结构）也不应在分析期间进入感兴趣区域。在测定板状伪足肌动蛋白聚合速率时，应注意避免分析发生回缩或起皱（即向上折叠）的板状伪足，因为这将严重影响结果的准确性。此外，板状伪足区域的回缩可能表现为快速的向后移位，从而可能导致高估板状伪足肌动蛋白的聚合速率。另一个需考虑的因素是细胞内归一化区域（作为校正 成像过程中光漂白的参考位置）与实际光漂白位置之间的距离，该距离应足够大，以避免受到光漂白区域的直接影响。

在设置PA-GFP标记构建体光激活的最佳条件时，应注意避免在光激活过程中发生立即漂白。在我们的研究中，使用比通常用于EGFP漂白低5至10倍的激光功率可获得最佳效果。对于光激活分子的图像采集，应根据待光激活和分析的区域与结构的大小，以及光激活蛋白向其他亚细胞位置可能发生的移动性，优化曝光时间及帧间时间间隔。与所有类型的荧光成像一样，维持细胞活力对于获得具有生理相关性的结果至关重要。

原则上，荧光蛋白（如 mEos 或 Dronpa 变体）的绿色到红色光转化12 是追踪亚细胞结构（如片状伪足）动态变化和周转的同样有效的方法（参见 例如， 伯内特 等23）。与PA-GFP相比，后一种方法的优势在于能够利用两种不同的颜色在光转化前后同时追踪蛋白质动态，而无需共表达额外的红色荧光蛋白。然而，在我们的初步实验中，PA-GFP光激活后所产生的荧光信号强度及对比度变化均优于光转化探针，这可能归因于绿色荧光探针相较于红色荧光探针具有更优越的光谱特性（数据未显示）。无论如何，迄今为止关于板状伪足或痘苗病毒诱导的肌动蛋白尾部等细胞边缘突起中肌动蛋白丝周转的详细研究，仅见使用PA-GFP衍生物进行报道5,6,24.

在考虑光激活后应分析的细胞区域时，需结合此处所示的具体实例（即细胞质中光激活后肌动蛋白单体在细胞边缘的整合）来讨论若干因素，但这些因素显然可推广至其他类似的科学问题。首先，在测量细胞质中光激活蛋白在片状伪足处的整合速率时（例如在不同实验条件下，如Dimchev et al.6 所示），各实验组之间细胞质区域的大小及其与片状伪足边缘的距离应具有可比性。此外需注意，当对细胞质区域进行光激活时，靠近细胞核的位置细胞厚度更大。如果待激活蛋白在细胞质中呈均匀分布，则激活较厚的细胞区域可能导致更多的蛋白被激活。最后，待激活蛋白的表达水平在单个细胞之间可能存在显著差异。鉴于上述各种变异因素，在比较细胞其他部位中细胞质激活蛋白的整合水平时，必须相对于特定区域光激活后获得的总荧光强度进行归一化处理。

我们已阐述了显微注射如何作为一种研究工具，用于探究蛋白质对细胞形态的影响，并通过在NIH3T3成纤维细胞中显微注射小GTP酶Rac1后显著诱导片状伪足结构的形成，对此进行了实例展示。此前，我们已应用该技术，在显微注射了Scar/WAVE蛋白C端WCA结构域的细胞中干扰Arp2/3复合物的功能3可通过其他检测方法分析显微注射细胞中的各种参数，例如荧光漂白恢复（FRAP）或光激活。我们已阐述如何利用FRAP和光激活技术研究肌动蛋白单体的亚细胞动态行为与移动性。本课题组此前已应用过FRAP技术。5 研究定位于片状伪足的蛋白质（如 VASP、Abi、cortactin、cofilin 和帽蛋白）的周转，或阐明在有无 Rac 信号存在条件下黏着斑组分的周转4此外，通过光漂白EGFP标记的β-actin可实现对肌动蛋白聚合速率的测量。5，但存在其他替代方法。可通过活细胞成像兼容的探针标记细胞肌动蛋白纤维，追踪荧光分布的不均一性，例如使用Lifeact25，也可被采用6,26其优势在于可避免β-actin的过表达，后者可能增强细胞边缘突起和迁移，从而造成潜在干扰 根据具体的检测方法或实验问题（参见 例如， Kage 等26；Peckham 等27）。然而，Lifeact探针的一个明显缺点是其与肌动蛋白丝结合的快速结合/解离动力学，导致在细胞中标记的肌动蛋白丝结构在成像过程中易发生光漂白 仅提供探针的周转信息，而不提供其结合的肌动蛋白丝的周转信息25先前采用的荧光不均匀性追踪方法6,26 确实提供了一种实用的折中方案，与广泛使用的荧光斑点追踪技术类似，后者用于整合到丝状细胞骨架结构中的荧光标记（参见 例如， 鲑鱼与沃特曼28），但其使用可能不如EGFP标记的F-actin结构的荧光漂白恢复（FRAP）技术那样直接和精确。我们已应用光激活技术来估算单体肌动蛋白掺入伸出的片状伪足的速率，以及其在细胞质中的整体移动性，这些研究是在实验调控的细胞质F-actin水平背景下进行的6该技术在检测来自较大区域（如胞质溶胶区域）的蛋白质的迁移性和分布时具有实用价值。然而，在检测来自较小光激活结构的蛋白质分布时， 例如， 由于被激活的荧光分子数量较少、信号微弱，因此检测生长锥可能具有挑战性。除上述荧光光激活或光转换技术外，潜在的替代方法包括逆向荧光漂白恢复技术（inverse FRAP），该方法通过光漂白整个细胞中除感兴趣区域（ROI）以外的部分，随后追踪荧光分子从该区域向外的移动情况。该技术无需过表达光可激活蛋白，但始终需要暴露于异常高强度的激光功率下，可能引起光损伤等非预期的副作用。

显然，光激活和荧光漂白后恢复技术无法区分蛋白质是以单体、二聚体还是甚至小寡聚体形式移动，也无法判断其是否与额外的结合伴侣共同移动。此类信息可通过荧光相关光谱技术29或 alternatively，FLIM-FRET30获得。尽管如此，FRAP 和光激活仍是直接评估细胞中局部和全局蛋白质动态的简便方法，且不受所研究蛋白质的种类、亚细胞定位或细胞类型的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢德国研究基金会（DFG）提供的资金支持（项目编号 RO2414/5-1，授予 KR）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B16-F1 小鼠皮肤黑色素瘤细胞 美国模式培养物集存库，马纳萨斯，弗吉尼亚州CRL-6323
NIH-3T3 细胞美国模式培养物集存库，马纳萨斯，弗吉尼亚州CRL-1658
DMEM 4.5g/L 葡萄糖 Life Technologies，赛默飞世尔科技，德国41965-039
Ham’s F-12 培养基Sigma-AldrichN8641
胎牛血清 （FCS）PAA 实验室，林茨，奥地利A15-102
胎牛血清（FBS）Sigma-Aldrich，德国F7524批号 054M3396
MEM 非必需氨基酸 Gibco，赛默飞世尔科技，德国11140035
L-谷氨酰胺 200 mM（100 倍）Life Technologies25030-024
青霉素-链霉素（5000 U/mL）Life Technologies15070063
丙酮酸钠（100 mM）Gibco，赛默飞世尔科技，德国11360-039
层粘连蛋白Sigma-AldrichL-2020
层粘连蛋白包被缓冲液 自配：50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl
人血浆来源纤连蛋白 罗氏诊断，曼海姆，德国11 051 407 001
JetpeiPolyplus 转染，伊尔基希，法国101-10N
JetPei 缓冲液Polyplus 转染，伊尔基希，法国702-50150 mM NaCl
PA-GFP-肌动蛋白质粒 DNA 见 Koestler 等人，2008
pEGFP-肌动蛋白质粒 DNAClontech，山景城，加利福尼亚州，美国
显微注射用 Rac1 蛋白以 GST 标签形式纯化，并在注射前切除 GST 标签
显微注射缓冲液自配：100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl2，1 mM DTT
葡聚糖，德克萨斯红，70,000 MW，赖氨酸可固定Molecular Probes，赛默飞世尔科技，德国D1864
圆形显微镜盖玻片 15 mm，1 号 Karl Hecht，艾森特，松德海姆，德国1001/15
Eppendorf Femtotips 微量加样尖端Eppendorf，汉堡，德国5242 956 003
Eppendorf Femtotip 显微注射毛细管尖端Eppendorf，汉堡，德国930000035
硅脂 ACC Silicones，布里奇沃特，英格兰SGM494
铝制开放式钻石浴成像室Warner InstrumentsRC-26
自动温度控制器Warner InstrumentsTC-324B
显微镜：Axio Observer 卡尔·蔡司，耶拿，德国
CoolSnap-HQ2 相机 Photometrics，图森，亚利桑那州
Lambda DG4 光源 Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州
激光光源 Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet 显微注射仪 Eppendorf，汉堡，德国内置压缩机供压
Nikon Narishige 显微操作系统Nikon Instruments，日本
Visiview 软件 v2.1.4Visitron Systems，普赫海姆，德国
Metamorph 软件 v7.8.10Molecular Devices，森尼韦尔，加利福尼亚州
Sigma Plot v.12Systat Software Inc.

参考文献

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